JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في C. ايليجانس نموذج السمية المثيرة، يستخدم هذا البروتوكول التصوير في الجسم الحي لتحليل تنظيم التنكس العصبي النخر ، وتأثير الجينات التي تشفر الوسطاء المرشحين ، وتورط الميتوكوندريا. يستخدم تفكك الخلايا وفرزها للحصول على الخلايا العصبية المعرضة للخطر على وجه التحديد لتحليل النسخ الخاص بالخلية للتنكس العصبي وآليات الحماية العصبية.

Abstract

النخر المثير هو شكل رائد من أشكال التنكس العصبي. يتم تشغيل عملية النخر المنظم هذه عن طريق التراكم المشبكي للناقل العصبي الغلوتامات ، والتحفيز المفرط لمستقبلاته بعد المشبكي. ومع ذلك ، لا توجد معلومات عن الأحداث الجزيئية اللاحقة التي تبلغ ذروتها في مورفولوجيا تورم الخلايا العصبية المميزة لهذا النوع من التنكس العصبي. لا تزال الجوانب الأخرى ، مثل التغييرات في مقصورات فرعية محددة ، أو أساس الضعف الخلوي التفاضلي لأنواع فرعية عصبية متميزة ، غير مستكشفة. علاوة على ذلك ، فإن مجموعة من العوامل التي تلعب دورا في الدراسات التي تستخدم المستحضرات في المختبر أو خارج الجسم الحي قد تعدل وتشوه التقدم الطبيعي لهذا النوع من التنكس العصبي. لذلك من المهم دراسة النخر السام المثير في الحية من خلال مراقبة آثار التدخلات التي تنظم مدى النخر العصبي في النظام النموذجي القابل وراثيا والشفاف للديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. يصف هذا البروتوكول طرق دراسة النخر السام للإثارة في الخلايا العصبية C. ايليجانس ، والجمع بين التحليل البصري والجيني والجزيئي. للحث على حالات سامة للإثارة في C. ايليجانس، يتم الجمع بين الضربة القاضية لجين ناقل الغلوتامات (glt-3) مع خلفية وراثية حساسة للخلايا العصبية (nuls5 [Pglr-1:: GαS (Q227L)]) لإنتاج فرط تحفيز مستقبلات الغلوتامات والتنكس العصبي. تباين التداخل التفاضلي Nomarski (DIC) ، والفلورسنت ، والفحص المجهري متحد البؤر في الحية هي طرق تستخدم لتحديد التنكس العصبي ، واتباع التوطين دون الخلوي للبروتينات المسماة بالفلورسنت ، وتحديد مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المتدهورة. يستخدم فرز الخلايا المنشطة بالفلورة العصبية (FACS) لفرز الخلايا العصبية المعرضة للخطر بشكل واضح لتحليل النسخ الخاص بالتنكس العصبي من نوع الخلية. مزيج من طرق التصوير الحي و FACS بالإضافة إلى فوائد C. ايليجانس يسمح الكائن الحي النموذجي للباحثين بالاستفادة من هذا النظام للحصول على بيانات قابلة للتكرار بحجم عينة كبير. يمكن أن تترجم الأفكار المستمدة من هذه المقايسات إلى أهداف جديدة للتدخل العلاجي في الأمراض التنكسية العصبية.

Introduction

السمية المثيرة هي السبب الرئيسي لموت الخلايا العصبية في نقص تروية الدماغ وعامل مساهم في الأمراض التنكسية العصبيةالمتعددة 1،2،3،4،5،6،7،8،9. يؤدي اضطراب تدفق الدم المؤكسج إلى الدماغ (على سبيل المثال ، بسبب جلطة دموية) إلى خلل في ناقلات الغلوتامات ، مما يؤدي إلى تراكم الغلوتامات في المشبك. هذا الفائض من الغلوتامات ينشط بشكل مفرط مستقبلات الغلوتامات بعد التشابك (GluRs) مما يؤدي إلى تدفق مفرط (حفاز ، غير متكافئ) من Ca2+ إلى الخلايا العصبية (الشكل 1 أ). يؤدي هذا التدفق الضار إلى التنكس العصبي التدريجي بعد المشبكي الذي يتراوح شكليا وميكانيكيا من موت الخلايا المبرمج إلى النخر المنظم10،11،12. على الرغم من أنها استندت إلى تدخلات ناجحة في النماذج الحيوانية ، إلا أن التجارب السريرية المتعددة لمضادات GluR التي سعت إلى منع دخول Ca2+ وتعزيز صلاحية الخلية قد فشلت في البيئة السريرية13،14،15،16. أحد العوامل الحاسمة المحتملة في هذه الإخفاقات هو حقيقة أن العلاج (على عكس النماذج الحيوانية) في البيئة السريرية يتم إعطاؤه بعد ساعات من ظهور السكتة الدماغية ، مما يتسبب في قيام التدخل بمنع آليات الحماية العصبية المتأخرة المفعول ، بينما يفشل في مقاطعة الإشارات التنكسية في اتجاه مجرى GluRs14،16،17. لا يمكن إعطاء نهج بديل ، يعتمد على انحلال الخثر ، إلا في غضون نافذة زمنية محدودة للغاية ، مما يترك العديد من المرضى (الذين يعانون من السكتة الدماغية في المنزل مع وقت ظهور لا يمكن تحديده بشكل جيد) غير قادرين على الاستفادة منه17. تؤكد هذه النكسات على الحاجة إلى تركيز أبحاث السمية المثيرة على دراسة الأحداث التي تحدث بعد التحفيز المفرط ل GluR والتمييز بين الشلالات التنكسية اللاحقة وعمليات الحماية العصبية المتزامنة. يمكن أن يساعد هذا النهج في منع تلف الخلايا وتحديد أهداف الأدوية الفعالة التي يمكن إعطاؤها لاحقا بعد ظهور الضرر.

تتمثل إحدى طرق تحديد الأحداث اللاحقة في السمية المثيرة في دراسة آليات إشارات موت الخلية في اتجاه مجرى فرط تحفيز GluR ، مثل تلك التي تؤدي إلى انهيار الميتوكوندريا. يعد الخلل الحاد في فسيولوجيا الميتوكوندريا وديناميكياته سمة مميزة للتنكس العصبي ، كما يتضح من السمية المثيرة18،19،20. بينما تعتمد جميع الخلايا على وظيفة الميتوكوندريا وتوافرها للبقاء والنشاط والصيانة الخلوية ، تعتمد الخلايا العصبية بشكل خاص على إنتاج طاقة الميتوكوندريا لدعم نقل الإشارات وانتشارها. على وجه التحديد ، تنفق الخلايا العصبية ~ 50٪ من استهلاكها للطاقة المتعلقة بالإشارات لاستعادة إمكانات الغشاء المريح بعد تنشيط مستقبلات / قنوات ما بعدالمشبكي 21 ، مع اعتماد كبير على الأكسجين والجلوكوز. يؤدي انخفاض توافر الجلوكوز والأكسجين الذي لوحظ في السكتة الدماغية إلى تغييرات خطيرة في الميتوكوندريا ، مما يتسبب في مزيد من الانخفاض في إنتاج ATP19،22،23،24. ومع ذلك ، فإن الدراسات لتحديد تسلسل الأحداث التي تؤدي إلى انهيار الميتوكوندريا أسفرت عن نتائج مثيرة للجدل وتفتقر إلى الإجماع. يمكن أن يساعد تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا في فهم هذه الأحداث التي تؤدي إلى أمراض الميتوكوندريا لأنها مؤشر جيد على صحة الخلايا العصبية25،26،27،28،29. تمثل الميتوكوندريا الخيطية خلية عصبية سليمة ، بينما تكشف الميتوكوندريا المجزأة عن تلف عصبي كبير يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا. يمكن أن يساعد تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا في الحية في ظل ظروف وراثية مختلفة في التركيز على جينات ومسارات معينة تشارك في التنكس العصبي المعتمد على الميتوكوندريا في السمية المثيرة.

هناك طريقة أخرى لتحديد الأحداث اللاحقة التي قد تنظم مدى التنكس العصبي المثير وهو دراسة آليات الحماية العصبية النسخية التي تخفف من بعض آثار السمية المثيرة14،16. ومع ذلك ، فإن الافتقار إلى خصوصية عوامل النسخ العصبية الرئيسية واختلاف الإعدادات التجريبية يعيق نجاح الجهود المبذولة لتحديد برامج الحماية العصبية الأساسية بوضوح (خاصة في النخر المنظم).

لذلك ، واجهت كل من دراسة مسارات إشارات الموت النهائية ودراسة الحماية العصبية النسخية في السمية المثيرة صعوبات وخلافات كبيرة حول النتائج المرصودة. من المحتمل أن ينشأ الكثير من هذا الجدل من استخدام نماذج ex vivo أو في المختبر للسمية المثيرة ، والتباين الذي أدخلته خصوصية الإعدادات التجريبية المختلفة. لذلك من المفيد للغاية التركيز على تحديد الآليات الأساسية المحفوظة بشكل كبير ، ودراستها في الجسم الحي. يوفر النظام النموذجي البسيط للديدان الخيطية C. ايليجانس خيارا فعالا بشكل خاص ، نظرا للمزيج القوي من أدوات البحث القوية والمتنوعة بشكل خاص ، والحفاظ على مسارات موت الخلايا الأساسية ، والمعلومات الغنية عن بنية واتصال نظامها العصبي30،31،32،33. في الواقع ، فإن العمل الأساسي لمختبر دريسكول على التحليل الجيني للتنكس العصبي النخر في الخلايا العصبية الحسية الميكانيكية هو دليل ممتاز على قوة هذا النهج34. الأهم من ذلك بالنسبة لتحليل السمية المثيرة ، أن الحفاظ على مسارات الإشارات في الديدان الخيطية يشمل جميع المكونات الرئيسية للانتقال العصبي الغلوتاماتيرجيك35،36.

يعتمد نموذج السمية الاستثارية للديدان الخيطية على هذه الدراسات المنوية ، مما يسمح للباحث بدراسة العمليات الكيميائية الحيوية المشابهة لتلك التي تحدث في السكتة الدماغية والأمراض التنكسية العصبية الأخرى المتأثرة بالسمية العصبية المعتمدة على الغلوتامات. للحث على الظروف السامة للإثارة في C. ايليجانس يستخدم هذا النهج التجريبي سلالة السمية المثيرة التي تتكون من مزيج من الضربة القاضية لجين ناقل الغلوتامات (glt-3) والخلفية الجينية الحساسة للخلايا العصبية (nuls5 [Pglr-1:: GαS (Q227L)]) لإنتاج فرط تحفيز GluR والتنكس العصبي37. تكشف سلالة السمية المثيرة هذه عن 30 خلية عصبية محددة (تعبير عن glr-1) تكون روابط ما بعد المشبكي إلى الجلوتاماتيرجيك إلى التنكس العصبي المثير. من بين هذه الخلايا العصبية ال 30 المعرضة للخطر ، تمر الخلايا العصبية الفردية بالنخر مع تقدم خلال التطور (مع عشوائية مختلطة وتفضيل جزئي تجاه بعض الخلايا العصبيةالمحددة 38) ، بينما في نفس الوقت تتم إزالة جثث الخلايا تدريجيا. بالاقتران مع إمكانية الوصول إلى العديد من السلالات الطافرة ، يسمح هذا النهج بدراسة المسارات المتعددة التي تؤثر على التنكس العصبي والحماية العصبية. تم استخدام هذه الأساليب بالفعل لتحليل بعض شلالات إشارات الموتالنهائية 39 ومنظمات النسخ للتنكس العصبي المثير في السمية المثيرة38،40. مثل الحالات الأخرى من التنكس العصبي النخر في الدودة41 ، فإن التنكس العصبي المثير للديدان الخيطية لا ينطوي على موت الخلايا المبرمجالكلاسيكي 40.

تصف ورقة الطرق هذه النظام الأساسي للحث على التنكس العصبي النخر السام للإثارة وتحديده ومعالجته في C. ايليجانس. علاوة على ذلك ، فإنه يحدد بروتوكولين رئيسيين يستخدمان حاليا لتبسيط دراسات جوانب محددة من السمية الاستثارية للديدان الخيطية. باستخدام مراسلي الفلورسنت والتصوير المباشر في الجسم الحي ، يمكن للباحث دراسة مشاركة الميتوكوندريا وديناميكياتها في نموذج الديدان الخيطية للتنكس العصبي المثير. لتحديد تأثير عوامل النسخ الواقية من الأعصاب المحددة ، يمكن للباحث استخدام التعبير الخاص بنوع الخلية لعلامات الفلورسنت ، وتفكك إلى خلايا مفردة ، و FACS لعزل خلايا عصبية معينة معرضة لخطر النخر من السمية المثيرة. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا العصبية المعزولة من نوع الخلية لتسلسل الحمض النووي الريبي في السلالات التي تحتوي على طفرات في عوامل النسخ الرئيسية. مجتمعة ، يمكن أن تسمح هذه الأساليب للباحثين باستخلاص الأسس الجزيئية للتنكس العصبي المثير والحماية العصبية في الجسم الحي بوضوح ودقة كبيرين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. السلالات المستخدمة للتحقيق في التنكس العصبي السامة المثيرة والحماية العصبية

  1. استخدم سلالة السمية المثيرة للديدان الخيطية ZB1102 كنقطة مرجعية للتنكس العصبي القياسي السام للمثيرة.
    ملاحظة: السمية المثيرة المعتمدة على الغلوتامات في C. ايليجانس يتم إنتاجها في سلالة ZB1102 من خلال الجمع بين ضربة قاضية (ko) لناقل الغلوتامات مع جين معدل يحسس الخلايا العصبية في هذه للسمية العصبية ويتم التعبير عنها في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية بعد المشبكي إلى اتصالات الجلوتاماتيرجيك37. يشار إلى هذا المزيج الجيني باسم سلالة السمية المثيرة للديدان الخيطية ، وهو متاح مجانا من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC).
  2. لدراسة تأثير الجينات التي تشفر المنظمين المرشحين للنخر المثير ، اجمع بين طفرة في هذه الجينات (على سبيل المثال ، dapk-1 ، أو crh-1) مع سلالة السمية المثيرة للديدان الخيطية.
  3. إجراء التهجين الجيني وفقا لمعيار C. ايليجانس طرق30 ، كما هو موضح في wormbook.org42،43.
  4. نظرا لأن الأساس الجزيئي للطفرة موثق عادة ، اتبع النسل المتقاطع عن طريق التنميط الجيني للموضع المحدد باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). التفريق بين WT و mutant حسب حجم الجزء (للحذف) أو التسلسل (لطفرات النقاطية).
    ملاحظة: يوضح الجدول 1 السلالات التي تم استخدامها لدراسة مسارات متميزة للتنكس العصبي والحماية العصبية ، خاصة لهذا البروتوكول.
  5. اشتقاق جميع السلالات الحرجة من خلال خطين مستقلين واختبارها بشكل منفصل لتأكيد صحة النمط الظاهري المرصود.

2. وسائط النمو وتربية

  1. تنمو الديدان عند 16-25 درجة مئوية على ألواح NGM القياسية30،37،42 أو ألواح MYOB38،44 مصنفة ب OP50 الإشريكية القولونية وفقا للطرق القياسية.
    ملاحظة: تعطي لوحات MYOB نتائج مماثلة لألواح NGM ولكنها أسهل قليلا في التحضير.
  2. حافظ على السلالات التجريبية التي تتغذى جيدا باستمرار.
    ملاحظة: يمكن أن يؤثر الجوع على التنكس العصبي ويقلل من عدد الخلايا العصبية في الرأس المحتضرة. إذا كانت الديدان تتغذى بشكل سيئ أو تجويع ، فقم بوضعها في أطباق جديدة وانتظر بضعة أجيال قبل مواصلة التجارب. سوف يتضاءل تأثير الجوع عبر الأجيال بعد بضعة أجيال.

3. القياس الكمي للخلايا العصبية المتدهورة في الرأس عن طريق تباين التداخل التفاضلي Nomarski (DIC) والتسجيل

  1. استخدم سلالة السمية المثيرة للديدان الخيطية (ZB1102: glt-3 (bz34) IV ؛ nuIs5 V) كعنصر تحكم تجريبي للقياس الكمي ، والذي يمثل مستويات السمية المثيرة الطبيعية. لا يتبع البروتوكول نفس خلال مراحل نمو مختلفة. بدلا من ذلك ، فإنه يعطي لمحة سريعة عن مجموعة متنوعة من ، بحيث يجمع المرء في المجموع معلومات من مختلفة لتمثيل جميع مراحل النمو.
    ملاحظة: الجين المعدل nuls5 [Pglr-1:: GαS (Q227L). Pglr-1:: GFP] 45 (الذي يعبر عن Gαs و GFP المنشط في الخلايا العصبية بعد المشبكي إلى اتصالات الجلوتاماتيرجيك) ينتج مستوى تنكس عصبي مستقل عن GluR في الخلفية ~ 1 خلية عصبية / يحتضر (في أي وقت أثناء التطور). تزيد إضافة glt-3 (ko) من التنكس العصبي النخر للخلايا العصبية التي تعبر عن nuIs5 بعد المشبكي بطريقة تعتمد على GluR ، حيث ترتفع إلى 4-5 خلايا عصبية / في المرحلة الثالثة من اليرقات (L3) 37.
  2. بالنسبة لسلالات الاختبار ، استخدم من صليب جيني مكتمل مؤخرا ، أو قم بإذابة السلالات ذات الأهمية من -80 درجة مئوية من المخزونات المجمدة المحضرة من الصلبان الطازجة. انتظر بضعة أجيال (≥4) قبل تسجيل النمط الظاهري والتنكس العصبي.
  3. قم بقص وإزالة قطعة صغيرة من الأجار من صفيحة من مجموعة مختلطة من التي تتغذى جيدا ، وقم بتثبيتها على غطاء عن طريق قلب قطعة الأجار ، بحيث تواجه التي كانت تزحف على سطح الأجار الآن الغطاء.
    ملاحظة: لا يزال بإمكان التحرك ، لكنها الآن مقيدة إلى حد ما ويمكن ملاحظتها بدون تخدير. يمكن استخدام هذه القطعة لمدة ~ 1 ساعة قبل استبدالها بأخرى جديدة.
  4. باستخدام منظار DIC مقلوب مع x10 العين وإما x40 أو x63 ، قم بمسح بشكل عشوائي عن طريق تحريك الغطاء يدويا. في حين أن خطوات التصوير الأخرى الموضحة أدناه يمكن إجراؤها إما على المجاهر المقلوبة أو المستقيمة ، فإن فحص الديدان في قطعة الأجار يتطلب نطاقا مقلوبا.
  5. تحديد المرحلة التنموية لكل من خلال شكل الرحم (راجع مخططات الرحم في wormbook.org).
  6. لكل ، سجل مرحلة نموه وعدد الخلايا العصبية المحتضرة (أي المفرغة). عد وسجل العدد الإجمالي للخلايا العصبية المحتضرة في الرأس ، وعدد الخلايا العصبية المحتضرة في العقدة خلف المثانة (مما يوفر سهولة التعرف على خلايا معينة) ، وعدد الخلايا العصبية المحتضرة في الذيل (التي لا تتأثر بالغلوتامات وتعمل كعنصر تحكم داخلي ، مما يؤكد أن الجين المعدل الحساس nuIs5 نشط بالكامل).
  7. سجل هذه البيانات في جدول حيث يتم تجميع من سلالة معينة حسب فئات مرحلة النمو.
  8. في كل جلسة ، جمع البيانات عشوائيا من الديدان في عدة مراحل نموية ؛ قم بإجراء عدة جلسات تسجيل على مدار عدة أيام لجمع بيانات كافية للتحليل الإحصائي. سجل مستويات التنكس العصبي في مراحل متعددة وقم ببناء رسم بياني شريطي مشابه للشكل 1 ج.
    ملاحظة: ستسمح هذه الطريقة للمرء بتحديد ما إذا كان العلاج أو الطفرة المعينة ترفع / تقلل من مستويات التنكس العصبي في جميع المراحل (تحويل التوزيع لأعلى / لأسفل) أو تحول الذروة في التنكس العصبي إلى مرحلة نمو مبكرة أو لاحقة (تحويل التوزيع إلى اليسار / اليمين).
  9. قم بجمع البيانات أثناء التعمية عن هوية النمط الجيني. التأكيد في عزلتين مستقلتين للخط الجيني (لتقليل خطر الآثار غير المقصودة للاختلافات الجينية الأخرى / غير المتوقعة بين العزلات) ، وتجميع البيانات للتحليل.
  10. في كل سلالة ، احسب متوسط ومحرك البحث لعدد الخلايا العصبية المتدهورة في الرأس (بما في ذلك العقدة خلف الحويصل) في كل مرحلة من مراحل النمو (الشكل 1 د). قم بإجراء تحليل مماثل للعقدة الحويصلية المحتضرة - فقط والخلايا العصبية الذيل ، حسب الضرورة.

4. تحديد الخلايا العصبية المتدهورة المحددة في الرأس

  1. قم بتركيب الفردية (أو مجموعات صغيرة من-) على وسادة أجار46 ، وشلل الدودة باستخدام رباعي التتراميسول (انظر أدناه ، القسم 5).
  2. مع نطاق مضان ونطاق DIC مدمج (في وضع مستقيم أو مقلوب) حدد مواقع الخلايا العصبية المفرغة المحددة.
  3. حدد هوية الخلايا العصبية المحددة للخلايا العصبية المفرغة من خلال تتبع العمليات المسماة GFP ومقارنة موقع جسم الخلية وشكل العمليات بتلك الخاصة بالخلايا العصبية المعروفة بالتعبير عن glr-1 باستخدام WormAtlas47.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن المساعدة في تحديد الهوية من خلال طرق جديدة لتحديد الخلايا العصبية بسرعة عن طريق وضع العلامات متعددة الألوان التي ستأتي قريبا من مختبر هوبرت48.

5. التصوير الحي لمورفولوجيا الميتوكوندريا العصبية عن طريق المجهر الفلوري لسلالات المراسل

  1. لتصوير تغيرات الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المتدهورة بعد المشبكي (والتي تم تصنيفها ب GFP السيتوبلازمي في سلالة السمية المثيرة الأصلية) ، افحص مضان mito-mChery.
  2. عبر سلالة السمية المثيرة للاختبار مع السلالات التي تصنف الميتوكوندريا من الخلايا العصبية بعد المشبكية مع التألق الأحمر (عن طريق التعبير عن اندماج بين البروتين الفلوري والطرف N ل TOM-20 تحت محفز glr-1 ؛ للحصول على تفاصيل حول التركيبات والسلالات ، انظر49). يمكن الآن تصوير باستخدام مجهر التألق العادي (في وضع مستقيم أو مقلوب) أو مجهر متحد البؤر.
  3. لشل الدودة دون التأثير على بقاء الخلايا العصبية ، ضع ماصة 5 ميكرولتر من 10 ملي مولار من رباعي الأغاروز على وسادة الاغاروز المعدة حديثا. انظر Arnold et al.46 للحصول على بروتوكول مفصل حول إعداد الفوط.
  4. ضع في منتصف قطرة رباعي التترايزول وقم بتثبيتها بغطاء.
  5. أغلق جوانب الغطاء بطلاء الأظافر واترك طلاء الأظافر يجف.
  6. في غضون 20 دقيقة من علاج رباعي التتراميسول وباستخدام منظار مع DIC والتصوير الفلوري ، حدد موقع الديدان باستخدام عدسة موضوعية 20x.
  7. بمجرد تحديد موقع رأس الدودة (أو الخلايا العصبية ذات الأهمية) ، انتقل إلى هدف زيت 100x وركز على وضع العلامات الفلورية للميتوكوندريا في السوما.
  8. التقط صورا Z-stack باستخدام إعدادات مرشح DIC وGFP وTxRed.

6. تحصيل مورفولوجيا الميتوكوندريا العصبية وتقديرها الكمي

  1. تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا إما أثناء التصوير المباشر للدودة أو بعد الحصول على الصورة باستخدام ImageJ أو برامج تصوير أخرى.
  2. لسهولة التعرف والتحليل المتكرر لخلايا عصبية معينة ، حدد الخلايا العصبية الثلاثة في العقدة خلف المثانة ، RIGL / R و AVG (في بعض الحالات يوجد اثنان فقط بسبب إزالة جثة الخلية في السمية الاستثارية).
  3. صنف الميتوكوندريا إلى ثلاث مجموعات رئيسية: خيطية ومتوسطة ومجزأة50،51،52.
    ملاحظة: تظهر الميتوكوندريا الخيطية كهياكل رقيقة مستمرة في سوما الخلايا العصبية ، وعادة ما تحيط بالنواة. تظهر الميتوكوندريا الوسيطة كمزيج من شبكة خيطية ظاهرة واحدة على الأقل ، وإن كان ذلك مع فواصل ، وبعض التجزئة في سوما. تظهر الميتوكوندريا المجزأة فواصل كاملة في شبكة الميتوكوندريا ، ولها مظهر منتفخ ، وتنتشر في جميع أنحاء سوما (الشكل 2 أ).
  4. لكل دودة ، قم بتسجيل النسبة المئوية للخلايا العصبية ذات الميتوكوندريا الخيطية أو المتوسطة أو المجزأة ليصبح المجموع 30 دودة على الأقل.
  5. قم بإجراء تحليل إحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق لكل مورفولوجيا الميتوكوندريا بين السلالات53.

7. تحضير العازلة والكواشف لتفكك الدودة ل FACS للخلايا العصبية المعرضة لخطر التنكس العصبي

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت M9 على النحو التالي: 3 جم من KH2PO4 ، 6 جم من Na2HPO4 ، 5 جم من كلوريد الصوديوم ، H2O إلى 1 L. تعقيم عن طريق التعقيم. أضف 1 مل من 1 م MgSO4 المعقم بالفلتر. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  2. تحضير عازلة البيض على النحو التالي: 118 ملي كلوريد الصوديوم ، 48 ملي كلوريد كلوريد ، 2 ملي كلوريد الملكس2 ، 2 ملي كلوريدالملجم 2 ؛ الأوتوكلاف للتعقيم. أضف 2 متر من محلول مخزون HEPES pH 7.3 (تمت تصفيته مسبقا باستخدام مرشح أعلى زجاجة 0.2 ميكرومتر) إلى تركيز نهائي يبلغ 25 ملم. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 باستخدام 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (لا يزيد عن 10 مل). استخدم مقياس التناضح للتأكد من أن الأسمولية النهائية تتراوح بين 335-345 مللي أسم. قم بتصفية تعقيم المخزن المؤقت للبيض باستخدام مرشحات أعلى الزجاجة 0.2 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تذوب الأملاح بسهولة عند استخدام MgCl2 ·6H2O و CaCl2 · 2H2O لصنع محاليل مخزون MgCl2 و CaCl2 . يمكنك أيضا عمل مخزون من 10 أضعاف بيض مخزولة وتخفيفها عند الحاجة في ماء معقم منزوع الأيونات.
  3. تحضير SDS-DTT على النحو التالي: 20 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 8.0 ، 0.25٪ SDS ، 200 ملي DTT ، 3٪ سكروز. في غطاء مزرعة الأنسجة ، قم بتعقيم SDS-DTT باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. قم بتخزين 300 ميكرولتر من الكميات في -20 درجة مئوية مغطاة بورق الألمنيوم للحماية من الضوء.
  4. تحضير محلول بروناز على النحو التالي: تحضير يوم التفكك 15 مجم / مل بروناز في مخزن البيض. تخزينها على الثلج.

8. تزامن العمر ل FACS الخاص بالخلايا العصبية

  1. استخدم التي تجمع بين النمط الجيني للسمية المثيرة (والطفرات الأخرى ، حسب الرغبة) مع التعبير المعدل وراثيا لعلامة فلورية قوية يمكن استخدامها بسهولة للفرز (على سبيل المثال ، FJ1244: pzIs29 [Pglr-1 :: NLS :: LAC-Z :: GFP :: glr-1 3'UTR] X) 54. قم بزراعة على لوحين أو ثلاثة ألواح NGM / MYOB مقاس 100 مم عند 20 درجة مئوية حتى تمتلئ اللوحة بالديدان الحاملة في الغالب.
  2. اغسل الديدان من الألواح باستخدام المخزن المؤقت M9. انقل الديدان إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية زجاجية سعة 10 مل.
  3. جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 2.5 دقيقة عند 250 درجة مئوية وإزالة المادة الطافية.
  4. أعد تعليق حبيبات الدودة في 10 مل من محلول التبييض (2٪ 10 نيوتروجين هيدروكسيد الصوديوم و 5٪ مبيض منزلي طازج في ماء معقم منزوع الأيونات).
  5. ضع الأنابيب على شاكر أفقيا ، صخرة بسرعة منخفضة. تأكد من أن الديدان لا تستقر في قاع الأنبوب. تفتح شقوق التبييض بشرة الدودة ولكنها لا تؤثر على الأجنة المحمية بقشرة البيضة.
    1. تستغرق خطوة التبييض هذه حوالي 5 دقائق ، لكن هذا يختلف. لضمان عدم حدوث التبييض المفرط، راقب العملية عن طريق استرداد عينة كل دقيقة: قم بإخراج 10 ميكرولتر برفق من كل أنبوب على شريحة مجهر زجاجي وافحص الديدان باستخدام مجهر تشريح.
  6. بمجرد أن يتم فتح معظم الديدان الحابنة ولكن لا تذوب تماما ، أوقف خطوة التبييض عن طريق ملء الأنابيب المخروطية بمحلول البيض.
  7. لاستعادة البويضات / الأجنة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 250 × جم لمدة 2.5 دقيقة ، وقم بإزالة المادة الطافية واغسلها مرة أخرى باستخدام عازلة البيض.
  8. كرر أربع غسلات أخرى.
  9. أعد تعليق البيض عن طريق سحب الحبيبات برفق وانتشر على أربع ألواح NGM / MYOB مصنفة مقاس 100 مم. دع الأجنة تفقس وتنمو عند 20 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
    ملاحظة: يجب أن تكون الألواح الآن مليئة بالديدان التي يغلب عليها الحمل.
  10. كرر مزامنة العمر عن طريق تكرار بروتوكول مزامنة التبييض / العمر.
  11. ضع البيض على ثماني أطباق NGM / MYOB مقاس 100 مم. دع يفقس وينمو عند 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة اليرقات المرغوبة.

9. تفكك الخلايا الدودية الكاملة ل FACS

  1. تنمو الديدان المتزامنة إلى مرحلة النمو المرغوبة. اغسل الألواح مقاس 100 مم برفق باستخدام المخزن المؤقت M9 والماصات المصلية الزجاجية وانقلها إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
  2. أضف M9 البارد حتى 45 مل. ضع الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة للسماح للديدان بالاستقرار في القاع عن طريق الجاذبية ، بينما يطفو أي بقايا بكتيرية متبقية من الصفائح في المادة الطافية.
  3. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الديدان ب M9 الطازج.
  4. كرر الجاذبية لمدة 30 دقيقة التي تستقر على الجليد.
  5. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف M9 حتى 45 مل ، وجهاز الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق.
  6. انقل الحبيبات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وأضف M9 حتى 1 مل.
  7. تدور بسرعة 14,000 دورة في الدقيقة على جهاز طرد مركزي منضدية لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية.
  8. لتعطيل البشرة ، أعد تعليق حبيبات الدودة باستخدام SDS-DTT باستخدام (تقريبا) ضعف حجم الحبيبات ، واحتضانها بالهزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق لمراحل L2 للبالغين.
    ملاحظة: لا تتجاوز 4 دقائق من الحضانة في SDS-DTT لأن إشارة البروتين الفلوري ستنخفض بشكل كبير مع معالجة SDS-DTT الأطول. نظرا لأن SDS-DTT حساس للضوء ، فلا ينبغي أن يكون عمره أكثر من 3 أشهر لأن المحلول قد يفقد فعاليته بمرور الوقت ؛ تعمل عمليات التفكيك بشكل أفضل مع حل SDS-DTT الذي تم إعداده مؤخرا.
  9. أضف 1x مخزن مؤقت للبيض (درجة الحموضة 7.3 ، 335-345 mOsm) حتى 1 مل لإيقاف علاج SDS-DTT.
  10. تدور بسرعة 14,000 دورة في الدقيقة على جهاز طرد مركزي منضدية لمدة دقيقة واحدة وقم بإزالة المادة الطافية.
  11. لمزيد من تعطيل البشرة وفصل خلايا ، أعد تعليق الحبيبات بمحلول بروناز بدرجة حرارة الغرفة ، باستخدام ثلاثة أضعاف حجم الحبيبات.
  12. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة.
  13. الماصة لأعلى ولأسفل 40 مرة كل 5 دقائق باستخدام ماصة P-200 أو P-1000، تلامس الجزء السفلي من الأنبوب بطرف الماصة.
    ملاحظة: الضغط الناتج عن لمس الطرف لقاع الأنبوب يسهل تفكك الدودة. استخدم طرف مرشح حتى لا تدخل الديدان إلى عمود الماصة عن طريق الخطأ أثناء سحب العينات السريع.
  14. بعد 15 دقيقة ، تحقق من تقدم تفكك الدودة عن طريق سحب 5 ميكرولتر برفق على شريحة زجاجية ومراقبة التقدم تحت مجهر التشريح. عندما تنفجر معظم الديدان السليمة (~ 90٪) ، تكتمل العملية.
    ملاحظة: يمكن تمديد حضانة البروناز إذا بقيت العديد من الديدان سليمة.
  15. في غطاء مزرعة الخلايا ، أضف 1x مخزن مؤقت للبيض حتى 1.5 مل لإيقاف علاج البروناز.
  16. انقله إلى أنابيب FACS ، وأضف 5 مل من البيض المؤقت ، ثم قم بالتدوير عند 800 × جم لمدة 5 دقائق.
  17. قم بإزالة المادة الطافية وأعدها في 3 مل من البيض المؤقت.
  18. ضع غطاء مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنابيب FACS الجديدة ، وتعليق خلية الماصة على المصفاة ، وقم بالدوران عند 800 × جم لمدة 1 دقيقة. اجمع تعليق خلية التدفق.
  19. ضع غطاء مصفاة خلية 5 ميكرومتر على أنابيب FACS الجديدة ، وتعليق خلية الماصة على المصفاة ، وقم بالدوران عند 800 × جم لمدة 1 دقيقة.
  20. أضف DAPI للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكروغرام / مل في مخزن البيض، ضعه على الثلج بغطاء / غطاء للحماية من الضوء.
  21. قم بإجراء FACS في أسرع وقت ممكن. تنخفض إشارة البروتين الفلوري بمرور الوقت والتعرض للضوء ، لذلك من المهم إجراء بروتوكول التفكك في أسرع وقت ممكن وإجراء FACS فور اكتمال التفكك.
    ملاحظة: تم تكييف بروتوكول تفكك الدودة من بروتوكولات من مختبر ميلر55،56،57 ، ومختبر مورفي58 ، ومختبر شاهام59.

10. تعديلات تشغيل آلة FACS لتحديد C . ايليجانس الخلايا العصبية

  1. استخدم 4 لترات من محلول البيض المبرد (4 درجات مئوية) بدلا من سائل الغمد القياسي عند فرز الخلايا العصبية C. ايليجانس .
    ملاحظة: الأسمولية لخلايا C. ايليجانس أعلى بكثير من خلايا الثدييات وسائل الغمد القياسي سوف ينفجر الخلايا العصبية. تتم جميع إعدادات الماكينة والمعايرة بعد إضافة عازلة البيض ، لأن لزوجة عازلة البيض تختلف عن لزوجة سائل الغمد القياسي. سيقوم فني الفرز بتشغيل الخرز التشخيصي من خلال الجهاز للتأكد من أن الليزر يعمل بشكل صحيح.
  2. عند استخدام الخلايا العصبية المصنفة في دراسات النسخ اللاحقة ، قم بفرز ما لا يقل عن 100,000 خلية GFP + مباشرة إلى 800 ميكرولتر من Trizol-LS + 10 ميكرولتر من مثبط RNase.
  3. اقلب الخلايا في Trizol 15 مرة للخلط.
  4. قم بالتجميد في حمام ثلج جاف / إيثانول وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا لاستخراج الحمض النووي الريبي من جميع العينات لتجربة تسلسل الحمض النووي الريبي الواحدة.
    ملاحظة: بينما يتم جمع معظم الخلايا التي تم فرزها مباشرة في Trizol لتحليل النسخ ، تأكد من استرداد عينة صغيرة من الخلايا المصنفة GFP + (من كل سلالة) التي تم جمعها في مخزن مؤقت للبيض ، للتحقق من صحة كفاءة الفرز بالفحص المجهري.

11. استراتيجية بوابة FACS

  1. لتحديد الإشارة الموجبة GFP ، استخدم ليزر 488 نانومتر مع مرشح 530/30 و 502 تمرير طويل (LP).
  2. لتحديد خلايا DAPI الإيجابية والسالبة ، استخدم ليزر 405 نانومتر مع مرشح 450/50.
  3. لتحديد الخلايا الفلورية التلقائية التي يمكن الخلط بينها وبين الخلايا الإيجابية ل GFP ، استخدم ليزر 488 نانومتر مع مرشح 610/20 و 595 LP (اتصال شخصي ، ستانكا سيموفا ، مدير العمليات ، مركز موارد قياس التدفق الخلوي ، جامعة روكفلر).
  4. قم بتنفيذ استراتيجية بوابات قياسية وقم بإزالة الأحداث ذات منطقة التشتت الجانبية الكبيرة (SSC-A) ومنطقة التشتت الأمامية الصغيرة (FSC-A) ، والتي من المحتمل أن تمثل كتل من الخلايا والحطام.
  5. عزل المفردات المبعثرة في المقدمة ثم المفردات المفردة المبعثرة الجانبية.
  6. عزل الخلايا ذات إشارة GFP العالية وإشارة التألق الذاتي المنخفضة.
    ملاحظة: الخلايا المرتفعة للتألق الذاتي والأقل في GFP ليست خلايا إيجابية حقيقية ل GFP.
  7. يتم تحديد عتبة بوابة GFP + من خلال مقارنة خلايا GFP (أي N2) بخلايا GFP +55،56.
  8. قم بإزالة أي خلايا ميتة ببوابة حية / ميتة ، بناء على النفاذية الانتقائية ل DAPI للخلايا الميتة: يتم تحديد عتبة البوابة الميتة الحية من خلال مقارنة الخلايا غير الملوثة بالخلايا الملطخة ب DAPI.
    ملاحظة: عند فرز عينات متعددة ، قم بمسح التيار بين العينات للتأكد من عدم وجود تلوث متبادل.

12. الفحص المجهري للخلايا العصبية المصنفة للتحقق من كفاءة استراتيجية بوابات FACS

  1. ارسم دائرة على شريحة مجهر زجاجي بقلم طارد للسوائل.
  2. ماصة 10 ميكرولتر من الخلايا المصنفة معلقة في عازلة البيض داخل الدائرة. ضع غطاء فوق العينة وأغلقها بطلاء الأظافر حول محيط زلة الغطاء.
  3. بعد أن يجف طلاء الأظافر ، تحقق تحت المجهر الفلوري المستقيم / المقلوب من أن الخلايا التي تم فرزها هي بالفعل خلايا GFP + في المقام الأول.
    ملاحظة: قم بإجراء هذا الفحص بعد كل جلسة فرز للتحقق من صحة استراتيجية بوابة FACS57.

13. استخراج الحمض النووي الريبي وقياس جودة الحمض النووي الريبي على نظام الرحلان الكهربائي الآلي لمراقبة الجودة

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع أعمال الحمض النووي الريبي بحذر شديد لتجنب التلوث ب RNase (بما في ذلك التحضير الدقيق للكواشف والمواد الاستهلاكية وأفضل الممارسات الآمنة ل RNase).

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التي تحتوي فيها العينات على الفينول و / أو الكلوروفورم في غطاء الدخان.

  1. قم بإذابة قوارير الخلايا في Trizol في درجة حرارة الغرفة.
  2. باستخدام طرف ماصة P200 من طرف المرشح، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتجانس العينة.
  3. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم لكل 1 مل من كاشف Trizol المستخدم في التحلل ، ثم قم بتغطية الأنبوب بإحكام.
  5. اقلب الأنابيب 15 مرة ، واحتضن (عند 20-25 درجة مئوية) لمدة 2-3 دقائق.
  6. الطرد المركزي للعينة لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × جم عند 4 درجات مئوية. ينفصل الخليط إلى فينول كلوروفورم أحمر سفلي ، وطور بيني ، ومرحلة مائية علوية عديمة اللون.
  7. اجمع حصريا المرحلة المائية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي ونقلها إلى أنبوب جديد منخفض الحمض النووي / الحمض النووي الريبي 1.5 مل.
    ملاحظة: في بعض الحالات ، إذا كانت نسبة الخلايا في عازلة البيض التي سقطت من فارز الخلايا إلى Trizol أكبر من عينة 1: 3: نسبة Trizol-LS ، فإن محتوى الملح العالي في مخزن البيض يمكن أن يتسبب في انعكاس الطبقات ؛ إذا حدث هذا ، أضف المزيد من Trizol-LS وكرر الانعكاس والطرد المركزي. يمكن أيضا تجنب ذلك إذا لاحظت الزيادة في حجم العينة بعد الفرز ؛ إذا لم يتم الحفاظ على نسبة 1: 3 ، أضف كمية كافية من trizol قبل البدء في استخراج الحمض النووي الريبي.
  8. لمزيد من تنقية الحمض النووي الريبي ، استخدم كيمياء عمود استخراج الحمض النووي الريبي.
  9. استخدم نظام الرحلان الكهربائي الآلي لمراقبة الجودة لقياس رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) وتأكيد RIN للحمض النووي الريبي البالغ 8.0 أو أكثر للإدخال في تجارب تسلسل الحمض النووي الريبي اللاحقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نموذج الديدان الخيطية للسمية المثيرة وتحديد الخلايا العصبية المتدهورة المفرغة
البيانات المعروضة هنا مستنسخة من المنشورات السابقة37،38. لتقليد التنكس العصبي الناجم عن السمية المثيرة ، يتم الجمع بين الضربة الق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في حين أن الخلافات والفشل السائد تشير إلى أن السمية المثيرة تمثل عملية صعبة للغاية لفك تشفيرها ، فإن تحليل السمية المثيرة في الديدان الخيطية يقدم استراتيجية جذابة بشكل خاص لإلقاء الضوء على مسارات موت الخلايا العصبية المحفوظة في هذا الشكل الحرج من التنكس العصبي. يمكن لل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر جميع أعضاء مختبر مانو ومختبر لي (الحاليين والأخيرين) على مساعدتهم ودعمهم. نشكر الدكتورة مونيكا دريسكول (جامعة روتجرز) على ريادتها في تحليل التنكس العصبي النخر في الديدان الخيطية وتقديم الدعم المستمر. الدكتور كريس لي (CCNY) للدعم والمشورة ؛ جيفري ووكر (منشأة CCNY Flow Cytometry الأساسية) ، والدكتور باو فونج (CCNY) ، وستانكا سيموفا (كلية الفرز بجامعة روكفلر) للحصول على الدعم العملي وتقديم المشورة بشأن فرز الخلايا ؛ الدكتور كريس رونغو (جامعة روتجرز) للكواشف ؛ د. ديفيد ميلر (جامعة فاندربيلت) ، كولين مورفي (جامعة برينستون) ، شاي شاهام ، مناحيم كاتز ، وكاثرين فارانداس (الثلاثة من جامعة روكفلر) لبروتوكولات الانفصال C. elegans.

تلقى مختبر مانو تمويلا من NIH NINDS (NS096687 ، NS098350 ، NS116028) إلى IM ، ومن خلال شراكة NIH U54 CCNY-MSKCC (CA132378 / CA137788).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWRAAA10752-0E
BactopeptoneVWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
BleachAny household
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Centrifuge - microfuge ; Ependorff 5424VWRMP022629891
ChloroformVWR97064-680
CholesterolSigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
Dry iceUnited City Ice Cube
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
Ethanol (100%)VWREM-EX0276-1S
Ethanol (90%)VWRBDH1160-4LP
FACS tubesUSA Sci1450-2810
Filter tips USA Sci1126-7810
Glass 10 mL serological pipettes USA Sci1071-0810
Heating block BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
Immersion Oil - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
IsopropanolVWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
Low bind 1.5mL tubesUSA Sci4043-1021
Metamorph Imaging SoftwareMolecular Devices
MgCl2VWR97063-152
MgCl2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO4VWR97061-438 
Microscope, Confocal, for Fluorescence ImagingZeissLSM 880
Microscope, Inverted, for Fluorescence ImagingZeissAxiovert 200 M
Microscope  CameraQ-ImagingRetiga R1
Microscope Light Source for Fluorescence ImagingLumencorSOLA SE Light Engine
Microscope, Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
Microscope, Nomarski DICNikonEclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
Petri dishes, 100mmFisher SciFB0875712
Petri dishes, 60mmTriTechT3308
Pipet ControllerTEquipmentP2002
Pipettor P10 TipsUSA Sci1110-3000
Pipettor P1000 TipsUSA Sci1111-2020
Pipettor P200 TipsUSA Sci1110-1000
PronaseSigmaP8811-1G
RNAse away sprayFisher Sci7000TS1
RNAse free serological pipettesUSA Sci1071-0810
RNAse-free 50 mL tubesUSA Sci5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
Streptomycin sulfateSigmaS6501-100G
SucroseVWRAAJ63662-AP
SUPERase·in RNase inhibitorFisher SciAM2694
Quality Control automated electrophoresis system: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent5067-5579 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent5067-5581 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexerAgilent/IKA4674100
Tapestation - IKA vortexer adaptor at 2000 rpm Agilent/IKA3428000
Tapestation - Loading tips Agilent5067- 5152 or 5067- 5153
Tapestation - Optical Cap 8x StripAgilent401425
Tapestation - Optical Tube 8x StripAgilent401428
Quality Control automated electrophoresis system: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
Tris baseFisher SciBP152-500
Tris hydrochlorideFisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 Vapor Pressure OsmometerFisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP DispenserVWR25485-003

References

  1. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, 171-182 (1990).
  2. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. The Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  3. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  4. Fisher, M., Saver, J. L. Future directions of acute ischaemic stroke therapy. Lancet Neurology. 14 (7), 758-767 (2015).
  5. Chamorro, A., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurology. 15 (8), 869-881 (2016).
  6. Baron, J. C. Protecting the ischaemic penumbra as an adjunct to thrombectomy for acute stroke. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 325-337 (2018).
  7. GBD Neurology Collaborators. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 18 (5), 459-480 (2019).
  8. Kaji, R. Global burden of neurological diseases highlights stroke. Nature Reviews Neurology. 15, 371-372 (2019).
  9. Chen, R. L., Balami, J. S., Esiri, M. M., Chen, L. K., Buchan, A. M. Ischemic stroke in the elderly: an overview of evidence. Nature Reviews Neurology. 6 (5), 256-265 (2010).
  10. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Research Reviews. 54 (1), 34-66 (2007).
  11. Galluzzi, L., Kepp, O., Krautwald, S., Kroemer, G., Linkermann, A. Molecular mechanisms of regulated necrosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 35, 24-32 (2014).
  12. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (2), 135-147 (2014).
  13. Davis, S. M., et al. Selfotel in Acute Ischemic Stroke : Possible Neurotoxic Effects of an NMDA Antagonist. Stroke. 31 (2), 347-354 (2000).
  14. Ikonomidou, C., Turski, L. Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury. Lancet Neurology. 1 (6), 383-386 (2002).
  15. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
  16. Lai, T. W., Zhang, S., Wang, Y. T. Excitotoxicity and stroke: Identifying novel targets for neuroprotection. Progress in Neurobiology. 115 (157-188), (2014).
  17. Tymianski, M. Stroke in 2013: Disappointments and advances in acute stroke intervention. Nature Reviews Neurology. 10 (2), 66-68 (2014).
  18. Nicholls, D. G. Mitochondrial calcium function and dysfunction in the central nervous system. Biochimica et Biophysica Acta. 1787 (11), 1416-1424 (2009).
  19. Galluzzi, L., Blomgren, K., Kroemer, G. Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal injury. Nature Reviews Neuroscience. 10 (7), 481-494 (2009).
  20. Sharma, N., Pasala, M. S., Prakash, A. Mitochondrial DNA: Epigenetics and environment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 60 (8), 668-682 (2019).
  21. Howarth, C., Gleeson, P., Attwell, D. Updated energy budgets for neural computation in the neocortex and cerebellum. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1222-1232 (2012).
  22. Sims, N. R., Muyderman, H. Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (1), 80-91 (2010).
  23. Dawson, T. M., Dawson, V. L. Mitochondrial Mechanisms of Neuronal Cell Death: Potential Therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 437-454 (2017).
  24. Verma, M., Wills, Z., Chu, C. T. Excitatory Dendritic Mitochondrial Calcium Toxicity: Implications for Parkinson's and Other Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, 523(2018).
  25. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death & Differentiation. 10 (8), 870-880 (2003).
  26. Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E. Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration. Nature Review Neuroscience. 9 (7), 505-518 (2008).
  27. Cho, D. H., Nakamura, T., Lipton, S. A. Mitochondrial dynamics in cell death and neurodegeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (20), 3435-3447 (2010).
  28. Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends in Cell Biology. 23 (2), 64-71 (2013).
  29. Picard, M., Shirihai, O. S., Gentil, B. J., Burelle, Y. Mitochondrial morphology transitions and functions: implications for retrograde signaling. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 304 (6), 393-406 (2013).
  30. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  31. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1(1986).
  32. Horvitz, H. R. Worms, Life, and Death (Nobel Lecture). Chembiochem. 4 (8), 697-711 (2003).
  33. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  34. Driscoll, M., Gerstbrein, B. Dying for a cause: invertebrate genetics takes on human neurodegeneration. Nature Reviews Genetics. 4 (3), 181-194 (2003).
  35. Brockie, P. J., Maricq, A. V. Ionotropic glutamate receptors: genetics, behavior and electrophysiology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  36. Mano, I., Straud, S., Driscoll, M. Caenorhabditis elegans Glutamate Transporters Influence Synaptic Function and Behavior at Sites Distant from the Synapse. Journal of Biological Chemistry. 282 (47), 34412-34419 (2007).
  37. Mano, I., Driscoll, M. C. elegans Glutamate Transporter Deletion Induces AMPA-Receptor/Adenylyl Cyclase 9-Dependent Excitotoxicity. J Neurochem Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1373-1384 (2009).
  38. Feldmann, K. G., et al. Non-Canonical Activation of CREB Mediates Neuroprotection in a C. elegans Model of Excitotoxic Necrosis. Journal of Neurochemistry. 148 (4), 531-549 (2019).
  39. Del Rosario, J. S., et al. Death Associated Protein Kinase (DAPK) -Mediated Neurodegenerative Mechanisms in Nematode Excitotoxicity. BMC Neuroscience. 16, 25(2015).
  40. Tehrani, N., Del Rosario, J., Dominguez, M., Kalb, R., Mano, I. The Insulin/IGF Signaling Regulators Cytohesin/GRP-1 and PIP5K/PPK-1 Modulate Susceptibility to Excitotoxicity in C. elegans. PLoS One. 9 (11), 113060(2014).
  41. Chung, S., Gumienny, T. L., Hengartner, M. O., Driscoll, M. A common set of engulfment genes mediates removal of both apoptotic and necrotic cell corpses in C. elegans. Nature Cell Biology. 2 (12), 931-937 (2000).
  42. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  43. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  44. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121 (8), 2525-2535 (1995).
  45. Berger, A. J., Hart, A. C., Kaplan, J. M. Galphas-induced neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 18 (8), 2871-2880 (1998).
  46. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiment. , e61368(2020).
  47. Altun, Z. F., Herndon, L. A., Crocker, C., Lints, R., Hall, D. H. WormAtlas. , Available from: www.wormatlas.org (2019).
  48. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A Neuronal Polychromatic Atlas of Landmarks for Whole-Brain Imaging in C. elegans. bioRxiv. , (2019).
  49. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).
  50. Regmi, S. G., Rolland, S. G., Conradt, B. Age-dependent changes in mitochondrial morphology and volume are not predictors of lifespan. Aging (Albany NY). 6 (2), 118-130 (2014).
  51. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1453-1466), (2015).
  52. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitani, A. Heat-Induced Calcium Leakage Causes Mitochondrial Damage in Caenorhabditis elegans Body-Wall Muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  53. Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  54. Moss, B. J., Park, L., Dahlberg, C. L., Juo, P. The CaM Kinase CMK-1 Mediates a Negative Feedback Mechanism Coupling the C. elegans Glutamate Receptor GLR-1 with Its Own Transcription. PLoS Genetics. 12 (7), 1006180(2016).
  55. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
  56. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC Genomics. 6, 42(2005).
  57. Spencer, W. C., et al. Isolation of Specific Neurons from C. elegans Larvae for Gene Expression Profiling. PLoS One. 9 (11), 112102(2014).
  58. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).
  59. Katz, M., et al. Glutamate spillover in C. elegans triggers repetitive behavior through presynaptic activation of MGL-2/mGluR5. Nature Communications. 10 (1), 1882(2019).
  60. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  61. Kaal, E. C., et al. Chronic mitochondrial inhibition induces selective motoneuron death in vitro: a new model for amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1158-1165 (2000).
  62. Lewis, J. A., et al. Cholinergic receptor mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  63. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505(2011).
  64. Zhang, S., Kuhn, J. R. Cell isolation and culture. WormBook. , Available from: www.wormbook.org 1-39 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved