تلطيخ التألق المناعي بالكامل ، والتصوير البؤري وإعادة البناء 3D للعقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية في الماوس

Summary

نحن نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لتلطيخ التألق المناعي الكامل للعقدة الجيبية الأذينية (SAN) والعقدة الأذينية البطينية (AVN) في قلوب الفئران.

Abstract

يتم إجراء الإشارة الكهربائية التي تولدها خلايا جهاز تنظيم ضربات القلب في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) من خلال نظام التوصيل ، والذي يتضمن العقدة الأذينية البطينية (AVN) ، للسماح بإثارة وتقلص القلب كله. أي خلل في SAN أو AVN يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب ، مما يشير إلى دورهم الأساسي في الفيزيولوجيا الكهربية وعدم انتظام ضربات القلب. تستخدم نماذج الفئران على نطاق واسع في أبحاث عدم انتظام ضربات القلب ، لكن التحقيق المحدد في SAN و AVN لا يزال يمثل تحديا.

يقع SAN عند تقاطع محطة crista مع الوريد الأجوف العلوي ويقع AVN في قمة مثلث كوخ ، الذي يتكون من فتحة الجيب التاجي ، والحلقة ثلاثية الشرف ، ووتر تودارو. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجمها ، لا يزال التصور بواسطة الأنسجة التقليدية يمثل تحديا ولا يسمح بدراسة SAN و AVN داخل بيئة 3D الخاصة بهم.

هنا نصف نهج التألق المناعي الكامل الذي يسمح بالتصور المحلي للماوس المسمى SAN و AVN. تم تصميم تلطيخ التألق المناعي بالكامل للأقسام الأصغر من الأنسجة دون الحاجة إلى التقسيم اليدوي. لهذا الغرض ، يتم تشريح قلب الفأر ، مع إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها ، تليها التثبيت والنفاذية والحجب. ثم يتم تلطيخ خلايا نظام التوصيل داخل SAN و AVN بجسم مضاد ل HCN4. يسمح الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ومعالجة الصور بالتمايز بين الخلايا العقدية وخلايا عضلة القلب العاملة ، وتحديد موقع SAN و AVN بوضوح. علاوة على ذلك ، يمكن دمج أجسام مضادة إضافية لتسمية أنواع الخلايا الأخرى أيضا ، مثل الألياف العصبية.

بالمقارنة مع الأنسجة المناعية التقليدية ، يحافظ تلطيخ التألق المناعي الكامل على السلامة التشريحية لنظام التوصيل القلبي ، مما يسمح بالتحقيق في التنخر اللاوعائي. خاصة في تشريحها وتفاعلاتها مع عضلة القلب العاملة المحيطة والخلايا غير العضلية.

Introduction

عدم انتظام ضربات القلب هي أمراض شائعة تؤثر على الملايين من الناس ، وهي سبب المراضة والوفيات الكبيرة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من التقدم الهائل في العلاج والوقاية ، مثل تطوير أجهزة تنظيم ضربات القلب ، لا يزال علاج عدم انتظام ضربات القلب يمثل تحديا ، ويرجع ذلك أساسا إلى المعرفة المحدودة للغاية فيما يتعلق بآليات المرض الأساسية¹،^2،3. قد يساعد الفهم الأفضل لكل من الفيزيولوجيا الكهربية الطبيعية والفيزيولوجيا المرضية لعدم انتظام ضربات القلب في تطوير استراتيجيات علاج جديدة ومبتكرة وسببية في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، لدراسة عدم انتظام ضربات القلب بشكل شامل ، من المهم توطين وتصور نظام التوصيل القلبي المحدد في النماذج الحيوانية مثل الفأر ، حيث تستخدم الفئران على نطاق واسع في أبحاث الفيزيولوجيا الكهربية.

الأجزاء الرئيسية لنظام التوصيل القلبي هي العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ، حيث يتم توليد النبضة الكهربائية في خلايا جهاز تنظيم ضربات القلب المتخصصة ، والعقدة الأذينية البطينية (AVN) ، وهي الوصلة الكهربائية الوحيدة بين الأذينين والبطينين⁴. عندما يتم تغيير الخصائص الفيزيولوجية الكهربية ل SAN و AVN ، يمكن أن يحدث عدم انتظام ضربات القلب مثل متلازمة الجيوب الأنفية المريضة أو الكتلة الأذينية البطينية مما قد يؤدي إلى تدهور الدورة الدموية والإغماء وحتى الموت ، وبالتالي التأكيد على الدور الأساسي لكل من SAN و AVN في الفيزيولوجيا الكهربية وعدم انتظام ضربات القلب⁵.

تتطلب الدراسات الشاملة حول SAN أو AVN توطينا وتصورا دقيقا لكلا الهيكلين ، من الناحية المثالية داخل بيئتهما الفسيولوجية. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجمها وموقعها داخل عضلة القلب العاملة ، دون إنشاء بنية واضحة مرئية مجهريا ، فإن دراسة علم التشريح والفيزيولوجيا الكهربية ل SAN و AVN أمر صعب. يمكن استخدام المعالم التشريحية لتحديد المنطقة التي تحتوي على SAN و AVN^6،7،8 تقريبا. باختصار ، يقع SAN في المنطقة بين الأجوف من الأذين الأيمن المجاور لمحطة crista العضلية (CT) ، ويقع AVN داخل مثلث كوخ الذي أنشأه الصمام ثلاثي الشرف ، وعظم الجيب التاجي ووتر تودارو. حتى الآن ، تم استخدام هذه المعالم التشريحية بشكل أساسي لتحديد وإزالة ثم دراسة SAN و AVN كهياكل فردية (على سبيل المثال ، بواسطة الأنسجة التقليدية). لفهم أفضل الفيزيولوجيا الكهربية المعقدة ل SAN و AVN (على سبيل المثال ، التأثيرات التنظيمية للخلايا المجاورة لعضلة القلب العاملة) ، ومع ذلك ، من الضروري دراسة أنظمة التوصيل داخل بيئة 3D الفسيولوجية.

تلطيخ التألق المناعي الكامل هو طريقة تستخدم لدراسة الهياكل التشريحية في الموقع مع الحفاظ على سلامة الأنسجة المحيطة⁹. من خلال الاستفادة من الفحص المجهري متحد البؤر وبرنامج تحليل الصور ، يمكن تصور SAN و AVN باستخدام أجسام مضادة موسومة بالفلورسنت تستهدف القنوات الأيونية المعبر عنها بشكل خاص في هذه المناطق.

يشرح هذا البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لتنفيذ طريقة تلطيخ مثبتة بالكامل راسخة لتوطين مجهر SAN و AVN وتصوره. على وجه التحديد ، يصف هذا البروتوكول كيفية (1) توطين SAN و AVN بواسطة المعالم التشريحية لإعداد هذه العينات للتلوين والتحليل المجهري (2) لإجراء تلطيخ التألق المناعي بالكامل للعلامات المرجعية HCN4 و Cx43 (3) لإعداد عينات SAN و AVN للفحص المجهري متحد البؤر (4) لإجراء تصوير متحد البؤر ل SAN و AVN. كما نصف كيف يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل تلطيخا إضافيا لعضلة القلب العاملة المحيطة أو الخلايا غير العضلية مثل الألياف العصبية المستقلة التي تسمح بإجراء فحص شامل لنظام التوصيل القلبي داخل القلب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم إجراء رعاية الحيوان وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات بجامعة ميونيخ ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران من قبل حكومة بافاريا ، ميونيخ ، ألمانيا (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106 ، ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). تم شراء الفئران C57BL6 / J من مختبر جاكسون.

ملاحظة: يوضح الشكل 1 الأدوات اللازمة للتجربة. يوضح الشكل 2 توضيحا للتشريح القلبي الإجمالي. يوضح الشكل 3 موقع SAN و AVN في قلب فأر بالغ. يوضح الشكل 4 العينة المعدة المحملة على الفحص المجهري متحد البؤر.

1. الاستعدادات

1. تحضير محلول فورمالديهايد 4٪ (4٪ PFA) عن طريق تخفيف 10 مل من محلول الفورمالديهايد 16٪ في 30 مل من PBS.
2. تحضير محلول سكروز 15٪ ومحلول سكروز 30٪ عن طريق إذابة 15 جم و 30 جم من مسحوق السكروز في 100 مل PBS ، على التوالي. بعد إذابة مسحوق السكروز بالكامل ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر قبل التخزين عند 4 درجات مئوية.
3. تحضير 3٪ -4٪ هلام الأغاروز ، إضافة 3 غرام أو 4 غرام مسحوق الأغاروز و 100 مل من 1x TAE (مخفف من محلول مخزون 50x TAE) في دورق. ضع الدورق على محرك مغناطيسي واغليه حتى يذوب الأغاروز تماما.
4. تحضير طبق التشريح عن طريق صب بلطف 30 مل من هلام الأغاروز (3٪ -4٪) في طبق بتري قطره 100 مم. اترك طبق بتري على المقعد في درجة حرارة الغرفة ليبرد ويتصلب.
5. تحضير محلول الحجب ومحلول الغسيل وفقا للوصفات الواردة في الجدول 1. قم بإعداد جميع الحلول المعدة في يوم الاستخدام. لا ينصح التخزين على المدى الطويل.
6. قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة عن طريق تخفيفها في 1x PBS بارد (4 °C) ، وحماية التخفيف من الضوء (على سبيل المثال ، عن طريق لف رقائق الألومنيوم حولها) والحفاظ على التخفيفات على الجليد حتى يتم استخدامها. تمييع الأجسام المضادة قبل فترة وجيزة من الحضانة. تجنب ترك الأجسام المضادة المخففة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يجب اختبار تخفيف الأجسام المضادة المناسب بعينات أنسجة قابلة للمقارنة عن طريق إجراء تلطيخ مناعي تقليدي. هنا ، اختبرنا الأجسام المضادة عن طريق تلطيخ المقاطع المجمدة المقطوعة بسمك 10 ميكرومتر.

2. حصاد الأعضاء وإعداد الأنسجة

1. تخدير الفأر عن طريق وضعه في غرفة حضانة متصلة بمبخر إيزوفلوران. اضبط المرذاذ لتوصيل 4-5٪ إيزوفلوران (96-95٪ أكسجين ، على التوالي).
   ملاحظة: يتم تأكيد التخدير الكامل من خلال فقدان رد الفعل الوضعي وتصحيح المنعكس عن طريق لف الحجرة برفق حتى يتم وضع الماوس على ظهره.
2. ضع الماوس في وضع ضعيف على طاولة الجراحة. ضع أنف الفأر في قناع تخدير متصل بدائرة Bain معدلة مع أنبوبها الداخلي المتصل بمبخر isoflurane. للحفاظ على التخدير ، استخدم 1-2٪ إيزوفلوران في الأكسجين بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة. تخلص من بخار التخدير الزائد من الماوس عبر الأنبوب الخارجي للقناع واسحبه من خلال علبة من الفحم المنشط ، الذي يمتص غاز التخدير الزائد.
3. عند تحقيق التخدير الكامل ، حقن الفنتانيل للتسكين (0.1 μجم / 25 جم من وزن الجسم i.p.).
4. عندما لا يمكن اكتشاف منعكس قرصة إصبع القدم ، قم بعمل قطع واضح من jugulum إلى الارتفاق باستخدام مقص القزحية لإزالة الفراء والجلد. قم بعمل قطع آخر من اليسار إلى اليمين تحت الضلوع باستخدام مقص القزحية لفتح البطن بعناية.
5. حياة الخنجري قليلا باستخدام ملقط منحني للسماح بقطع الحجاب الحاجز من اليسار إلى اليمين دون إصابة أي أعضاء. قطع القفص الصدري في خط إبطي وسطي على كلا الجانبين باستخدام مقص القزحية لقلبه بشكل قحفي وللسماح بالوصول إلى القلب.
6. قطع الوريد الأجوف السفلي ونزول الشريان الأورطي الصدري على مستوى الحجاب الحاجز باستخدام مقص القزحية. ثقب القلب بإبرة 27 G في منطقة القمة ثم دفع الإبرة بعناية في البطين الأيسر (LV). قم بحقن 5-10 مل من برنامج تلفزيوني مثلج برفق في LV لتخلل القلب.
   ملاحظة: يجب أن يتحول لون القلب من الأحمر إلى الرمادي مما يشير إلى نجاح التروية مع برنامج تلفزيوني.
7. ارفع قمة القلب بعناية باستخدام ملقط يسمح بقطع الأوعية الكبيرة وإزالة القلب.
8. استئصال القلب عن طريق قطع الشرايين والأوردة الكبيرة بعيدا عن القلب قدر الإمكان لتجنب أي ضرر للوريد الأجوف العلوي (SVC). حافظ على SVC لأنه سيكون بمثابة معلم مهم أثناء المعالجة اللاحقة.
9. بعد إزالة القلب ، قم بإيقاف تشغيل مبخر إيزوفلوران.
10. ضع القلب في طبق تشريح مملوء بالجليد البارد PBS تحت مجهر التشريح. بعد تحديد اليسار / اليمين والأمامي / الخلفي للقلب ، أدر القلب مع الجزء الأمامي من القلب في أسفل الطبق (لفضح الأوعية الكبيرة الموجودة في الخلف).
11. شل حركة القلب عن طريق وضع دبابيس صغيرة من خلال القمة والزائدة الأذينية اليسرى (LAA) في الأغاروز في الجزء السفلي من طبق التشريح (الشكل 2 أ). باستخدام ملاقط ومقص دقيق ، قم بإزالة الأنسجة غير القلبية بعناية حول SVC والوريد الأجوف السفلي (IVC) (على سبيل المثال ، الرئتين والدهون والتأمور) لكشف المنطقة بين الأجوف (الشكل 3 أ).
12. قم بإزالة غالبية البطينين عن طريق قطع الأخدود بين البطينين والأذينين بالتوازي مع المقص الدقيق. الحفاظ على جزء صغير من أنسجة البطين للتحميل في وقت لاحق على حلقة زجاج شبكي.
13. للتثبيت والجفاف ، ضع العينة (التي تحتوي على الأذينين و SVC و IVC) في 4٪ PFA طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
14. في اليوم التالي ، انقل القلب إلى محلول سكروز 15٪ لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
15. في اليوم التالي ، انقل القلب إلى محلول سكروز 30٪ لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة للتثبيت والجفاف في الخطوة 2.13 و 2.14 و 2.15 ، تترك العينات عند 4 درجات مئوية دون مزيد من التحريك أو التأرجح.

3. تلطيخ المناعي الكامل

1. اغسل القلب في 1٪ Triton X-100 المخفف في PBS وكتل ونفاذه في محلول مانع (الجدول 1) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. ضع القلب في أنبوب سعة 1.5 مل واحتضنه بأرنب مضاد للفأر connexin-43 (تخفيف 1: 200) وأجسام مضادة للفأر HCN4 (تخفيف 1: 200) مخففة بمحلول مانع لمدة 7 أيام عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يجب اختبار التركيز الأمثل للأجسام المضادة الأولية قبل استخدام أوراق البيانات كاتجاه. يمكن أيضا تلطيخ مولدات الضد الأخرى المثيرة للاهتمام في هذه الخطوة ، طالما أن الأنواع المضيفة لمولد الضد الأولي تختلف عن الأنواع الأخرى. قد يساعد التركيز العالي ل Triton X-100 في الحصول على تلطيخ أكثر كفاءة بالأجسام المضادة كما هو موضح قبل¹⁰ ، ولكن قد يتم تحديد التركيز بشكل فردي.
3. بعد 7 أيام ، قم بإزالة المحلول الذي يحتوي على أجسام مضادة أولية باستخدام ماصةوغسل القلب بمحلول Triton X-100 1٪ 3 مرات (في كل مرة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري).
4. بعد الغسيل ، احتضان القلب = مع Alexa Fluor 488 الماعز المضادة للفئران IgG (تخفيف 1: 200) و Alexa Fluor 647 الماعز المضادة للأرانب IgG (تخفيف 1: 200) لمدة 7 أيام عند 4 درجات مئوية.
5. بعد 7 أيام ، قم بإزالة كل المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية باستخدام ماصة. ثم اغسل القلب باستخدام محلول الغسيل (الجدول 1) 3 مرات (في كل مرة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري).
6. لتلطيخ النواة ، احتضان القلب في محلول DAPI (10 ميكروغرام / مل) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
7. في اليوم التالي ، اغسل القلب بمحلول الغسيل 3 مرات (في كل مرة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري).
   ملاحظة: بالنسبة للحجب والنفاذية وحضانة الأجسام المضادة وتلطيخ DAPI في الخطوة 3.1 و 3.2 و 3.4 و 3.6 ، اترك العينات في حالة مستقرة في 4 درجات مئوية ، دون الحاجة إلى التحريك. يمكن الحفاظ على الأنسجة الملطخة مغطاة بالكامل بمحلول الغسيل عند 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء لبضعة أيام حتى التصوير في المجهر متحد البؤر.

4. المجهر متحد البؤر

1. تحضير حلقات زجاج شبكي وملء مع البلاستيسين (الشكل 1). في وسط البلاستيسين يتم تشكيل أخدود صغير في الوسط لتحميل القلب. اصنع أخدودا ضحلا ، حيث سيكون من الأسهل الحصول على مستوى تصوير مسطح ، وضبط المساحة وتجنب فقاعات الهواء بين العينة وأغطية الغطاء في الخطوة 4.4.
2. استخدم نفس عينة القلب لتصوير كل من SAN و AVN بالتتابع. بالنسبة لتصوير SAN ، قم بتحميل القلب مباشرة بينما بالنسبة للتصوير اللاوعائي ، قم بإجراء تشريح مجهري من قبل.
   1. تصوير SAN
      1. تحديد SAN من خلال المعالم التشريحية: يقع على الجانب الظهري من القلب داخل المنطقة بين الأجوف (المنطقة الواقعة بين الوريد الأجوف العلوي والسفلي). الكريستا الطرفية (CT) هي خط العضلات بين SAN و RAA.
      2. ضع القلب في أخدود البلاستيسين بحيث يكون الجزء الخلفي من القلب متجها لأعلى. أضف PBS إلى القلب لإزاحة كل الهواء داخل التجويف حتى يتم تغطية القلب بالكامل ب PBS (عادة ما تكون بضع قطرات من PBS كافية).
      3. تحت مجهر التشريح ، اضغط برفق على RAA و LAA والأجزاء المتبقية من البطين الأيسر في البلاستيسين لإصلاح القلب. تأكد من أن المنطقة الكاملة بين الأجوف ومحطة crista يمكن رؤيتها بوضوح (لا تغطيها البلاستيسين). تظهر المنطقة التي سيتم تصويرها في الشكل 3 أ.
   2. التصوير اللاوعائي
      1. بعد الانتهاء من تصوير SAN ، تذكر نفس العينة واستخدامها لاحقا للتصوير AVN. للتشريح المجهري اللاوعائي ، ضع القلب = على طبق تشريح تحت مجهر التشريح.
      2. قم بتوجيه القلب بحيث يكون الجانب الأيمن متجها لأعلى (بما في ذلك الأجزاء المتبقية من البطين الأيمن). ضع دبابيس من خلال الجزء المتبقي من الجدار الخالي من الجهد المنخفض (الموجود الآن في الأسفل) لشل حركة الأنسجة (الشكل 2 ب).
      3. اقطع الجدار المتبقي الخالي من المركبات الترفيهية لأعلى من خلال الصمام ثلاثي الشرف والوريد الأجوف العلوي. ثم اقلب RV و RA بعيدا لفضح الحاجز بين البطينين وبين الأذينين. (الشكل 3 ب)
         ملاحظة: انتبه إلى عدم إتلاف الجيب التاجي (CS) ، لأنه معلم تشريحي مهم للعثور على مثلث كوخ الذي يسمح بعد ذلك بتحديد موقع التنخر اللاوعائي. يمتد CS بشكل مستعرض في الأخدود الأذيني البطيني الأيسر على الجانب الخلفي من القلب ، وتقع فتحة CS بين IVC والصمام ثلاثي الشرف في الجزء السفلي من الحاجز بين الأذينين (الشكل 3A و B).
      4. حدد مثلث كوخ الذي يمكن العثور عليه على سطح الشغاف للأذين الأيمن ، ويحده من الأمام الخط المفصلي لنشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف (TV) ، وخلفيا وتر تودارو. تتكون القاعدة من فتحة الجيب التاجي (الشكل 3 ب). نظرا لأن هذه هي المنطقة المستهدفة لتصوير AVN ، فيجب أن تكون مرئية بوضوح.
      5. انقل القلب إلى أخدود البلاستيسين داخل حلقة زجاج شبكي مع تعرض مثلث كوخ بوضوح (أي غير مغطى بالبلاستيسين). اضغط برفق على الأنسجة حول مثلث كوخ في البلاستيسين لإصلاح العينة. أضف PBS إلى القلب لإزاحة كل الهواء داخل التجويف حتى يتم تغطية القلب بالكامل ب PBS (عادة ما تكون بضع قطرات من PBS كافية).
3. ضع السيليكون على حواف حلقات زجاج شبكي للسماح بتغطية القلوب المحملة داخل حلقات زجاج شبكي مملوءة بالبلاستيك مع زلات غطاء.
4. اضغط برفق على الجانب الخلفي من البلاستيسين للضغط على أجزاء من PBS وربط القلب بغطاء الغطاء مع تجنب أي فقاعات هواء داخل منطقة التصوير.
   ملاحظة: تأكد من عدم طي المناطق ذات الأهمية وتغطيتها أثناء الضغط على الجانب الخلفي من البلاستيسين. يعد مستوى التصوير المسطح بدون الضغط الزائد للعينة ضروريا للحفاظ على التشريح وللتصوير البؤري المناسب للعينات. بالنسبة ل SAN ، من المهم التأكد من أن المنطقة بين الفجوات مكشوفة بوضوح. بالنسبة ل AVN ، يجب أن يكون مثلث كوخ مكشوفا بالكامل.
5. ضع عينات تلطيخ التثبيت بالكامل رأسا على عقب على منصة المجهر متحد البؤر. يوجد SAN / AVN المكشوف المتصل بزلة الغطاء الآن في الجزء السفلي من منصة المجهر (الشكل 4).
   ملاحظة: لالتقاط الصور ، نستخدم Carl Zeiss LSM800 مع وحدة Airyscan وبرنامج ZEN 2.3 SP1 الأسود.
6. اختر لوحة "BP420-480 + LP605" لإثارة Alexa Fluor 647 المترافق المضاد ل HCN4. تختلف كسب سيد من 650-750.
7. التقط صورة عامة لمنطقة SAN وAVN بالكامل باستخدام وظيفة Tile Scan . ثم حدد المنطقة الإيجابية HCN4 بالنقر فوق وإضافة مربع على صورة النظرة العامة حول منطقة الاهتمام التي سيتم مسحها ضوئيا.
8. تحقق من المعلمات ، بما في ذلك الألواح والكسب الرئيسي للقنوات المتبقية (Alexa Fluor 488 و DAPI) للمجهر متحد البؤر واضبطها كما هو موضح في الخطوة 4.6.
9. اضبط التركيز ببطء من أعلى إلى أسفل العينة لمعاينة العينة بأكملها ولتعيين الأول والأخير لنطاق Z-stack. اضبط الفاصل الزمني الأمثل ل Z-stack بناء على سمك العينة البصرية. نستخدم هدفا 20x ، و 0.8-1 ميكرومتر كفاصل زمني ل Z-stack.
10. بعد تعيين جميع المعلمات بشكل صحيح ، قم بمسح المنطقة بأكملها من SAN و AVN.
11. إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للصور باستخدام البرنامج (على سبيل المثال ، الإصدار 8.4.2 من Imaris).
    1. حدد معالجة الصور | الطرح الأساسي لإزالة تلطيخ الخلفية.
    2. حدد إنشاء السطح على الإعداد للقناة المحددة والمنطقة محل الاهتمام للمعالجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، يمكن إجراء التصوير المجهري متحد البؤر لكل من SAN و AVN بشكل موثوق. يسمح التلوين المحدد لنظام التوصيل باستخدام الأجسام المضادة الفلورية التي تستهدف HCN4 وتلطيخ عضلة القلب العاملة باستخدام الأجسام المضادة الفلورية التي تستهدف Cx43 بتحديد واضح...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تمت دراسة تشريح القلب تقليديا باستخدام أقسام نسيجية رقيقة¹¹. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تحافظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد لنظام التوصيل ، وبالتالي ، توفر فقط معلومات 2D. يسمح بروتوكول تلطيخ التألق المناعي الكامل الموصوف هنا بالتغلب على هذه القيود ويمكن استخدامه بشكل روتيني لتصوير...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent Scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL	Eppendorf	Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	VWR	10836-004
Laser Scanning Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Software
Imaris 8.4.2	Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black	Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	Sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	Falcon	352070
5ml Syringe	Braun	4606108V
Cover slips	Thermo Scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158	Components of TEA
16% Formaldehyde Solution	Thermo Scientific	28908	use as a 4% solution
Acetic acid	Merck	100063	Components of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Normal goat serum	Sigma	NS02L
Sucrose	Sigma	S1888-1kg
Tris-base	Roche	TRIS-RO	Components of TEA
Triton X-100	Sigma	T8787-250ml	Diluted to 1% in PBS
Tween 20	Sigma	P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL	Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL	Cp-pharma	31303
Oxygen 5 L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Cell Signaling Technology	#4412	diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647	Invitrogen	#A-21247	diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43	Sigma	C6219	diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)	Invitrogen	MA3-903	diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring			Self-designed and 3D printed
Plasticine	Cernit	49655005
Silikonpasten, Baysilone	VWR	291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6	The Jackson Laboratory