JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف الأدوات والأساليب الحسابية التي تسمح بتصور وتحليل بيانات الصور ثلاثية ورباعية الأبعاد لأجنة الفئران في سياق الاستطالة المحورية والتقسيم ، والتي تم الحصول عليها عن طريق التصوير المقطعي بالإسقاط البصري ، وعن طريق التصوير الحي وتلطيخ التألق المناعي الكامل باستخدام المجهر متعدد الفوتونات.

Abstract

Somitogenesis هو السمة المميزة للتطور الجنيني الفقاري. لسنوات ، كان الباحثون يدرسون هذه العملية في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية باستخدام مجموعة واسعة من التقنيات التي تشمل النهج خارج الجسم الحي وفي المختبر. ومع ذلك ، لا تزال معظم الدراسات تعتمد على تحليل بيانات التصوير ثنائية الأبعاد (2D) ، مما يحد من التقييم السليم لعملية تنموية مثل الامتداد المحوري وتكوين السوميتوجينيسيس التي تنطوي على تفاعلات ديناميكية للغاية في مساحة 3D معقدة. هنا نصف التقنيات التي تسمح للفأر بالحصول على التصوير الحي ، ومعالجة مجموعة البيانات ، والتصور والتحليل في 3D و 4D لدراسة الخلايا (على سبيل المثال ، أسلاف الجلد المتوسط العصبي) المشاركة في هذه العمليات التنموية. كما نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري والمجهر المناعي الكامل في أجنة الفئران (من إعداد العينات إلى الحصول على الصور) ونظهر خط أنابيب قمنا بتطويره لمعالجة وتصور بيانات صورة 3D. نحن نوسع نطاق استخدام بعض هذه التقنيات ونسلط الضوء على ميزات محددة لمختلف البرامج المتاحة (على سبيل المثال ، فيجي / ImageJ ، Drishti ، Amira و Imaris) التي يمكن استخدامها لتحسين فهمنا الحالي للامتداد المحوري وتشكيل somite (على سبيل المثال ، إعادة بناء 3D). بشكل عام ، تؤكد التقنيات الموصوفة هنا على أهمية تصور وتحليل البيانات ثلاثية الأبعاد في البيولوجيا التنموية ، وقد تساعد الباحثين الآخرين على معالجة بيانات الصور ثلاثية الأبعاد و 4D بشكل أفضل في سياق الامتداد المحوري للفقاريات وتجزئتها. وأخيرا، يستخدم العمل أيضا أدوات جديدة لتسهيل تعليم التطور الجنيني للفقاريات.

Introduction

تشكيل محور جسم الفقاريات هو عملية معقدة للغاية وديناميكية تحدث أثناء التطور الجنيني. في نهاية عملية المعدة [في الفأر ، حول اليوم الجنيني (E) 8.0] ، تصبح مجموعة من الخلايا السلفية الفوقية المعروفة باسم أسلاف الجلد المتوسط العصبي (NMPs) محركا رئيسيا للامتداد المحوري في تسلسل الرأس إلى الذيل ، مما يولد الأنبوب العصبي وأنسجة الجلد المتوسط الباراكسي أثناء تكوين الرقبة والجذع والذيل1،2،3،4 . ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن الموقع الذي تشغله هذه NMPs في الأرومة الذيلية يلعب دورا رئيسيا في قرار التمايز إلى الأديم المتوسط أو الأديم العصبي5. على الرغم من أننا نفتقر حاليا إلى بصمة جزيئية دقيقة ل NMPs ، إلا أنه يعتقد عموما أن هذه الخلايا تشترك في التعبير عن T (Brachyury) و Sox2 5,6. الآليات الدقيقة التي تنظم قرارات مصير NMP (أي ما إذا كانت تتخذ طرقا عصبية أو متوسطة الجلد) بدأت فقط في التحديد بدقة. تعبير Tbx6 في منطقة الخط البدائي هو علامة مبكرة على قرار مصير NMP ، حيث يشارك هذا الجين في تحريض ومواصفات الأديم المتوسط 6,7. ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن خلايا الأديم المتوسط المبكرة تعبر عن مستويات عالية من Epha18 ، وإشارات Wnt / β-catenin ، وكذلك Msgn1 ، كما تبين أنها تلعب أدوارا مهمة في تمايز الأديم المتوسط الباراكسي وتكوين السوميت 9,10. من المؤكد أن التحليل المكاني الزماني الكامل ل NMPs على مستوى خلية واحدة سيكون مفيدا لفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في مواصفات الأديم المتوسط بشكل كامل.

تشكيل سوميت (سلائف الفقرات) هو سمة رئيسية من سمات الفقاريات. أثناء الاستطالة المحورية ، يصبح الأديم المتوسط الباراكسالي مجزأ في سلسلة من الوحدات المتكررة الثنائية المعروفة باسم somites. يختلف عدد السوميت والوقت اللازم لتشكيل شرائح جديدة بين الأنواع11,12. يتضمن تكوين السوميتوجينيسيس تذبذبات إشارات دورية (تعرف باسم "ساعة التجزئة") يمكن ملاحظتها من خلال التعبير الدوري لعدة جينات من مسارات إشارات Notch و Wnt و Fgf في الأديم المتوسط قبل الوهمي (على سبيل المثال ، Lfng) 11,12. يفترض النموذج الحالي لتكوين السوميتوجينيسيس أيضا وجود "جبهة موجية للنضج" ، وهي سلسلة من تدرجات الإشارات المعقدة التي تنطوي على إشارات Fgf و Wnt وحمض الريتينويك التي تحدد موضع الحدود الخلفية لكل سوميت جديد. ولذلك فإن التفاعل المنسق بين "ساعة التجزئة" و "الجبهة الموجية للنضج" أمر أساسي لتوليد وحدات سلائف الفقرات هذه لأن الاضطرابات في هذه العمليات المورفوجينية الرئيسية يمكن أن تؤدي إلى الفتك الجنيني أو إلى تكوين تشوهات خلقية (مثل الجنف) 13،14،15.

على الرغم من التطورات الحديثة الكبيرة في تقنيات التصوير وطرق وبرامج تحليل الصور الحيوية ، فإن معظم دراسات الاستطالة المحورية وتكوين السميتوجينيا لا تزال تعتمد على بيانات الصور ثنائية الأبعاد المفردة / المعزولة (على سبيل المثال ، الأقسام) ، والتي لا تسمح بتصور كامل متعدد الأبعاد للأنسجة ويعقد التمييز الواضح بين التشوهات المرضية (أي بسبب الطفرات) مقابل التباين المورفولوجي الطبيعي الذي يحدث أثناء التطور الجنيني16 . وقد كشف التصوير في 3D بالفعل عن حركات مورفوجينية جديدة ، لم يتم تحديدها سابقا من خلال الطرق القياسية ثنائية الأبعاد17،18،19،20 ، مما يسلط الضوء على قوة التصوير في toto لفهم آليات تكوين الفقاريات والامتداد المحوري.

يعد الفحص المجهري 3D و 4D لأجنة الفئران ، وخاصة التصوير الحي ، تحديا تقنيا ويتطلب خطوات حاسمة أثناء إعداد العينات والحصول على الصور والمعالجة المسبقة للبيانات من أجل السماح بتحليل مكاني وزماني دقيق وذي مغزى. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للتصوير الحي وتلطيخ التألق المناعي الكامل لأجنة الفئران ، والذي يمكن استخدامه لدراسة كل من NMPs وخلايا الجلد المتوسط أثناء التمديد المحوري والتقسيم. بالإضافة إلى ذلك ، نصف أيضا بروتوكولا للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري (OPT) للأجنة والأجنة الأكبر سنا ، والذي يسمح ب 3D في تصور toto وتحديد كمية التشوهات المرضية التي يمكن أن تنتج عن مشاكل أثناء تكوين السوميتوجينيسيس (على سبيل المثال ، اندماج العظام والجنف) 13،21،22. أخيرا ، نوضح قوة إعادة بناء التصوير 3D في دراسة وتدريس تجزئة الفقاريات والاستطالة المحورية.

Protocol

اتبعت التجارب التي شملت الحيوانات التشريعات البرتغالية (Portaria 1005/92) والأوروبية (التوجيه 2010/63/EU) المتعلقة بالإسكان والتربية والرعاية الاجتماعية. وقد استعرضت المشروع ووافقت عليه لجنة الأخلاقيات التابعة ل "معهد غولبنكيان دي سينسيا" والكيان الوطني البرتغالي "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (مرجع الترخيص: 014308).

1. إعداد عينة للتصوير 3D و 4D

ملاحظة: نقدم هنا وصفا مفصلا حول كيفية تشريح وإعداد أجنة الفئران E8.25 إلى E10.5 للتصوير الحي (1.1) ، والأجنة E7.5 إلى E11.5 للفحص المجهري المناعي الكامل (1.2) والأجنة للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري (1.3).

  1. إعداد العينات للتصوير الحي
    1. تشريح جنين الفأر والتحضير للتصوير الحي (على سبيل المثال ، مراسل LuVeLu 23).
      1. تشريح أجنة الفئران بين E8.25 و E10.5 في وسط M2 المسخن مسبقا (37 درجة مئوية). قم بإزالة كيس صفار البيض بلطف باستخدام ملقط نظيف واغسل الجنين مرة واحدة بوسط M2 طازج لإزالة الدم والحطام الناتج أثناء التشريح.
        ملاحظة: من المهم تجنب إتلاف الجنين بأي شكل من الأشكال، وإلا فإنه لن يتطور بشكل صحيح أثناء إجراء التصوير الحي.
      2. أثناء إجراء التصوير الحي ، احتضن الأجنة في غرفة ساخنة (37 درجة مئوية) ، في بيئة 65٪ O 2 و 5٪ CO 2 (N 2 متوازنة) ، في وسط DMEM منخفض الجلوكوز مع 10٪ مصل بقري للجنين محدد HyClone ،2 mM L-glutamine و 1٪ penicillin-streptomycin.
        ملاحظة: تسمح ظروف الاستزراع هذه بحدوث التطور الجنيني لمدة 10 ساعات تقريبا. قد تسمح البروتوكولات الأخرى 9,10 ، باستخدام ظروف ثقافية مختلفة ، بفترات أطول.
  2. إعداد عينة للفحص المجهري المناعي
    1. تشريح جنين الفأر وإجراء التثبيت
      1. تشريح أجنة الفئران من E7.5 إلى E11.5 إما في وسط الفوسفات البارد (4 درجات مئوية) المخزن مؤقتا (PBS) أو وسط M2. بعد إزالة جميع الأغشية خارج الجنين (على سبيل المثال ، غشاء Reichart أو كيس صفار البيض) ، اغسل الجنين في PBS طازج لإزالة الدم والحطام الناتج أثناء إجراء التشريح.
      2. إصلاح الأجنة عند 4 درجات مئوية ، في 4 ٪ بارافورمالديهايد (PFA) في PBS ، للوقت المحدد في الجدول 1.
        تنبيه - يجب التعامل مع PFA داخل غطاء الدخان
        مرحلة النمووقت التثبيت الموصى به (PFA 4٪)
        ه٧,٥1h30
        ه٨,٥2(ساعة)
        ه٩,٥3 ساعات
        ه١٠,٥4(ساعة)
        ه١١,٥4(ساعة)
        الجدول 1 - أوقات تثبيت الأجنة في مراحل النمو المختلفة
      3. بعد التثبيت ، اغسل الأجنة مرتين على الأقل (5-10 دقائق لكل منهما) في PBS لإزالة PFA تماما. في هذه المرحلة ، يمكن أخذ الأجنة مباشرة إلى بروتوكول تلطيخ التألق المناعي (الخطوة 1.2.2) أو يمكن تجفيفها وتخزينها للاستخدام المستقبلي (الخطوة 1.2.1.4).
      4. إذا لزم الأمر، قم بتخزين الأجنة عند -20 درجة مئوية في الميثانول بنسبة 100٪ لفترات طويلة.
        1. لتحسين الحفاظ على الأنسجة ، جفف الجنين تدريجيا مع زيادة بنسبة 10٪ في تركيز الميثانول (المخفف في PBS) ، كل خطوة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر ، حتى تصل إلى 100٪ ميثانول. استبدل الميثانول بنسبة 100٪ مرة واحدة باستخدام أليكوت طازج.
        2. استعادة الأجنة المجمدة عن طريق الإماهة بعد سلسلة عكس الميثانول / PBS ، كل خطوة 10 دقائق في RT على شاكر ، ومع الغسيل النهائي في PBS (مرتين ، 5-10 دقائق لكل منهما) قبل الدخول في بروتوكول تلطيخ المناعة.
          تنبيه - يجب التعامل مع الميثانول داخل غطاء الدخان.
    2. تلطيخ التألق المناعي الكامل
      ملاحظة: تم تكييف بروتوكول تلطيخ التألق المناعي التالي من الإجراء الموصوف في Osorno et al.24. يجب إجراء جميع عمليات الغسيل على شاكر. بعد خطوة الحجب ، يتم إجراء الحضانات عند 4 درجات مئوية لضمان سلامة / الحفاظ على الأجسام المضادة.
      1. اغسل الأجنة ثلاث مرات (30 دقيقة لكل منها) في PBS التي تحتوي على 0.1٪ Triton X-100 (0.1٪ PBST) ثم مرة واحدة في 0.5٪ PBST لمدة ساعة واحدة (RT) لتحسين النفاذية.
      2. لتقليل الارتباط غير المحدد ، اغسل في 1 M glycine في PBS (الرقم الهيدروجيني 7.5) لمدة 30 دقيقة في RT.
      3. يغسل ثلاث مرات في 0.1٪ PBST لمدة 30 دقيقة لإزالة الجلايسين تماما.
      4. احتضان الأجنة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في محلول مانع يحتوي على: 3٪ من المصل (من الأنواع الحيوانية التي تم إنتاج الأجسام المضادة الثانوية فيها) ، و 1٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) و 0.1٪ من Triton X-100 ، في PBS.
      5. تمييع الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب (عادة 1:200 للأجسام المضادة T و Sox2) وتحضن لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 4 درجات مئوية.
      6. قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل الأجنة ثلاث مرات (30 دقيقة لكل منها) في 0.1٪ PBST عند 4 درجات مئوية. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في محلول الحجب (1:1000) واحتضانها لمدة يومين عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
      7. اغسل الأجنة ست مرات (30 دقيقة لكل منها) بنسبة 0.1٪ PBST عند 4 درجات مئوية.
      8. بالنسبة للتلقيح النووي المضاد ، احتضن الأجنة في 4'،6-Diamidino-2-Phenylindole ، Dihydrochloride (DAPI) ، المخفف 1: 500 في PBST ، بين عشية وضحاها على شاكر عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
      9. أخيرا ، اغسل الأجنة ثلاث مرات (30 دقيقة لكل منها) بنسبة 0.1٪ PBST عند 4 درجات مئوية.
    3. تطهير الأنسجة وإعداد الشرائح
      1. تطهير الأنسجة باستخدام ميثيل ساليسيلات أو خليط من كحول البنزيل مع بنزوات البنزيل (BABB)
        1. قبل التطهير باستخدام ميثيل الساليسيلات أو BAB ، قم بتجفيف الأجنة تماما عن طريق إحضارها إلى 100٪ ميثانول ، من خلال سلسلة ميثانول / PBS تتكون من زيادات متتالية بنسبة 10٪ في تركيز الميثانول (أوقات حضانة مدتها 10 دقائق لكل منها عند 4 درجات مئوية). لتحقيق الجفاف الكامل ، استبدل الميثانول 100٪ بآخر طازج وانتظر لمدة 10 دقائق إضافية.
        2. قم بإجراء تطهير الجنين عن طريق تضمينه في سلسلة من ساليسيلات الميثيل أو BABB في الميثانول مع زيادات متتالية بنسبة 20٪ في التركيز ، وحضانة لمدة 20 دقيقة لكل خطوة. عندما يصل محلول الساليسيلات الميثيل أو BABB إلى 100٪ ، قم بإجراء تغييرين إضافيين للحصول على محلول جديد.
          تحذير: يجب التعامل مع كل من ميثيل الساليسيلات و BABB داخل غطاء الدخان.
          ملاحظة: من أجل التطهير السليم ، من الضروري أن تكون الأجنة مجففة بالكامل. من الضروري أيضا أن يتم خلط الميثانول بالكامل مع ميثيل ساليسيلات أو BABB في سلسلة محلول المقاصة.
        3. بعد أن تصبح الأجنة شفافة تماما ، تعامل معها بشكل فردي ، باستخدام منظار مجسمي فلوري بشكل تفضيلي ، لتقليل فرص تلف الأنسجة.
        4. للتصوير، قم بتركيب الأجنة إما في شريحة زجاجية مقعرة منخفضة 75 مم × 25 مم أو زجاج غلاف 20 مم × 60 مم # 1.5. سيسمح الخيار الأخير بالتصوير من كلا الجانبين ، إذا لزم الأمر ، لكنه أكثر هشاشة ويصعب إغلاقه. انقل الأجنة إلى شرائح المجهر باستخدام مسواك أو طرف قطني ناعم أو ماصة باستور أو أي أداة أخرى مماثلة.
        5. لتجنب ضغط الأجنة ، أضف الفواصل المصنوعة من شظايا الغطاء الزجاجية رقم 1 (بسمك 170 ميكرومتر) أو السيليكون أو الغسالات المعدنية الرقيقة. ثم أضف قطرة من وسط التركيب ، وقم بتغطيتها بغطاء # 1 أو # 0 20x20 مم وختم.
        6. إذا كنت تستخدم فواصل زجاجية أو معدنية ، فقم بالختم بالبارافين المذاب لتحقيق استقرار أفضل للتحضير - لا تغلق بطلاء الأظافر لأنه يذوب مع ميثيل الساليسيلات أو BABB. لتجنب الفقاعات ، ضع الغطاء على جانب واحد ثم حركه تدريجيا وبلطف جانبيا ؛ إضافة المزيد من المتوسطة إذا لزم الأمر.
          ملاحظة: يرجى مشاهدة الفيديو لفهم أفضل لكيفية التعامل مع الأجنة التي تم تطهيرها وكيفية تركيبها على شريحة المجهر.
      2. تنظيف الأنسجة باستخدام RapiClear
        1. عند استخدام RapiClear، لا يلزم جفاف الجنين. بعد الخطوة 1.2.2.9 ، ضع الأجنة في وسط شريحة زجاجية مقعرة للاكتئاب 75 مم × 25 مم ، وقم بإزالة كل PBST في شريحة الاكتئاب المجهري وأضف 200 ميكرولتر من محلول المقاصة.
        2. بعد 10 دقائق محمية من الضوء ، عندما تبدأ الأجنة في الشفافية ، استبدل محلول المقاصة ، وانتظر 20 دقيقة إضافية (محمية من الضوء) ثم قم بتغطيتها ، بدءا من جانب واحد وتتحرك بلطف نحو الجانب الآخر.
          ملاحظة: قد يمتد وقت مسح الجنين بالكامل من بضع دقائق إلى المبيت اعتمادا على مرحلة الأجنة وحجمها. أيضا ، يجب أن تتم العملية برمتها تحت المجهر المجسم. لفهم المقاصة وإعداد شريحة المجهر بشكل أفضل ، يرجى الاطلاع على بروتوكول الفيديو.
  3. إعداد العينات للتصوير المقطعي بالإسقاط البصري
    ملاحظة: تم تكييف الإجراءات التالية من البروتوكولات السابقة19,25,26. سيتم وصف البروتوكول لتحليل أجنة الفئران E18.5.
    1. تشريح جنين الفأر وإجراء التثبيت
      1. تشريح أجنة الفئران E18.5 في PBS الباردة (4 درجة مئوية) ، وإزالة جميع الأغشية خارج الجنين ثم غسل الأجنة عدة مرات في PBS جديدة لإزالة الدم والحطام الناتج أثناء إجراء التشريح.
      2. إصلاح الأجنة في 4 ٪ PFA المصنوعة في PBS ، في 4 درجة مئوية لمدة 5 إلى 7 أيام.
      3. اغسل الأجنة مرة واحدة (15 دقيقة) في PBS ثم ثلاث مرات (30 دقيقة لكل منها) في الماء منزوع المعادن أو PBS. قم بإجراء عمليات الغسيل على شاكر.
      4. تجفيف الأجنة عن طريق الحضانة (سلسلة 25 دقيقة في RT على شاكر) في محاليل الميثانول ذات التركيزات المتزايدة (10٪ زيادات مخففة في المياه منزوعة المعادن أو PBS) حتى 100٪ ميثانول.
      5. قم بتغيير محلول الميثانول 100٪ (استخدم أليكوت طازج) ثلاث مرات (20 دقيقة لكل منهما) لضمان الجفاف الكامل. يمكن بعد ذلك تخزين الأجنة عند -20 درجة مئوية أو نقلها مباشرة (بعد يوم واحد) إلى عملية التبييض (الخطوة 1.3.2).
    2. عملية التبييض
      1. لإزالة التصبغ الطبيعي ، احتضن الأجنة (بشكل منفصل) على شاكر ، أولا لمدة يوم واحد في 5٪ H 2 0 2 في الميثانول ثم في 10٪ H 2 02في الميثانول لمدة تصل إلى 3 أيام حتى تفقد الأجنة كل التصبغ الطبيعي.
        تنبيه: يجب التعامل مع H2O2 بلطف داخل غطاء الدخان. محلول التبييض الذي يحتوي على H2 O2 عند ملامسته للعينة يخلق أبخرة ، وبالتالي ، يجب أن يظل الأنبوب الذي يحتوي على الأجنة مفتوحا أثناء إجراء التبييض بأكمله. تشير بعض بروتوكولات التبييض إلى الجمع بين H 2 O2والفورماميد. إذا تم استخدام هذا البديل ، فيجب توخي الحذر الشديد ، لأن إضافة H 2 O2إلى الفورماميد غير المخفف يمكن أن يؤدي إلى انفجار.
      2. قم بإعادة ترطيب الأجنة تدريجيا في سلسلة عكسية من الميثانول (مع انخفاض بنسبة 10٪) في المياه منزوعة المعادن ، ويتم احتضان كل منها لمدة 20 دقيقة في RT على شاكر ، وأخيرا تغسل ثلاث مرات (30 دقيقة لكل منها) في ماء منزوع المعادن. انتظر يوما واحدا ، وقم بتغيير المياه منزوعة المعادن والمضي قدما.
        ملاحظة: انظر الشكل التكميلي 1 للحصول على نتيجة تمثيلية لعملية التبييض.
    3. بروتوكول إزالة المعادن
      ملاحظة: إزالة المعادن اختيارية ولكن يوصى بها للأجنة أو الجراء.
      1. قم بإزالة المعادن عن طريق غسل الأجنة في 0.1 M EDTA عند 42 درجة مئوية لبضع ساعات [انظر أيضا Cho et al.27] تليها خمس غسلات (20 دقيقة لكل منها) بالماء الخالي من المعادن لإزالة EDTA تماما. تنفيذ جميع الإجراءات على شاكر.
    4. إعداد العينات للمسح
      1. تضمين الأجنة في كتلة الأغاروز بنسبة 1٪. لإعداد هذه الكتل ، املأ أنبوبا بلاستيكيا أو حقنة سعة 50 مل (بناء مساحة أسطوانية عن طريق قطع جانب خروج المحقنة واستخدام المكبس لسد الجانب الآخر) بالأغاروز المذاب ، ضع الجنين في الأغاروز في وضع رأسي واحتفظ بهذا الوضع في وسط الكتلة بمساعدة الملقط أثناء تصلب الأغاروس.
      2. ضع القالب مع الكتلة عند 4 درجات مئوية (30 دقيقة) حتى يهتز الأغاروز بالكامل. في حالة وضع الجنين بشكل غير صحيح داخل الكتلة أو ظهور فقاعات الهواء ، قم بإذابة الأغاروز عن طريق وضع الكتلة عند 50 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، وكرر الإجراء في اليوم التالي.
      3. قم بإزالة كتلة الأغاروز مع الجنين من القالب وضعها في وعاء به ماء منزوع المعادن. استبدله بالماء العذب الخالي من المعادن بعد 15 دقيقة.
      4. قبل التطهير باستخدام BAB ، قم بتجفيف العينة. للحفاظ على سلامة الأنسجة بشكل أفضل ، قم بإجراء جفاف الجنين تدريجيا مع زيادة بنسبة 10٪ في تركيز الميثانول (المخفف في الماء منزوع المعادن أو PBS) ، كل خطوة لأكثر من 45 دقيقة في RT على شاكر ، حتى تصل إلى 100٪ ميثانول.
      5. تغيير الميثانول 100 ٪ (استخدام أليكوت طازجة) ، أولا أربع مرات في فترات ساعة واحدة ثم مرة أخرى في اليوم التالي لضمان الجفاف الكامل.
    5. عملية التطهير وتركيب العينات لتصوير OPT
      1. قم بمسح الأجنة على الخلاط من خلال سلسلة (2.5 ساعة لكل منهما) من محلول BABB في الميثانول ، مع زيادة بنسبة 25٪ في تركيز BABB ، حتى تصل إلى 100٪ BABB.
      2. استبدل محلول BABB بمحلول جديد كل يوم ، حتى يصبح الجنين شفافا تماما. قد تستغرق هذه العملية من 3 إلى 5 أيام. احتفظ بالكتلة التي تحتوي على الجنين ، على شاكر أثناء الإجراء بأكمله. يمكن للأجنة البقاء في محلول BABB بنسبة 100٪ لفترات طويلة.
        ملاحظة: إذا لم يكن الجنين مصابا بالجفاف بشكل صحيح ، فسيصبح شفافا قليلا (مستحلب "أبيض") بعد إضافة BABB لأول مرة. إذا حدث هذا ، عد إلى الميثانول النقي وقم بإجراء غسلتين إضافيتين في الميثانول الطازج. لا تقم أبدا بتبريد العينات أثناء إجراء الجفاف والتطهير ، لأن التغيرات في درجة الحرارة قد تؤدي إلى تكثيف المياه.
      3. قم بإرفاق كتلة الأغاروز التي تم مسحها بالمحور الحركي للماسح الضوئي OPT ، واضبط البصريات للحصول على صورة للجنين بأكمله والمضي قدما في الحصول على مجموعة بيانات إسقاط كاملة19,28.

2. المجهر / الحصول على الصور

  1. للحصول على تصوير 3D و 4D الصحيح ، اختر المجهر الذي يناسب الهدف التجريبي. ويقدم الجدول 2 معلومات عامة للاسترشاد بها خلال عملية الاختيار.
تقنيات الفحص المجهري البصريمبدأ التصويرالهدف التجريبي والاعتبارات
التصوير عريض المجاليستخدم التألق أو الضوء المنعكس أو المنقول.مثالية لنظرة عامة سريعة وعامة على الجنين (على سبيل المثال للفحوصات وتقييم مراحل النمو والأنماط الظاهرية الواضحة). انخفاض عمق المجال ، مقارنة بالسماكة التي يمكن ملاحظتها عند التكبيرات العالية لا يسمح بتفسير أو تحليل دقيق لمورفولوجيا 3D.
البؤري (المسح الضوئي بالليزر; CLSM)يستخدم إضاءة المسح الضوئي بالليزر والكشف عن التألق من خلال ثقب.يسمح بتصوير الشرائح البصرية للعينات ذات العلامات الفلورية ، من الناحية المثالية مع إشارة قوية. التصوير من خلال ثقب يزيل الإشارة من خارج عمق المجال ، مما يسمح بالتمييز الدقيق للمعلومات في 3D. الاستحواذ هو أوامر من حجم أبطأ من المجال العريض ، ولكن مع تباين لا مثيل له وتمييز 3D من المورفولوجيا. الدقة الزمنية العالية غير قابلة للتحقيق لأن الصور يتم الحصول عليها 1 بكسل في المرة الواحدة. جيد للتصوير ثلاثي الأبعاد لأجنة الفئران الثابتة حتى E9.5. يتطلب التصوير من خلال الأديم المتوسط أو السوميت ما قبل السوميتي بأكمله إزالة الأنسجة ، بسبب تشتت الضوء في الأنسجة العميقة. السمية الضوئية والتبييض هو أحد الاعتبارات. يمكن تعويض التبييض الضوئي ، ضمن حدود ، في الخلف. ومع ذلك ، لا يمكن تحديد التأثيرات السامة للضوء في العينات الحية ، وغالبا ما لا يكون من السهل تحديدها. هذا أكثر وضوحا إذا أظهرت العينات تعبيرا منخفضا ، وهناك حاجة إلى قوى ليزر عالية.
تألق الإثارة ثنائي الفوتون (TPEFM)يستخدم إثارة الليزر النبضية القريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR) بدلا من إضاءة الليزر المرئية.يسمح TPEFM بالتقطيع البصري من خلال عينات أكثر سمكا من CLSM. الدقة أقل قليلا ، لكن التباين في الأنسجة العميقة أفضل بكثير ، مما يجعله مثاليا للتصوير الحي لأجنة الفئران. على الرغم من أن TPEFM غالبا ما يعتبر أقل سمية للضوء من CLSM التقليدي ، إلا أنه يتطلب قوى ليزر عالية قد يكون لها أيضا تأثيرات ضارة على الخلايا والأنسجة. مثالية للتصوير ثلاثي الأبعاد للأجنة حتى E11.5 ، على الرغم من أن التصوير من خلال الأديم المتوسط الكامل لا يزال يتطلب إزالة الأنسجة.
متحد البؤرة (قرص الغزل)شكل من أشكال البؤرة البؤرية التي ، بدلا من ليزر واحد ، تستخدم مصادر متعددة تشبه النقاط.يسمح استخدام هياكل متعددة تشبه النقاط بإنشاء شرائح بصرية بشكل أسرع (يمكن تحقيق عدة إطارات في الثانية أو مكدسات في الدقيقة) من CLSM. الاستحواذ هو عمليا في أسرع وقت واسع، مع التمييز 3D معقول. ومع ذلك ، فإنه يسمح فقط بتصوير الأنسجة الأكثر سطحية لجنين الفأر. يسمح بالكشف الأكثر حساسية من CLSM ، مما يجعله بديلا للأجنة ذات التعبير المنخفض عن البروتينات الفلورية.
ورقة خفيفة / مستوى واحد (LSFM / SPIM)بدلا من الإضاءة الواسعة أو التي تشبه النقطة ، تضيء العينة مستوى متعامدا واحدا في كل مرة. في معظم التكوينات ، يسمح بالتصوير من زوايا متعددة.يتطلب أيضا عينات تحمل علامات الفلورسنت. الحصول على شرائح بصرية سريع للغاية (إطارات متعددة في الثانية) ويقلل من آثار السمية الضوئية أو التبييض. ومع ذلك، إذا كانت المشاهدة المتعددة مطلوبة، فقد تتطلب خطوات المعالجة المسبقة اللاحقة لمجموعة البيانات ساعات/أيام من الحساب. يسمح LSFM/SPIM باكتشاف مستويات تعبير أقل من CLSM. مثالية للتصوير 3D من في الأجنة الفأر toto أثناء المعدة. غالبا ما تحتاج العينات إلى تركيبها وصيانتها في تعليق (إعداد غير تقليدي).
التصوير المقطعي بالإسقاط البصري (OPT)لا يتم الكشف عن الشرائح البصرية ولكن يتم حسابها من سلسلة من الصور واسعة المجال للجنين بأكمله من زوايا مختلفة ("الإسقاطات").مثالية للتصوير ثلاثي الأبعاد لأجنة / أجنة الفئران في مرحلة لاحقة (>5 مم) ، ولكن ثابتة وواضحة فقط. لديه ميزة إنتاج مكدسات 3D من الشرائح البصرية لكل من العينات الفلورية وغير الفلورية. مجموعات البيانات متساوية القياس (شرائح ذات دقة متساوية في جميع الأبعاد الثلاثة) مما يجعلها مثالية للتحليل التشريحي. قد يتطلب الحصول على مجموعة بيانات الإسقاط بضع دقائق فقط ، تليها 15-30 دقيقة من إعادة الإعمار.
التصوير المقطعي بالتماسك البصري (OCT)يستخدم إضاءة NIR من خلال العينة للحصول على شرائح بصرية بناء على التداخل مع انعكاس الضوء.يسمح OCT بسهولة التصوير من خلال الأنسجة الحية (على عمق بضعة ملليمترات في العينة دون تباين فلورسنت) بدقة بضع عشرات من الميكرومترات. الاستحواذ سريع جدا (بضع شرائح في الثانية). وعلى الرغم من أنها بديل محتمل للأرض الفلسطينية المحتلة، فإن هذه التقنية ليست متاحة بشكل شائع.
الدقة الفائقة (SR) أو القوة الذرية (AFM) أو التصوير قريب من المجال (NSOM)يعتمد SR عادة على توطين جزيء واحد و AFM / NSOM على أسطح المسح الضوئي بدقة الحيود الفرعي (بضعة نانومترات).يسمح بالتصوير على مستوى الحيود الفرعي (دقة <200 نانومتر) ، وغالبا ما يكون ذلك بقصد اكتشاف جزيئات أو جزيئات مفردة على سطح الخلية. ليست مثالية للتحليل المورفولوجي للعينات الكبيرة مثل أجنة الفئران. عادة ما يكون الاستحواذ عملية بطيئة (من ثوان إلى دقائق لكل صورة).

الجدول 2 - معلومات عامة لتوجيه اختيار تقنية التصوير / المجهر الأكثر ملاءمة للهدف التجريبي المحدد للباحث.

3. المعالجة المسبقة لمجموعة بيانات الصور

ملاحظة: نسلط الضوء هنا على بعض الخطوات الرئيسية للمعالجة المسبقة لمجموعة بيانات الصور ، وهي تقليل الضوضاء (3.1) وإزالة الالتفاف (3.2) ، وتوفير خوارزميات تسمح بالتحضير السليم والمعالجة المسبقة للسلاسل الزمنية لمجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد (3.3) وبقع التألق المناعي الكاملة (3.4). وأخيرا، نشير إلى المراجع التي تصف بالتفصيل بروتوكولا للمعالجة المسبقة لمجموعة بيانات الأرض الفلسطينية المحتلة وإعادة بنائها.

  1. الحد من الضوضاء
    1. إذا أظهرت الصور انخفاضا في نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ففكر في تطبيق طريقة كلاسيكية مثل مرشح "متوسط" أو "انتشار غير متجانس" متوفر في فيجي/ImageJ29، أو طريقة أكثر تفصيلا تعتمد على التعلم الآلي مثل "CARE"30 أو "Noise2Void"31.
      ملاحظة: هذا مهم بشكل خاص لمجموعات بيانات التصوير الحي ، حيث يعد التبييض الضوئي والتلف الضوئي مصدر قلق كبير ، ومن الضروري تقليل التعرض وتحقيق مكاسب أعلى للكاشف.
  2. الالتفاف
    1. إذا تم الحصول على الصور بدقة عالية (بالقرب من أخذ عينات Nyquist أو في Nyquist) ، ففكر في إجراء استعادة للصورة مع إزالة الالتفاف لتحسين جودة مجموعة البيانات قبل التحليل. احذر من أن بعض أدوات إزالة الالتفاف تتضمن أيضا خطوة إزالة الضجيج.
      ملاحظة: تم تناول هذا الأمر على نطاق واسع في Krull et al.32 وفي الوثائق المتاحة على موقع Huygens deconvolution على الويب (https://svi.nl/HomePage).
  3. إعداد سلسلة زمنية لمجموعة بيانات 3D للتصور والتحليل المناسبين
    ملاحظة: غالبا ما يحدث انحراف الجنين أو المرحلة أثناء التصوير بفاصل زمني. هذا يحتاج إلى تصحيح قبل إجراء التحليل. في بعض الأحيان ، يكون الانجراف شديدا بما يكفي بحيث يجب مقاطعة الاستحواذ وإجراء التعديلات. في هذه الحالة ، من الأفضل الاحتفاظ بنفس أبعاد X و Y و Z.
    1. يمكن تسلسل مكدسات 4D منفصلة في مكدس تشعبي 4D واحد باستخدام وظيفة "تسلسل" فيجي. ومع ذلك ، لا تتعامل هذه الأداة مع المكدسات المركبة / التشعبية ، لذلك من الضروري تحويل جميع شرائح 4D إلى مكدسات بسيطة باستخدام العملية Image | | المكدسات الفائقة Hyperstack للتكديس. احتفظ ببعض أنظمة الترقيم للحفاظ على ترتيب شرائح 4D هذه ولاحظ المعلومات حول كل منها (القنوات والشرائح والنقاط الزمنية). كرر الإجراء لكافة المقاطع ثم قم بتسلسلها باستخدام الإجراء Image | مكدسات | أدوات | تسلسل.
    2. إعادة إنشاء المكدس التشعبي المتسلسل مع العملية صورة | | المكدسات الفائقة قم بالتكديس إلى Hyperstack واختر الترتيب الصحيح للأبعاد المختلفة. افحص Hyperstack للتأكد من تسلسل جميع الأبعاد بشكل صحيح.
      ملاحظة: يجب أن يكون عدد القنوات (c ) والشرائح (z) هو نفسه لجميع شرائح 4D ؛ يجب أن يكون عدد الإطارات (الزمنية ) (t) مساويا لإجمالي النقاط الزمنية المضافة لجميع شرائح 4D. من المهم تصفح المكدس لفهم كيفية استيفاء الأبعاد المختلفة ، قبل إجراء التحويل إلى hyperstack. فيجي/ImageJ الافتراضي هو تناوب القنوات، ثم تناوب شرائح Z، ثم تناوب النقاط الزمنية ("XYCZT"). تأكد من أن هذا ينطبق على البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر.
    3. اختر مركب كوضع العرض واحفظ بتنسيق ملف الصورة ذي العلامات (TIFF). بالنسبة لمجموعات البيانات الكبيرة ، فكر في التحويل إلى تنسيق BigDataViewer33 ، من خلال تنفيذ العملية المكونات الإضافية | | برنامج BigDataViewer تصدير الصورة الحالية بتنسيق XML/HDF5. هذا يولد مجموعة بيانات يمكن تصفحها بشكل أكثر كفاءة وفي 3D باستخدام BigDataViewer ويمكن التعامل معها بواسطة أدوات فيجي / ImageJ الأخرى لمجموعات البيانات الكبيرة.
    4. قم بتسجيل hyperstack المتسلسل (سلسلة زمنية من مكدسات 3D) للتعويض عن الانجراف الجنيني / المرحلة باستخدام إما المكون الإضافي ImageJ" Correct 3D Drift" أو المكون الإضافي BigStitcher35 ، اعتمادا على درجة تصحيح الانجراف المطلوب. يمكن فتح ملفات XML/HDF5 باستخدام BigStitcher.
      ملاحظة: من الضروري إجراء تسجيل الفاصل الزمني 3D التي تظهر الانجراف الجنين قبل أي محاولة لإجراء تتبع الخلايا أو تحليل الحركة. تصحيح الانجراف ضروري أيضا لتفسير الحركات المورفوجينية بشكل صحيح.
  4. المعالجة المسبقة لمجموعات بيانات التصوير المناعي
    1. توهين إشارة عمق Z
      ملاحظة: على الرغم من أن الطريقة التي نقترحها لتصحيح توهين الإشارة يمكن أن تكون مفيدة، إلا أنه ينبغي استخدام ذلك بعناية، حيث غالبا ما تعكس الإشارة الأقل عمقا ظاهرة بيولوجية وليس بصرية. فكر في قياس الاضمحلال في منطقة من الأنسجة حيث لا يتوقع أن يكون الجزيء محل الاهتمام موجودا أو معبرا عنه وقم بضبط التعويض لتلك المنطقة. إذا كان لا يزال هناك إشارة إيجابية أقل في العمق ، فقد تكشف عن ظاهرة بيولوجية فعلية. ضع في اعتبارك أيضا أن بعض مناطق العينة قد تنتج تشتتا أو تخفيفا بالليزر أكثر من غيرها ، وأنه لن يتم تصحيحها بالكامل بهذه الطريقة البسيطة.
      1. بالنسبة للأجنة السميكة / المتأخرة ، يمكن أن يؤدي توهين الحزمة والتبييض الضوئي والانحراف الكروي الناجم عن عدم تطابق مؤشرات الانكسار (بين وسط التركيب وهدف المجهر) إلى مجموعات بيانات حيث يتم تخفيف شدة التألق بشكل كبير في الشرائح العميقة من مكدس Z. لذلك ، تعويض عن هذا الفقدان للإشارة قبل التحليل. إن تحديد التوهين الأكثر دقة تحليليا أمر معقد ويعتمد بشكل كبير على العينة36 ، ولكن يمكن تحديد تقريب سريع تجريبيا في ImageJ / Fiji باستخدام العملية | | الرياضيات وظيفة الماكرو والنقر على معاينة.
      2. قم بتحميل مكدس Z في فيجي/ImageJ ثم قم بتنفيذ الإجراء صورة | مكدسات | شرائح. ابدأ في: أعلى ، وحافظ على تجنب الاستيفاء محددا وموافق. الآن سيكون "Z" هو المحور "Y". بعد ذلك ، قم بإجراء | الصور | جداول البحث (LUT) النار (أو أي LUT أخرى متعددة الألوان). سيساعد ذلك على تقييم أفضل تعويض بصريا خلال الخطوات التالية. قم بالتبديل إلى شريحة في منتصف الجنين ، حيث تكون آثار التوهين في العمق مرئية بوضوح (تنخفض الكثافة من الأعلى [السطحي] إلى الأسفل [أعمق]).
      3. انتقل إلى تحديد تصحيح انخفاض الكثافة الرأسي ("y") باستخدام عملية الإجراء | | الرياضيات الماكرو ، وإضافة "التعليمات البرمجية" التالية تماما كما هو مكتوب هنا:
        v = v * A * exp ( B * y / h )
        في هذا التعبير ، "v" هو متغير كثافة البكسل (الذي سيتم تعديله كدالة على العمق) ، و "y" المتغير للعمق ، و "h" للعمق الكامل ، و "exp" هي دالة أسية ؛ يجب استبدال "A" برقم يتراوح بين 0.5 و 1.0 (اختر قيما أقل لتجنب التشبع الزائد للطبقات العليا من مكدس Z) ؛ B يستعاض عنه برقم يتراوح بين 0.5 و 2.0 ، اعتمادا على مدى شدة توهين عمق Z - من الناحية المثالية يجب أن يكون 1 ، ولكن في بعض الحالات يكون أقل (أو أكثر) ضروريا لتعويض الطبقات السفلية بشكل صحيح ؛ قيمة أعلى من B سيؤدي إلى مزيد من تعويض التخفيف. انقر فوق معاينة لإجراء تقييم أول. اختبر قيما مختلفة من A و B حتى الحصول على تعويض مناسب من أعلى الصورة إلى أسفلها (يمكن أن يكون LUT "Fire" مفيدا لهذا التقييم). عند الرضا، قم بتطبيق الإعدادات بالنقر فوق موافق.
        ملاحظة: يجب إجراء ذلك في كل قناة على حدة، لأن الأصباغ الحمراء والليزر قد تخفف أقل، وبعض الأصباغ تبيض بشكل أسرع من غيرها. ضع في اعتبارك أن هذا الإجراء قد لا يكون دقيقا بما يكفي للسماح بتحديد كمي موثوق به لاختلافات كثافة التألق في العمق ، على الرغم من أنه بالتأكيد أكثر موثوقية من إجراء القياسات الكمية مباشرة في مجموعة بيانات 3D الأصلية التي تتأثر بشدة بتوهين الإشارة في العمق. إحدى الطرق لتحديد هذا التأثير والتحكم فيه ، هي مقارنة تصوير الأجنة المختلفة من الجانبين الظهري أو البطني.
      4. استعادة الهندسة الأصلية لمكدس Z المعوض عن طريق إجراء | مكدسات | قم بالشرائح ، وابدأ من الأعلى ، وحافظ على علامة تجنب الاستيفاء ، والآن يجب أن تصبح "Y" هي الطائرة "Z" مرة أخرى ؛ استبدال اللون عن طريق إجراء "صورة | | جداول البحث الرمادي" (أو LUT الآخر من الاختيار). تجاهل مكدس z-stack الأصلي غير المعوض واحفظ الإصدار التعويضي.
        ملاحظة: انظر الشكل التكميلي 2 كنتيجة تمثيلية لطريقة توهين إشارة عمق Z.
    2. تصحيح قياس المحور Z
      1. إذا كان التصوير بهدف مصمم لمعامل الانكسار مختلفا عن الهدف المستخدم في تركيب الأجنة ، فمن الضروري إجراء إعادة تحجيم سمك الشريحة ، وإلا فإن القياسات في العمق ستكون غير صحيحة (ربما بنسبة 50٪ إذا كنت تستخدم هدفا "جافا" على جنين تم تطهيره من الأنسجة). يتم شرح ذلك ومراجعته ومناقشة الأساليب المختلفة ، في 37 و 38. إن تحديد مقياس تشوه المحور Z الفعلي تحليليا أمر معقد، ولكن يمكن بسهولة تحديد التقريب المقبول من خلال إيجاد النسبة بين معامل الانكسار للعينة ومعامل الانكسار للهدف (على سبيل المثال، 1.53/1.0 لجنين تم تطهيره من ساليسيلات الميثيل تم تصويره بهدف جاف 20 ×، أو 1.56/1.33 لجنين تم تطهيره باستخدام BABB وتصويره بهدف غمر الماء).
      2. مع فتح مجموعة بيانات Z-stack بالفعل في فيجي / ImageJ (للصور متعددة القنوات ، بعد تجميعها ك "مركبة" مع جميع القنوات) ، انتقل إلى Image | الخصائص وتغيير عمق Voxel إلى سمك الشريحة التي تم الحصول عليها أثناء الحصول على الصورة مضروبة في تصحيح قياس المحور Z المحدد في الخطوة السابقة (4.2.1; قسم "المعالجة المسبقة لمجموعة بيانات الصورة"). قم بتأكيد النتيجة باستخدام | الصور مكدسات | طرق عرض متعامدة.
    3. إعادة وضع الجنين إلى وضع قياسي تشريحيا باستخدام فيجي/ImageJ
      ملاحظة: إعادة وضع الجنين (انظر المزايا الموضحة في الشكل التكميلي 3) في موضع المحور الأمامي الخلفي [A-P] والظهري البطني [D-V] باستخدام فيجي/ImageJ، يتطلب تركيب TransformJ 39 مجموعة من المكونات الإضافية من موقع تحديث "ImageScience" في فيجي.
      ملاحظة: هذه التقنية أفضل من جولات الدوران في المستويات الثلاثة التي من شأنها أن تقدم القطع الأثرية الصقلية وتدهور الدقة. ومع ذلك ، نظرا لأن المكون الإضافي لعارض Fiji / ImageJ 3D لا يمكنه التعامل بشكل صحيح مع مجموعات البيانات الأكبر من 200-300 ميجا بايت (قد لا يعرض المكون الإضافي أو يظهر سلوكا لا يمكن التنبؤ به عند محاولة تدوير زاوية العرض) ، يجب أن يتم أخذ عينة ثلاثية الأبعاد الأصلية أولا.
      1. ابدأ بتقليل حجم مجموعة البيانات في صورة فيجي | قم بقياس قيم "المقياس " X و Y و Z اللازمة لتقليل مجموعة البيانات إلى أقل من 200 ميجا بايت ثم قم بإدراجها (على سبيل المثال ، سيؤدي أخذ العينات لأسفل 0.5 × 0.5 × 0.5 إلى مجموعة بيانات أصغر 8 مرات). تأكد من تحديد الخيار إنشاء نافذة جديدة .
      2. ثم انتقل إلى المكونات الإضافية | عارض 3D. داخل نافذة عارض 3D ، انقر فوق الجنين لتحديده ، ويجب أن يظهر مربع 3D أحمر. عند استخدام هذا الوضع (مع تنشيط المربع الأحمر) ، يمكن التحكم في دوران مجموعة البيانات باستخدام الماوس ، على عكس السلوك الافتراضي ، وهو تدوير زاوية العرض. عند تغيير موضع الجنين باستخدام الماوس، لا تنقر أبدا في الخارج وإلا سيتم إلغاء تحديد مجموعة البيانات.
      3. عند الرضا عن الموضع الجديد للجنين، حدد تحرير | | التحول تصدير الصورة المحولة في قائمة نافذة "عارض 3D". لفحص المستويات المتعامدة المختلفة ، انتقل إلى Image | مكدسات | طرق عرض متعامدة. إذا لم يتم وضع الجنين بشكل صحيح ، فأغلق النافذة والعودة إلى نافذة عارض 3D وإعادة ضبطها. كرر الخطوة 4.3.2.
      4. عندما يتم وضع الجنين بشكل صحيح ، حدد من قائمة نافذة "عارض 3D" تحرير | | التحول احفظ التحويل واحفظ مصفوفة التحويل في ملف نصي بامتداد *.mat. افتح هذا الملف النصي باستخدام Fiji/ImageJ وأزل أول سطرين (نص) وأعد حفظه. يؤدي ذلك إلى إنشاء ملف مصفوفة تحويل متوافق مع المكون الإضافي "TransformJ" الموضح في 39.
      5. قم بالتبديل إلى مجموعة البيانات كاملة الدقة (يمكن أن تكون مكدسا تشعبيا مركبا متعدد القنوات) وقم بإجراء العملية المكونات الإضافية | تحويل | TransformJ affine. في النافذة الجديدة، استعرض للبحث عن ملف المصفوفة الذي تم حفظه مسبقا، وحدد الاستيفاء B-Spline المكعب | إعادة التشكيل متساوي الاستواء | حسنا.
        ملاحظة: هذه العملية هي الذاكرة ووحدة المعالجة المركزية المكثفة. اعتمادا على محطة العمل وحجم مجموعة البيانات، قد تستغرق العملية من دقائق إلى ساعات. يضمن استخدام خيار إعادة التشكيل متساوي المدار عدم فقدان أي دقة أثناء عملية التحويل ، وبالتالي فإن مجموعة البيانات ستزداد في الحجم بشكل كبير ولن تكون متباينة الخواص مثل مكدس z البؤري الأصلي ؛ من المتوقع أن يزداد عدد الشرائح في المحور Z إلى نفس عدد وحدات البكسل X و Y لكل شريحة ، وأن المكدس منتفخ إلى 5-10x الحجم الأصلي. هذا ضروري لضمان عدم فقدان أي معلومات أثناء استيفاء voxels أثناء الدوران والترجمة.
      6. بمجرد إعادة وضع الجنين بشكل صحيح ، غالبا ما يكون من الممكن تقليم معظم المساحة الفارغة التي تم إنشاؤها حول الجنين. قم بإجراء صورة إسقاط Z كاملة | مكدسات | مشروع Z... واختر أقصى كثافة ؛ ارسم الحد الأدنى لعائد الاستثمار الذي يحتوي على الجنين بأكمله في X و Y. قم بالتبديل إلى نوافذ صورة مجموعة البيانات الأصلية ، وانتقل إلى تحرير | | الاختيار استعادة التحديد، والاقتصاص عن طريق تحديد صورة | الاقتصاص.
      7. تقليم الشرائح في البداية والنهاية التي لا تتقاطع مع أنسجة الجنين. لهذا الغرض، حدد صورة | مكدسات | أدوات | قم بإزالة الشرائح وحدد الشريحة الأولى والأخيرة المراد إزالتها ، مع التأكد من تغيير "الزيادة" إلى 1 (وإلا فإنها تزيل كل شريحة أخرى فقط).
      8. بعد تغيير موضع مجموعة البيانات الجديدة وقصها، تأكد من حفظها كملف TIFF جديد. إذا كانت مجموعة البيانات هذه كبيرة جدا (أكثر من ذاكرة الوصول العشوائي لوحدة معالجة الرسومات) ، ففكر في استخدام BigDataViewer للتصدير ك XML / DHF5 ، كما هو موضح في الخطوة 3.3 (من قسم "المعالجة المسبقة لمجموعة بيانات الصورة").
  5. المعالجة المسبقة لإعادة بناء مجموعة بيانات الأرض الفلسطينية المحتلة
    1. استخدام البروتوكول الخاص بالتجهيز المسبق لمجموعات بيانات الأرض الفلسطينية المحتلة وإعادة بنائها الموصوف في كتابي Martins et al.19 وGualda et al.28.

4.3D التقديم والتصور والتحليل

ملاحظة: هنا نقدم قائمة بالتطبيقات الممكنة لأدوات البرامج المختلفة ، والتي تسمح أو تعزز تصور وتحليل مجموعات بيانات التصوير 3D.

  1. 3D تقديم والتصور باستخدام Drishti
    ملاحظة: Drishti 40 هو برنامج تصور علمي مجاني مصمم لاستكشاف وتقديم مجموعات بيانات 3D و4D من التصوير المقطعي المحوسب المصغر و confocal / multiphoton والمجهر الضوئي. هنا نستخدم هذا البرنامج لتقديم 3D وتصور تلطيخ التألق المناعي الكامل (الخطوة 2; قسم "إعداد العينة للتصوير 3D"). هناك العديد من البرامج التعليمية عبر الإنترنت لمساعدة المستخدمين على فهم كيفية تشغيل Drishti. البحث عبر الإنترنت عن "أجاي ليماي Drishti 3D الدروس". لا يمكن ل Drishti قراءة أكوام ملفات TIFF مباشرة ، لذلك يجب تحويلها أولا إلى تنسيق "pvl.nc" الأصلي.
    1. قم بتشغيل أداة "drishtiimport.exe" الموجودة في مجلد تثبيت Drishti: الملفات | تحميل | ملفات | اختر "ملفات صور TIFF ذات التدرج الرمادي ، وقم بتحميل مكدس 3D أحادي القناة ، كما تم حفظه من فيجي / ImageJ. في حالة وجود مكدس مركب متعدد القنوات ، قم بتقسيم القنوات في فيجي / ImageJ واحفظ كل منها على حدة. نوع Voxel هو "ushort" ؛ "ملف"..."حفظ باسم"..."TIF"، الرد "y" على جميع الأسئلة. في نافذة المعلومات الإضافية التي تطلب حجم VOXEL ، تأكد من إضافة أحجام voxel "X Y Z" الصحيحة.
    2. تحميل ملفات *.pvl.nc إلى Drishti وتقديمها: في النافذة الرئيسية ل Drishti ، | الملفات تحميل | تحميل 1 ( - 4 ) وحدات التخزين اعتمادا على عدد القنوات المتاحة (كملفات منفصلة). بعد التحميل، اضغط على F2 للحصول على عرض عالي الجودة. يتطلب هذا الإجراء بطاقة GPU قوية. معلومات للتعامل مع معلمات العرض ، محرر وظيفة النقل ، البحث في البرامج التعليمية عبر الإنترنت. بمجرد الرضا عن خصائص العرض ، انتقل إلى إنشاء عرض متحرك.
    3. انتقل إلى عرض محرر Keyframe وتنشيطه. تعامل مع الجنين وضعه في وضع البداية المطلوب. استخدم زر الماوس الأيمن "لسحب" الجنين إلى الوسط إذا لزم الأمر ، أو تمرير الماوس للتكبير/التصغير. اضغط على الإطار الرئيسي المحدد في محرر Keyframe، ثم اختر موضعا أو زاوية أو تكبير/تصغير آخر، واسحب علامة الخط الزمني إلى نقطة زمنية مختلفة واضبط الإطار الرئيسي مرة أخرى. الآن هناك 2 إطارات مفتاحية حيث يتم تمثيل الجنين في 2 مواضع / زوايا / تكبير مختلفة ، وعدد من الإطارات بينهما. بالضغط على زر التشغيل ، يمكن ل Drishti استجواب الظروف المفقودة وتشغيلها كرسوم متحركة. انتقل إلى | الملفات احفظ تسلسل الصور لحفظ التسلسل المتحرك لجميع الإطارات. يمكن فتح تسلسل الإطار هذا لاحقا في فيجي/ImageJ وحفظه ك AVI (ملف | | الاستيراد تسلسل الصور ... | الملفات وفر باسم| ضغط JPEG بمعدل إطارات معقول (نقترح 15 - 30).
      ملاحظة: على الرغم من أن Drishti يسمح بحفظ مقاطع الفيديو *.wmv ، فمن المستحسن بدلا من ذلك حفظها كإطارات منفصلة وتحويل السلسلة لاحقا فقط إلى تنسيق فيديو AVI أو MOV (يمكن القيام بذلك باستخدام فيجي / ImageJ).
  2. 3D إعادة تشكيل وتجزئة يدوية للأنسجة باستخدام أميرة
    ملاحظة: يسمح هذا البرنامج التجاري ، يدويا أو تلقائيا / شبه تلقائي ، بتجزئة الأنسجة الجنينية ثلاثية الأبعاد في مجموعات بيانات ثلاثية الأبعاد. هناك "مركز تعلم" عبر الإنترنت لهذا البرنامج مع العديد من البرامج التعليمية المتاحة 41. فيما يلي وصف للخطوات الأساسية المطلوبة لتقسيم الأنسجة الجنينية يدويا من الأجنة الملطخة بالتألق المناعي (الخطوة 1.2). يصبح التقسيم اليدوي أسهل بكثير بعد وضع الجنين بشكل صحيح في محور A-P/D-V القياسي (راجع قسم "المعالجة المسبقة لمجموعة بيانات الصور"، الخطوة 4.3).
    1. قم بتحميل مجموعة بيانات 3D TIFF. تأكد من تحديد أبعاد voxel الصحيحة ، عندما يطلب منك ذلك. إنشاء وتوصيل وحدة تصور (على سبيل المثال ، "Orthoslice" أو "Volren") وفحص مجموعة البيانات في 3D.
    2. قم بتوصيل حقل التسمية (أو تحرير حقل تسمية جديد في الإصدارات الأحدث من أميرة). في هذا البرنامج ، يتم تخزين نتائج التجزئة اليدوية في "مواد" ، لذلك قم بإنشاء مادة واحدة لكل نسيج ذي أهمية. استخدم أداة "lasso" للتجزئة اليدوية. هناك العديد من البرامج التعليمية المتاحة التي تشرح كيفية القيام بذلك (ابحث عبر الإنترنت عن "البرنامج التعليمي لمحرر تجزئة أميرة").
    3. عند الانتهاء من تجزئة جميع الأنسجة ذات الاهتمام، قم بالخروج من محرر التجزئة عن طريق التبديل مرة أخرى إلى وضع المشروع . بعد إنشاء إصدار جديد من مجموعة البيانات ("حقل التسميات" ، والذي يتم إرفاقه الآن بوحدة مجموعة البيانات الأصلية) حيث يكون للبكسل التي تنتمي إلى كل مادة نفس القيمة.
    4. قم بتحويل هذه "المواد" إلى كائنات ثلاثية الأبعاد عن طريق إنشاء نماذج سطح ثلاثية الأبعاد من مجموعة بيانات "التسميات". يمكن القيام بذلك عن طريق إرفاق وحدة "توليد السطح" ، وضبط المعلمات حسب الضرورة (تنشيط خيارات "الضغط" و "الحدود" و "ضبط الإحداثيات" و "التجانس غير المقيد"). انقر فوق تطبيق وسيتم إنشاء وحدة نمطية جديدة *.surf.
    5. تصور الكائنات السطحية ، واستخراج وتصدير بشكل فردي كملفات * obj. إرفاق | عرض وحدة SurfaceView إلى وحدة *.surf ، وفحص في العارض الرئيسي. في لوحة "الخصائص" في وحدة "SurfaceView" ، في خاصية "المواد" ، حدد الكل + الكل وانقر فوق إزالة ، بحيث يتم إفراغ المخزن المؤقت للمشاهد. ثم في السحب الثاني لأسفل من خاصية المواد حدد مادة واحدة فقط وانقر فوق إضافة إلى المخزن المؤقت. فقط تلك المواد يجب أن تكون مرئية.
    6. في الخاصية نمط الرسم انقر في المزيد من الخيارات | إنشاء سطح ويتم إنشاء وحدة نمطية *.surf جديدة وإضافتها إلى المشروع. أعد تسميته إلى اسم النسيج (اضغط على F2 على لوحة المفاتيح)، وقم | تصدير البيانات باسم... وحفظ كنوع: الواجهة الموجية (*.obj). كرر العملية لكل مادة.
      ملاحظة: يمكن استخدام ملفات *.obj هذه، التي يحتوي كل منها على أحد الأنسجة المجزأة في أميرة، بواسطة أدوات أخرى (المكون الإضافي "3Dviewer" من فيجي/ImageJ و SimLab).
  3. التصور التفاعلي 3D داخل في شكل وثيقة محمولة (PDF) باستخدام SimLab الملحن
    ملاحظة: يسهل برنامج 3D Computer Graphics هذا إنشاء الصور المقدمة على السطح والرسوم المتحركة والمحاكاة. يمكن العثور على دروس مفيدة على الخط 42. هنا نصف كيف يمكن هذا البرنامج من إنشاء رسوم توضيحية تفاعلية ثلاثية الأبعاد PDF ، باستخدام ملفات سطح الواجهة الموجية (*.obj) ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها باستخدام Amira (الخطوة 2.3; قسم "تقديم 3D والتصور والتحليل").
    1. انتقل إلى | الملفات جديد وإنشاء مشهد فارغ. ثم ملف | استيراد واستيراد ملف 1st *.obj المحفوظة من أميرة. احتفظ بكافة خيارات نافذة استيراد الملف غير محددة وانقر فوق موافق.
    2. إذا لم يظهر أي شيء في نافذة عرض الملحن، فانقر فوق Ctrl+F أو الرمز لاحتواء الكل. الآن يجب أن يظهر الكائن المجزأ في وسط النافذة. كرر العملية لإضافة كائن مجزأ آخر وتأكيد موضعه بالنسبة إلى الكائن 1st (على سبيل المثال ، 2 somites المجاورة).
    3. حدد أحد الكائنات في نافذة العرض بالنقر فوق زر الماوس الأيسر ، وتغيير اسمه ليعكس اسم البنية أو الأنسجة التشريحية ، ثم التبديل إلى تمثيل "3DGeom ~ 1" ، وباستخدام لوحة المواد ، قم بتغيير اللون عن طريق تغيير قيم R و G و B.
    4. كرر ذلك لجميع الكائنات ، حتى يتم تجميع الرسم التوضيحي 3D بالكامل. لاحظ أنه يمكن أيضا جعل بعض المواد شفافة عن طريق التلاعب بقناة "ألفا" ، بجوار قيم RGB ، وبالتالي السماح بمراقبة الكائنات الداخلية أو المسدودة.
    5. باستخدام هذا البرنامج ، يمكن تصدير الرسم التوضيحي للأجنة المجمعة كملف "3D PDF" ، والذي يمكن تضمينه في المنشورات. قم أولا بإنشاء "قالب" يحتوي على نص وروابط نشطة لتغيير "حالات المشهد" لتتمكن من تضمين تعليمات وثلاث مراحل مختلفة في نفس الرسم التوضيحي. يمكن القيام بذلك عن طريق التبديل من وضع "بناء المشهد" إلى وضع "المشاركة" (أزرار على يسار نافذة الملحن) ، ثم النقر فوق إظهار إعدادات PDF ، وإنشاء قالب صفحة جديد. لإنشاء شكل تفاعلي بسيط لتضمينه في مخطوطة، لا تستخدم قالبا وببساطة تصدير PDF.
      ملاحظة: استخدم برنامج Adobe Acrobat Reader للتفاعل مع ملفات PDF ثلاثية الأبعاد (قد تختلف قابلية تشغيل الوظائف في الرسم التوضيحي التفاعلي 3D PDF اعتمادا على إصدارات Acrobat Reader المتوفرة). معظم المشاهدين الآخرين غير متوافقين مع تنسيق PDF 3D ، بما في ذلك متصفحات الويب. يمكن تضمين هذه الرسوم التوضيحية التفاعلية 3D PDF في المنشورات. اسأل المحررين عن هذا الاحتمال مقدما.
  4. 3D التصور والتحليل باستخدام Imaris
    ملاحظة: يسمح هذا البرنامج بتصور التصوير الشامل وتحليل وتفسير مجموعات بيانات الفحص المجهري 2D-4D ، مع واجهة بديهية وسير العمل. هناك العديد من البرامج التعليمية المفيدة عبر الإنترنت حول كيفية البدء في استخدام هذا البرنامج ، وهي متوفرة على موقع الويب (https://imaris.oxinst.com/tutorials). لتحميل مجموعات البيانات الكبيرة في Imaris والتفاعل معها بشكل أكثر فعالية (عادة ، تلك الأكبر من ذاكرة GPU) ، ينصح بتحويل مجموعة البيانات أولا إلى "*.ims" ، باستخدام برنامج "ImarisFileConverter.exe" المثبت في مجلد تثبيت Imaris. يمكن ل ImarisFileConverter قراءة العديد من تنسيقات الصور المجهرية ، بما في ذلك ملفات OME و "h5" كما تم حفظها بواسطة BigDataViewer في فيجي.
    1. 3D التصور
      1. يمكن لهذا البرنامج تقديم تصور ثلاثي الأبعاد لمجموعة البيانات باستخدام وضع "3D View" ويكون المستخدم قادرا على إجراء العديد من التعديلات على كيفية عرض مجموعة البيانات [على سبيل المثال ، الاختيار بين MIP (الحد الأقصى للكثافة الإسقاط) أو وضع المزج (تقديم أفضل مع إشارات العمق والظلال)].
      2. وضع وجهات النظر المتعامدة" - مع تحديد موضع الجنين المناسب (الخطوة 4.3; قسم "المعالجة المسبقة لمجموعة بيانات الصورة") يمكن للمرء استخدام علامة التبويب "القسم" والتنقل عبر الجنين بأكمله ورؤية الأقسام البصرية من المستويات العادية (المستعرضة والإكليلية والسهمية). إذا لم يتم تغيير وضع الأجنة بشكل صحيح ، فإن تفسير تشريحها باستخدام مستويات متعامدة أمر صعب للغاية (انظر الشكل التكميلي 3). على الرغم من أن Imaris لديه وظيفة تعرف باسم "الإطار المرجعي" للتغلب على هذه المشكلة عند تحليل أجنة 3D ، فمن الأفضل إعادة وضع مجموعات البيانات مسبقا.
    2. تحليل 3D
      ملاحظة: يحتوي هذا البرنامج أيضا على العديد من الأدوات لتحليل المورفولوجيا وكثافة التألق. على سبيل المثال ، نصف هنا سير عمل بسيط لتحليل اختلافات كثافة تألق الأنسجة بمرور الوقت باستخدام أداة Imaris "Spots" ، حيث يضع المستخدم يدويا مناطق كروية ذات أهمية (ROIs) في الجنين في 3D ، ويمكن ل Imaris بعد ذلك قياس تألق الأنسجة داخل عائد الاستثمار الكروي هذا.
      1. قم بتحميل مجموعة بيانات 3D أو 4D في Imaris وأضف بقعة جديدة في وضع العرض ثلاثي الأبعاد. بعد ذلك ، يمكن للمرء تحديد نقاط محددة من الجنين (أيضا خلال عدة نقاط زمنية إذا كان المرء يستخدم مجموعة بيانات 4D) وتحديد كمي داخل تلك البقع ، على سبيل المثال ، يعني الشدة.
        ملاحظة: يسمح هذا البرنامج أيضا بتخطيط الكثافة بمرور الوقت. هذا يسمح للمستخدم بالإجابة بسهولة على أسئلة مثل: "كيف يتغير التألق داخل السوميت بمرور الوقت؟".
      2. أضف وحدة التركيز بالنقر فوق الزر " إضافة بقعة جديدة" أو تحديد عرض 3D | أماكن في قائمة Imaris. اختر تخطي التفاعل التلقائي ، والتحرير يدويا. قم بتبديل وضع مؤشر Imaris من التنقل إلى التحديد (يمكن القيام بذلك أيضا عن طريق الضغط على مفتاح ESC على لوحة المفاتيح).
      3. في نافذة خصائص Spots، حدد القناة المحددة التي سيتم إرفاق البقعة بها (على سبيل المثال، "القناة 1")، وقم بالتنشيط في التتبع اليدوي للاتصال التلقائي بالمكان المحدد وخيارات تمكين التأخير قبل التقدم التلقائي.
      4. حرك مؤشر الماوس إلى نافذة التصور ويجب أن يتغير المؤشر إلى كرة سلكية صفراء مجوفة. انتقل إلى النقطة الزمنية 1 وأضف بقعة (=sphere) بالنقر فوق النسيج محل الاهتمام. تتم إضافة الكرة ("Spot") فقط عند النقر أثناء الضغط باستمرار على مفتاح Shift . كرر ذلك لجميع النقاط الزمنية المطلوبة مع التأكد من تتبع نفس الجزء من الأنسجة بمرور الوقت.
      5. في نافذة خصائص Spot ، قم بالتبديل إلى علامة التبويب إحصائيات ، وداخل الإحصائيات قم بالتبديل من الإحصاءات الإجمالية إلى الإحصاءات التفصيلية . من القائمة المنسدلة الأولى اختر قيما محددة، ومن القائمة المنسدلة الثانية اختر "الكثافة تعني Ch=*..."، حيث Ch* هي القناة التي سيتم فيها إجراء القياس. سيتم العثور على زر مباشرة إلى "انقر لفتح لوحة المخطط الزمني" في أسفل يسار نافذة خصائص البقع. يؤدي النقر فوق هذا الزر إلى فتح مخطط بكثافة التألق المتوسطة داخل "البقع" ، التي تم رسمها بمرور الوقت. يمكن أيضا تصدير هذه القيم إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.

النتائج

تم الحصول على النتائج التمثيلية الموضحة في هذه الورقة لكل من التصوير الحي والتألق المناعي ، باستخدام نظام ثنائي الفوتون ، مع هدف مائي 20 × 1.0 NA ، وليزر الإثارة مضبوط إلى 960 نانومتر ، وأجهزة الكشف الضوئي GaAsP (كما هو موضح في Dias et al. (2020)43. تم إجراء التصوير المقطعي بالإسقاط البصري باست...

Discussion

الاستطالة المحورية والتقسيم هما من أكثر العمليات تعقيدا وديناميكية التي تحدث أثناء التطور الجنيني للفقاريات. تم تطبيق استخدام التصوير ثلاثي الأبعاد و 4D مع تتبع خلية واحدة ، لبعض الوقت ، لدراسة هذه العمليات في كل من أجنة الزرد والدجاج ، والتي تسهل ظروف الوصول إليها واستزراعها التصوير الم?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر أوليفييه بوركييه وألكسندر أوليهلا على سلالة مراسل LuVeLu ، ومختبر SunJin لعينة اختبار RapiClear ، وهوغو بيريرا على المساعدة في استخدام BigStitcher ، ونونو غرانجيرو للمساعدة في إعداد جهاز التصوير الحي ، ومرفق الحيوانات التابع للجنة الحكومية الدولية والأعضاء السابقين والحاليين في مختبر Mallo للحصول على تعليقات ودعم مفيدين خلال هذا العمل.

ونشكر الدعم التقني المقدم من مرفق التصوير المتقدم التابع للجنة الحكومية الدولية، والذي يدعمه التمويل البرتغالي المرجع #PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 والمرجع رقم PTDC/BII-BTI/32375/2017، الذي يشترك في تمويله برنامج لشبونة التشغيلي الإقليمي (لشبونة 2020)، بموجب اتفاق الشراكة البرتغالي لعام 2020، من خلال الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (FEDER) ومؤسسة العلوم والتكنولوجيا (FCT، البرتغال). تم دعم العمل الموصوف في هذه المخطوطة من خلال منح LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT، البرتغال) و SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia، البرتغال) إلى M.M.، والبنية التحتية البحثية Congento، ومشروع LISBOA-01-0145-FEDER-022170، وزمالة الدكتوراه PD/BD/128426/2017 إلى A.D.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose low gelling temperatureSigmaA9414Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira softwareThermofisher-Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)Abcamab92494 RRID:AB_10585428For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)R and D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)SigmaL9393 RRID:AB_477163For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)Molecular ProbesA11055 RRID:AB_2534102For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)(any)-Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albuminBiowestP6154For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0(any)-100um thick
Coverglass 20x20 mm #1(any)-170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5(any)-To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)Life TechnologiesD3571For immunofluorescence
Drishti software(open source)-Free software tool
EDTASigmaED2SSFor demineralization
Fiji/ImageJ software(open source)-Free software tool
GlycineNZYtechMB01401For immunofluorescence
Huygens softwareScientific Volume Imaging-Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serumGE Healthcare#HYCLSH30070.03For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %Milipore1085971000For clearing
Imaris softwareBitplane / Oxford instruments-Commerial software tool
iSpacersSunJin Lab(varies)Use as spacers for preparations
L-glutamineGibco#25030–024For live imaging medium
Low glucose DMEMGibco11054020For live imaging medium
M2 mediumSigmaM7167To dissect embryos
MethanolVWRVWRC20847.307For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylateSigmaM6752Used to clear embryos
ParaformaldehydeSigmaP6148Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycinSigma#P0781For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)BiowestL0615-500-
RapiClearSunJin LaboratoryRapiClear 1.52Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambersSigmaC5474Use as spacers for preparations
simLab softwareSimLab soft-Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm(any)-To mount thick embryos.
Triton X-100SigmaT8787For immunofluorescence

References

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
  4. Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
  5. Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
  6. Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
  7. Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
  8. de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
  9. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
  10. Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
  11. Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
  12. Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  13. Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
  14. Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
  15. Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
  16. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  17. McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
  18. McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
  19. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
  20. Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
  21. Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
  22. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
  23. Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  24. Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
  25. Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
  26. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
  27. Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
  28. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
  31. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
  32. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
  34. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
  35. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  36. Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
  37. Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
  38. Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
  39. Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
  40. Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
  41. . Thermofisher.com Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020)
  42. . Simlab-soft.com Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020)
  43. Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
  44. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  45. Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
  46. Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
  47. Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
  48. Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
  49. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  50. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  51. Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
  52. Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
  53. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
  54. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  55. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  56. Jost, A. P. -. T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  58. Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
  59. Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
  60. Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
  61. Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
  62. Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
  63. Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
  64. Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168 3D NMPs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved