JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة لعملية زرع الأعضاء الأولية والمستمرة لأورام ذبابة الفاكهة في بطن المضيفين البالغين لدراسة الجوانب المختلفة للأورام. باستخدام جهاز الحقن الذاتي ، يمكن للباحثين تحقيق كفاءة محسنة وغلة الورم مقارنة بتلك التي تحققت بالطرق اليدوية التقليدية.

Abstract

يصف هذا البروتوكول عملية زرع الأورام في ذبابة الفاكهة باستخدام جهاز حقن نانولتر تلقائي. باستخدام جهاز الحاقن الذاتي ، يمكن للمشغلين المدربين تحقيق نتائج زرع أكثر كفاءة واتساقا مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام حاقن يدوي. هنا ، نغطي الموضوعات بطريقة زمنية: من عبور خطوط ذبابة الفاكهة ، إلى تحريض وتشريح الورم الأساسي ، وزرع الورم الأساسي في مضيف بالغ جديد واستمرار زرع الورم من الأجيال لإجراء دراسات موسعة. كعرض توضيحي ، نستخدم هنا المجال داخل الخلايا Notch (NICD) الإفراط في التعبير الناجم عن أورام الحلقة اللعابية الوهمية لزرع الأجيال. يمكن أولا تحفيز هذه الأورام بشكل موثوق به في بيئة مجهرية في منطقة انتقالية داخل الحلقات التخيلية للغدة اللعابية اليرقية ، ثم يتم استزراعها واستزراعها في الجسم الحي لدراسة نمو الورم المستمر وتطوره وانبثاثه. يمكن أن تكون طريقة الزرع هذه مفيدة في برامج فحص الأدوية المحتملة ، وكذلك لدراسة التفاعلات بين الورم والمضيف.

Introduction

يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لزرع أورام الحلقة الوهمية للغدة اللعابية اليرقية (SG) في بطن المضيفين البالغين باستخدام جهاز حقن نانولتر تلقائي (على سبيل المثال ، Nanoject). يوفر هذا البروتوكول أيضا توجيهات لإعادة تجميع الأورام لاحقا في أجيال جديدة من المضيفين البالغين ، مما يوفر فرصا لمواصلة الدراسة الطولية لخصائص الورم ، مثل تطور الورم والتفاعلات بين الورم والمضيف. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على تجارب فحص الأدوية.

تم تطوير هذه الطريقة لتحسين فعالية إجراء زراعة الأعضاء في ذبابة الفاكهة باستخدام الحقن اليدوي1 ، والتي غالبا ما تكون غير متسقة في قوى الشفط والحقن ، مما يؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل لزراعة الورم. يوفر جهاز الحاقن الذاتي تحكما أفضل ويمكن أن يؤدي إلى انخفاض معدلات وفيات الذباب بعد الألوغرافت. يمكن للمشغل المدرب تحقيق معدل بقاء المضيف على قيد الحياة يزيد عن 90٪ باستخدام الحاقن التلقائي ، مقارنة بحوالي 80٪ عند استخدام الحاقن اليدوي1. معدل اكتساب الورم الكلي هو 60٪ -80٪ في اليوم 8-12 بعد allograft. كما تم تحسين متوسط وقت الحقن من 30-40 ثانية لكل ذبابة باستخدام حاقن يدوي إلى 20-25 ثانية لكل ذبابة باستخدام الحاقن التلقائي.

هذا البروتوكول هو من بين البروتوكولات القليلة الأولى لاستخدام جهاز الحقن الذاتي في زراعة ورم ذبابة الفاكهة . كما استخدمت دراسة حديثة الحاقن الذاتي لزراعة الخلايا الجذعية العصبية الورمية2. في السابق ، تم استخدام جهاز الحقن الذاتي في ذبابة الفاكهة لدراسة الضراوة البكتيرية3 والالتهابات الطفيلية ودفاع المضيف4 ، وكذلك فحص النشاط الحيوي للمركبات المختلفة5. يقوم بروتوكولنا بتكييف جهاز الحقن الذاتي لاستخدام حقن الورم ويسعى إلى تزويد الباحثين في ذبابة الفاكهة بجودة أعلى ونتائج أكثر اتساقا مع توفير وقت كبير لهم. لا يمكن استخدام هذا البروتوكول فقط لزراعة الأورام ، ولكن يمكن أيضا تخصيصه لزراعة الأعضاء البرية والأنسجة المتحولة ذات العيارالمماثل 6.

تم إدخال ورم ذبابة الفاكهة NICD المستخدم في هذا البروتوكول لأول مرة من قبل Yang et al.7 في المنطقة الانتقالية للحلقة الخيالية SG ، وهي "نقطة ساخنة للورم" تظهر مستويات عالية من Janus Kinase / محول الإشارة الداخلي ومنشطات النسخ (JAK-STAT) ، ونشاط c-Jun N-terminal Kinase (JNK). بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي المنطقة الانتقالية على مستويات عالية من مصفوفة ميتالوبروتيناز -1 (MMP1)7 ، مما يجعل هذه المنطقة مواتية بشكل خاص لتكوين الأورام. يعد تنشيط مسار الشق من خلال الإفراط في التعبير عن NICD وحده كافيا لبدء تكوين الورم باستمرار. يمكن لاحقا زرع هذه الأورام للسماح بالتحقيق في مجموعة واسعة من الموضوعات ، بما في ذلك انقسام الخلايا السرطانية ، والغزو ، والتفاعلات بين الورم والمضيف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد ورم الحلقة الوهمية SG

  1. عبر الذباب البالغ مع الأنماط الجينية من UAS-NICD (الذكور: 10-15 الذباب) و Act-Gal4 ، UAS-GFP / CyO ؛ tub-Gal80ts (الإناث العذراء: 10-15 الذباب) والسماح لهم بالتكاثر لمدة يوم واحد عند 18 درجة مئوية. يجب أن يكون عمر الذباب البالغ المختار 5-9 أيام لضمان خصوبة عالية.
  2. اسمح للذباب البالغ بوضع البيض في طعام الذبابة الموجود في القوارير لمدة 24 ساعة عند 18 درجة مئوية ، ثم قم بإزالة الذباب البالغ.
    ملاحظة: يتم إعداد الطعام الطائر باستخدام وصفة طعام دقيق الذرة القياسية من مركز ذبابة الفاكهة 8. يجب أن تحتوي كل قارورة على حوالي 10 مل من طعام الذبابة.
  3. اسمح للبيض بالاحتضان لمدة 6 أيام عند 18 درجة مئوية. خلال هذه الفترة ، سوف تفقس اليرقات.
  4. انقل القوارير التي تحتوي على يرقات إلى حاضنة 29 درجة مئوية واحتضنها لمدة 7 أيام أخرى.
    ملاحظة: خطوة الحضانة هذه اختيارية اعتمادا على التصميم التجريبي المحدد.

2. إعداد ذبابة الفاكهة من النوع البري البالغ لزراعة الأعضاء

  1. تخدير النوع البري أو الذباب البالغ المتحور المناسب مع 100٪ CO2 وفرز الذباب على أساس الجنسين. يمكن استخدام كل من الذباب الذكر والأنثوي كمضيفين للورم.
  2. قم بتثبيت قطعة من شريط الذبابة بطول 5 سم على شريحة مجهرية مع الجانب اللزج لأعلى عن طريق تثبيتها بقطعتين أصغر من الشريط ، واحدة في كل طرف.
  3. شل حركة الذباب عن طريق لصق أجنحتها على الشريط. استخدم الملقط أثناء المناورة بالذباب.
    1. كرر الخطوة المذكورة أعلاه ل 60-80 ذباب بالغ يستخدم كمتقبلات allograft.
      ملاحظة: من الأفضل تنظيم الذباب في صفوف أنيقة، مع محاذاة محور جسمه بالتوازي مع بعضها البعض لعملية حقن أكثر كفاءة من حيث الوقت في وقت لاحق. يوضح الشكل 1 صفوفا من الذباب المضيف مسجلة بهذه الطريقة.

3. تجميع جهاز الحاقن الذاتي

  1. قم بتوصيل كل من جهاز الحاقن التلقائي وسلك الطاقة بصندوق التحكم.
    1. اضبط حجم الحقن على 59.8 نانولتر. سيساعد ذلك في الحفاظ على الكمية المناسبة من قوى الشفط والحقن أثناء عملية الزرع.
  2. ضع صندوق التحكم والحاقن التلقائي على الجانبين المتقابلين من المجهر الضوئي.
    ملاحظة: بالنسبة للمشغلين الذين يستخدمون اليد اليمنى ، يجب وضع صندوق التحكم على الجانب الأيسر من المجهر مع وضع الحاقن على الجانب الأيمن. والعكس صحيح بالنسبة للمشغلين الذين يستخدمون اليد اليسرى.
  3. قم بإعداد الشعيرات الدموية الزجاجية مقاس 3.5 بوصة للاستخدام عن طريق قص الطرف المغلق باستخدام الملقط.
    1. قم بمعالجة أحد طرفي الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب ماصة دقيقة من أربع خطوات وقم بتسخينه إلى نهاية ضيقة ومغلقة باستخدام المواصفات التالية في الجهاز: الحرارة = 650 ، القوة = 200 ، والمسافة = 8. ضع الشعيرات الدموية بدقة في جهاز السحب وقم بتشغيل البرنامج بعد إدخال الإعدادات المذكورة أعلاه.
    2. استخدم الملقط لقص الشعيرات الدموية بزاوية 60 درجة تقريبا لجعل النهاية أكثر وضوحا لسهولة الدخول إلى بطن الذبابة البالغة1. انظر الشكل 2 للحصول على مثال على الشعيرات الدموية المقطوعة جيدا.
  4. قم بفك غطاء الحاقن برفق. اضغط باستمرار على الزر فارغ لدفع إبرة الحاقن حتى يظهر 70٪ -80٪ من طولها الإجمالي. لتسريع التقدم الشعري، اضغط على زر التعبئة مرة واحدة مع الضغط باستمرار على الزر إفراغ في نفس الوقت.
  5. استخدم حقنة لملء الشعيرات الدموية الزجاجية بالزيوت المعدنية. ثم ، أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية بعناية على إبرة الحاقن حتى يتم ربط الأول بقوة بالسدادة المطاطية للحاقن. الآن المسمار غطاء حاقن ضيق.
    1. امسح بقايا الزيوت المعدنية على السطح الخارجي للغطاء الشعري الزجاجي لتجنب تلويث الوسط أثناء عملية الزرع.

4. تشريح ورم الحلقة الوهمية SG

  1. اختر إحدى اليرقات وانقلها إلى صفيحة تشريح مملوءة ب 100 ميكرولتر من وسيط شنايدر للتحضير لتشريح الورم الحلقي الوهمي SG.
    ملاحظة: فقط العينات التي تؤوي الورم ستبقى كيرقات. وذلك لأن نمو الورم يؤخر تطور اليرقات وتقدمها9. ثلثا العينات لن تؤوي الورم وبالتالي ستكون قد تقدمت إلى شرانق / بالغين.
    1. لأغراض التشريح والزرع ، استخدم مجهرا مجسما مع نطاق تكبير 10x-20x.
  2. باستخدام زوج واحد من الملقط لتثبيت القسم الأوسط من جسم اليرقات ، قرصة رأس اليرقات باستخدام زوج آخر من الملقط وتطبيق قوة تمدد بالطول.
  3. حدد موقع SG على شكل Y لليرقات وعزلها عن بقية أنسجة اليرقات10.
  4. تشريح وعزل ورم الحلقة التخيلية SG عن طريق إزالة الأنسجة المجاورة. انظر الشكل 3 للحصول على وصف لعملية التشريح هذه.
  5. كرر الخطوات 4.1-4.4 للحصول على 10 إلى 20 أورام حلقية وهمية إضافية من SG بناء على الاحتياجات البحثية.

5. Allograft من ورم الحلقة الوهمية SG الأولية

  1. اغمر الشعيرات الدموية في وسط شنايدر الذي يحتوي على أورام الحلقة الوهمية SG الأولية. اضغط باستمرار على زر التعبئة لملء الشعيرات الدموية الزجاجية ب Schneider's Medium وصولا إلى الجزء العلوي الذي يبلغ طوله 0.5 سم. يجب أن يظل هذا الجزء العلوي ممتلئا بالزيوت المعدنية.
    ملاحظة: قم بتسريع هذه العملية عن طريق الضغط على الزر إفراغ مرة واحدة مع الضغط باستمرار على زر التعبئة في نفس الوقت.
  2. حدد موقع الورم الأساسي واضغط على زر التعبئة حتى يتم شفط الورم في الشعيرات الدموية.
    1. تأكد من أن الورم يجلس عند طرف الشعيرات الدموية أو على بعد عدة ملليمترات من طرف الشعيرات الدموية. هذا يساعد على تجنب انجراف الورم والضياع في المحلول الموجود داخل الشعيرات الدموية. انظر الشكل 4A للحصول على عرض توضيحي لموقع الورم المناسب أثناء جلوسه في الشعيرات الدموية.
  3. حدد موقع ذبابة بالغة مثبتة على الشريط الموجود على شريحة المجهر. باستخدام الملقط ، اضغط برفق على أسفل البطن. ثم ، اخترق البشرة الجانبية السفلية للبطن مع الشعيرات الدموية. اضغط على الزر إفراغ حتى يدخل الورم إلى بطن المضيف الجديد. انظر الشكل 4 باء للاطلاع على عرض توضيحي لهذه التقنية.
  4. باستخدام ملقط ، اضغط بلطف على أجنحة المضيف لإزالته من الشريط. ضع المضيف في قارورة جديدة مع الطعام الطازج. من الأفضل وضع القارورة جانبيا لمدة 24 ساعة أولية بعد الحقن. يجب أن تحتوي كل قارورة فقط على ما يصل إلى 20 ذبابة كحد أقصى.
    ملاحظة: سيكون لبعض الذباب المضيف أجنحة مفقودة وجروح أخرى على أجسامهم بعد الحقن وقد يلتصقون بطعام الذبابة إذا تم وضع القارورة في وضع مستقيم.
  5. كرر الخطوات من 5.2 إلى 5.4 لزرع الأورام الأولية المتبقية فيمضيفيها البالغين الجدد.
  6. تخلص من الشعيرات الدموية في حاوية الأدوات الحادة ونظف بقايا الزيوت المعدنية من الجزء الخارجي من الحاقن التلقائي قبل استبدال الجهاز مرة أخرى في صندوقه.
  7. تخزين قارورة المضيفين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 يوم ، ثم نقل القارورة إلى غرفة حضانة في 29 درجة مئوية. نقل مضيفات الطيران إلى قوارير جديدة كل 2-3 أيام.
  8. مراقبة مضيفات الذبابة يوميا وحساب معدلات البقاء على قيد الحياة. بعد أسبوع ، يجب أن تكون الأورام مرئية تحت مجهر ستيريو مع محول التألق ويمكن مراقبتها باستمرار لحجمها وتقدمها.

6. إعادة تجميع الأورام المزروعة

  1. حوالي 10-14 يوما بعد allograft ، فحص الأورام التي نمت في البطن المضيف باستخدام المجهر الفلوري.
  2. تخدير مضيف مع CO2 ووضعه في لوحة تشريح مليئة 100 ميكرولتر شنايدر المتوسطة. تشريح الورم المزروع من المضيف باستخدام زوجين من الملقط.
    1. استخدم زوجا واحدا من الملقط للضغط على البطن والزوج الآخر لفتح بشرة البطن ، مما يعرض الورم المحشوباللوغاريت 1.
    2. اعزل الورم بعناية عن الأنسجة المضيفة المرفقة قدر الإمكان باستخدام علامات التألق كدليل.
  3. كرر الخطوة 6.2 للتحضير لاثنين إلى ثلاثة أورام إضافية ملحقة.
  4. انقل صفيحة التشريح التي تحتوي على الأورام التي تم حصادها إلى مرحلة المجهر الضوئي.
  5. استخدم إبر معقمة وقم بتشريح الأورام إلى قطع أصغر مناسبة لحجم الشعيرات الدموية.
  6. كرر الخطوات 4.1-4.5 لإعداد الجيل الجديد من المضيفين البالغين وكرر الخطوات 5.1-5.7 لإكمال عملية زرع الأورام.
    ملاحظة: معدلات النجاح أعلى عموما للأورام غير الأولية مقارنة بالأورام الأولية.
  7. كرر الخطوات 6.1-6.6 لكل جيل لاحق من الذباب المستخدم في الدراسة.
    ملاحظة: اختر خطوط مضيف ذبابة الفاكهة المناسبة للاحتياجات التجريبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

هنا ، أجرينا عملية زرع الأجيال لأورام الحلقة الوهمية SG باستخدام جهاز الحقن الذاتي لحقن النانولتر وأجرينا تصويرا حيا لاحقا للورم باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري ، مما سمح بالغوص بشكل أعمق في مواضيع نمو الورم ، وهجرة الخلايا السرطانية ، والتفاعلات بين الورم والمضيف. عند تركيب ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن أن يساعد زرع الورم الباحثين على معالجة بعض المشاكل التي تنشأ أثناء نمو ورم ذبابة الفاكهة وتقدمه. أحد هذه التحديات هو التحايل على الوفيات المبكرة لليرقات الحاملة للورم أو البالغين أثناء زراعة الورم الأولية12. في هذا السياق ، يسمح استمرار زراعة الورم للأورام بالنمو إل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح للإعلان عنه بين المؤلفين.

Acknowledgements

نشكر أعضاء المختبر السابقين الدكتور شنغ آن يانغ والسيد خوان مارتن بورتيلا على مساهمتهم في تطوير هذا البروتوكول. نحن ممتنون لمختبر الدكتور يان سونغ في كلية علوم الحياة بجامعة بكين لمشاركة بروتوكولهم بشأن الزرع اليدوي. كما نشكر السيد كالدر إلسورث والسيد إيفرست شابيرو على القراءة النقدية للمخطوطة.

تلقت أسلحة الدمار الشامل تمويلا (GM072562 و CA224381 و CA227789) لهذا العمل من المعهد الوطني للصحة (https://www.nih.gov/) وتمويلا (IOS-155790) من المؤسسة الوطنية للعلوم (htps://nsf.gov/). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 980Also known as "Zeiss LSM 980"
Cornmeal Fly FoodBloomington Drosophila Stock CenterN/AAlso known as "BDSC Standard Cornmeal Food"
Dissection Needle (30Gx1/2)BD PrecisionGlide305106
Dissection PlateFisher Scientific12-565B
Fly TapeFisherbrand159015A
Fluoresence Adapter for Stero MicroscopeElectron Microscopy SciencesSFA-UVAlso known as "NightSea Fluorescence Adapter"
Fluoresence MicroscopeZeiss495015-0001-000Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8"
ForcepsFine Science Tools11251-10Also known as "Dumont #5 Forceps" 
Glass Capillary (3.5'')Drummond3-000-203-G/X
GlueElmerE305Also known as "Elmer Washabale Clear Glue"
Light MicroscopeZeiss435063-9010-100Also known as "Zeiss Stemi 305"
Micropipette PullerWorld Precision InstrumentsPUL-1000Also known as "Four Step Micropipette Puller"
Nanoject ApparatusDrummond3-000-204Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
Schneider's MediumThermoFisher21720001
Syringe (27G x1/2)BD PrecisionGlide305109
VialFisherbrandAS507

References

  1. Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
  2. Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
  3. Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. Pseudomonas Methods and Protocols. , Springer. 723-740 (2014).
  4. Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
  5. Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597(2012).
  6. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753(2011).
  7. Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
  8. Bloomington Drosophila Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , (2020).
  9. Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
  10. Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
  11. Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  12. Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51(2019).
  13. Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103(2013).
  14. Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
  15. Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
  16. Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168 NICD allograft

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved