JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول الإجراءات الجراحية والتقنية التي تمكن التصوير الفلوري متعدد الفوتونات في الجسم الحي لدماغ القوارض أثناء علاجات الموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة المركزة لزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ.

Abstract

يشكل حاجز الدم في الدماغ (BBB) تحديا رئيسيا لنجاح توصيل الأدوية إلى الدماغ. وقد برز التعرض بالموجات فوق الصوتية في وجود الفقاعات الدقيقة كوسيلة فعالة لزيادة نفاذية BBB بشكل عابر ومحلي ، مما يسهل نقل الأدوية عبر BBB. تصوير الأوعية الدموية أثناء العلاج بالموجات فوق الصوتية microbubble سيوفر رؤى قيمة وجديدة على آليات وديناميات العلاجات بالموجات فوق الصوتية microbubble في الدماغ.

هنا، نقدم إجراء تجريبيا للتنظير المجهري متعدد الفوتون داخل الفيتون باستخدام نافذة الجمجمة المنحازة إلى محول الحلقة وعدسة موضوعية 20x. هذا الإعداد يتيح عالية المكانية والزمنية القرار التصوير للدماغ خلال العلاجات الموجات فوق الصوتية microbubble. يتم الحصول على الوصول البصري إلى الدماغ عن طريق نافذة الجمجمة المفتوحة الجمجمة. باختصار، تتم إزالة قطعة قطرها 3-4 ملم من الجمجمة، ويتم إغلاق المنطقة المكشوفة من الدماغ مع غطاء زجاجي. يتم تركيب محول حلقة MHz 0.82 ، الذي يتم إرفاقه بزلة غلاف زجاجية ثانية ، على القمة. يستخدم Agarose (1٪ ث / v) بين غطاء محول وغطاء يغطي نافذة الجمجمة لمنع فقاعات الهواء، والتي تعوق انتشار الموجات فوق الصوتية. عندما يتم اتخاذ إجراءات الجراحة العقيمة والتدابير المضادة للالتهابات ، يمكن إجراء علاجات الموجات فوق الصوتية وجلسات التصوير بشكل متكرر على مدى عدة أسابيع. يتم حقن مترافقات الفلورسنت عن طريق الوريد لتصور الأوعية الدموية وتحديد الآثار الناجمة عن الموجات فوق الصوتية microbubble (على سبيل المثال ، حركية التسرب ، تغيرات الأوعية الدموية). توضح هذه الورقة موضع النافذة القحفية، وموضع محول الحلقة، وإجراءات التصوير، وخطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الشائعة، بالإضافة إلى مزايا والقيود المفروضة على الطريقة.

Introduction

من التحديات الرئيسية لعلاج الاضطرابات العصبية وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB). يحد BBB من الجزيئات الهيدروفيلية والمشحونة والقطبية والكبيرة (> 400 Da) من دخول الدماغ parenchyma1. طريقة واحدة تستخدم حاليا لتقديم العلاجات عبر BBB في الدماغ parenchyma هو استخدام الحقن داخل الجمجمة المجسمة2. وهناك طرق أخرى أقل توغلا قيد التحقيق يعوقها تعقيد التقنيات المستخدمة، مثل تصميم أدوية للتسليم بوساطة المستقبلات عبر BBB3، أو أنها محدودة في الدقة المكانية للمناطق المستهدفة، مثل الحقن داخل الجهاز الداخلي4 أو إدارة الحلول الضخولية5.

تم تطوير استخدام الموجات فوق الصوتية بالتزامن مع الفقاعات الدقيقة المحقونة بشكل منهجي ، وهو عامل تباين بالموجات فوق الصوتية ، كوسيلة غير باضعة لزيادة نفاذية BBB6 بشكل عابر. باستخدام محول مركز7 أو مجموعة مرحلية قابلة للتوجيه من محولات 8،9 ، يمكن استهداف الموجات فوق الصوتية إلى مناطق مختارة في الدماغ بدقة مستوى ملليمتر ، مما يقلل من الآثار خارج الهدف. يمكن تخصيص علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble لتشريح الدماغ لكل موضوع باستخدام التوجيه التصوير بالرنين المغناطيسي7،10،11،12،13،14 أو إطارات مجسمة15. وعلاوة على ذلك، يمكن التحكم في مدى الزيادة في نفاذية BBB في الوقت الحقيقي من خلال رصد الانبعاثات الصوتية من الفقاعات الدقيقة16,17,18. التجارب السريرية التي تحقق في سلامة وجدوى علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble هي حاليا في التقدم في جميع أنحاء العالم (على سبيل المثال، معرف ClinicalTrials.gov NCT04118764).

عادة ما يتم تقييم علاجات BBB بالموجات فوق الصوتية الدقيقة من خلال تأكيد الزيادات الناجمة عن العلاج في نفاذية BBB ، أو تصورها في التصوير بالرنين المغناطيسي المعزز على النقيض من ذلك ، أو عن طريق البذخ الصبغي في التصوير الحي أو الأنسجة الحية السابقة. ومع ذلك ، تم إجراء معظم التحليلات المجهرية في الجسم الحي ، بعد الانتهاء من علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble11،19 ، وبالتالي في عداد المفقودين الاستجابات البيولوجية الديناميكية أثناء ، وبعد ذلك مباشرة ، التعرض بالموجات فوق الصوتية. قد يساعد التصوير في الوقت الحقيقي الذي يتم إجراؤه أثناء التعرض بالموجات فوق الصوتية في فهم الآليات التي تقود علاجات BBB بالموجات فوق الصوتية والميكروبيل بالإضافة إلى الاستجابات في المصب ، مما قد يزيد من فهمنا لتطبيقاته العلاجية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام النوافذ القحفية المزمنة مع تقنيات التصوير في الجسم الحي من شأنه أن يمكن الدراسات الطولية من تقييم الجوانب الزمنية لعلاجات الموجات فوق الصوتية microbubble.

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف الإجراءات الجراحية والتقنية المطلوبة لإجراء تصوير متعدد الفوتون في الوقت الحقيقي لعلاجات الموجات فوق الصوتية الدقيقة للدراسات الحادة والمزمنة في القوارض (الشكل 1). ويتحقق ذلك في جزأين: أولا، لإنشاء نافذة الجمجمة لتمكين في التصوير في الجسم الحي، والثانية، لتركيب محول حلقة على الجزء العلوي لتمكين سونيكيشن المتزامنة والتصوير. وقد استخدمت النوافذ القحفية على نطاق واسع من قبل علماء الأعصاب للتصوير في الجسم الحي من اقتران الأوعية الدموية العصبية20، β اميلويد pathogenesis21، وعلم المناعة العصبي22، من بين أمور أخرى. في هذا البروتوكول، يتم وصف العمليات الجراحية لإنشاء النوافذ القحفية الحادة (غير الانتعاش) والمزمنة (الانتعاش) في جمجمة الفأر والجرذ. وقد تم توثيق منهجيات نافذة الجمجمة، ولا سيما للتجارب المزمنة، توثيقا جيدا23,24,25. لكي تكون متسقة مع الأدبيات الموجودة، سيتم استخدام مصطلحي "الحاد" و "المزمن" في جميع أنحاء هذا البروتوكول. كما تم وصف تصميم محولات الحلقات للتصوير في الجسم الحي سابقا26. على الرغم من توافر هذه التقنيات والرؤى التي يمكن الحصول عليها من التصوير في الوقت الحقيقي من علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble ، هناك عدد قليل جدا من مختبرات البحوث التي نشرت بنجاح الأدب باستخدام هذه التقنية26،27،28،29،30،31،32 . على هذا النحو ، في هذا البروتوكول ، يتم وصف التفاصيل الجراحية والتقنية لإجراء هذه التجارب في الوقت الحقيقي بالموجات فوق الصوتية microbubble. في حين تم تحسين معلمات سونيكيشن والتصوير المحددة لتجارب BBB ، يمكن أيضا التحقيق في الآثار الأخرى للتعرض بالموجات فوق الصوتية للدماغ ، مثل التعديل العصبي3334 ، β اميلويد مراقبة 31 ، واستجابات الخلايا المناعية32 ، باستخدام هذه التقنية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية التالية وتنفيذها وفقا للهيئة النرويجية للأغذية والسلامة، ولجنة رعاية الحيوانات التابعة لمعهد سانيبروك للأبحاث، والمجلس الكندي لرعاية الحيوانات.

1. إعداد المواد

  1. إعداد المواد اللازمة لجراحة نافذة الجمجمة وعلاجات الموجات فوق الصوتية microbubble. بالنسبة للنوافذ القحفية المزمنة ، من الضروري استخدام أدوات ومواد معقمة ، ومساحة جراحية معقمة ، وإدارة أدوية ما قبل الجراحة وما بعدها23،24،25.
  2. محول وإعداد غطاء
    1. التحقق من السلامة البدنية للمحول: ابحث عن الشقوق والخدوش. تأكد من سلامة الأقطاب الكهربائية في الجزء العلوي والجانبي من المحول.
    2. إيداع الغراء سيانواكريلات في طبق صغير. استخدام قضيب لنشر طبقة رقيقة من الغراء على سطح محول.
    3. ضع المحول على غطاء الزجاج. اضغط لأسفل بقوة لمدة 20-30 s.
      ملاحظة: يمكن استخدام قالب مطبوع ثلاثي الأبعاد لتسهيل محاذاة غطاء الزجاج مع محول الحلقة، مما يضمن وجود ضغط ثابت وحتى على محول الأغطية والحلقة (الشكل 2).
    4. تحقق من وجود فقاعات بين محول و coverslip. إذا كانت هناك فقاعات، واتخاذ coverslip قبالة وكرر من الخطوة 1.2.3.، كما الهواء يعوق انتشار الموجات فوق الصوتية. علاج بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    5. بمجرد الالتزام بقسيمة أغطية زجاجية ، تطابق المحول (الشكل 3).
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول محول حلقة زيركونات من الرصاص المصنع داخليا (قطر خارجي 10 مم، سمك 1.4 مم، ارتفاع 1.2 مم)35، مطابق لمعاوقة 50 Ω و0° تحميل المرحلة مع دائرة مطابقة مخصصة. يتم دفع محول في 0.82 ميغاهرتز في وضع سمك, إنتاج بقعة بؤرية دائرية تقريبا 1 مم تحت غطاء. وقد تم وصف محولات الحلقات ذات الخصائص المماثلة (قطرها الخارجي 10 مم، سمكها 1.5 مم، ارتفاعها 1.1 مم)26 واستخدمت على نطاق واسع لتجارب المجهر متعددة الفوتون27،28،29،31،32،36.
  3. إعادة استخدام محول واستبدال غطاء
    1. استبدل غطاء الغطاء إذا كان متصدعا أو يحتوي على حطام (على سبيل المثال، الفراء والغراء) من التجربة السابقة. لإزالة غطاء الغطاء، قم بإذابة الغراء عن طريق غمر محول الألوان والأغطية في الأسيتون لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: قد يؤثر الأسيتون على سلامة محول و/أو أقطاب كهربائية. تحقق مع الشركة المصنعة قبل المتابعة مع هذه الخطوة.
    2. تحقق مما إذا كان الأسيتون قد حل الغراء عن طريق سحب بلطف على coverlip مع ملقط. تحقق مرة واحدة كل 10 دقائق لتجنب التعرض الأسيتون لفترات طويلة.

2. إعداد الحيوان

  1. تخدير الحيوان باستخدام مزيج من الهواء الطبي والأوكسجين والايسوففلوران في غرفة التعريفي.
    ملاحظة: تم الإبلاغ عن استخدام الأكسجين كغاز حامل للتأثير على نصف عمر microbubbles37,38 ويقلل من حجم الزيادات الناجمة عن الموجات فوق الصوتية microbubble في نفاذية BBB27، ولكن قد يقلل أيضا من خطر نقص الأكبسجة والوفيات39. اختيار الغازات الناقلة على أساس أهداف المشروع والمشورة البيطرية. ويمكن أيضا أن تستخدم التخدير عن طريق الحقن مثل كوكتيل الكيتامين / xylazine; ومع ذلك، فمن الأسهل للسيطرة على مستوى التخدير ومستويات الأكسجين في الدم عند استخدام التخدير استنشاقه.
  2. تأكد من أن الحيوان قد حقق مستوى كاف من التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم. وزن الحيوان لتحديد جرعة dextran، microbubbles، والأدوية لإدارة. إزالة الفراء من رأس الحيوان ووضع الحيوان على إطار مجسمة.
  3. بالنسبة للتجارب الحادة ، يجب تحديد إمكانية الوصول إلى الدورة الدموية الجهازية لحقن الدكستران والفقاعات الدقيقة. ولتحقيق ذلك، أدخل قسطرة 27 غرام في وريد الذيل.
    ملاحظة: في حين أن الحقن المدارية الرجعية ممكنة أيضا ، يوصى باستخدام عروق الذيل نظرا لمحدودية مساحة العمل في منطقة الرأس أثناء التصوير متعدد الفوتون.
  4. نقل الحيوان على الإطار المجسمة والتبديل التخدير إلى مخروط الأنف. الحفاظ على درجة حرارة الحيوان الأساسية من 37 درجة مئوية باستخدام مصدر الحرارة، مثل وسادة التدفئة أو قفاز مملوءة بالماء الدافئ.
  5. مراقبة درجة حرارة الحيوان باستخدام مسبار المستقيم، وعلم وظائف الأعضاء الحيوانية باستخدام مقياس أكسدة النبض. تطبيق مرهم العيون. حقن المسكنات المناسبة قبل الجراحة و / أو الأدوية المضادة للالتهابات (انظر جدول المواد).
  6. قبل بدء جراحة نافذة الجمجمة، تحقق من مستوى التخدير ومعدل ضربات قلب الحيوان وتشبع O2 ومعدل التنفس ودرجة الحرارة.
  7. لبدء جراحة نافذة الجمجمة، قم بإزالة الفراء على الرأس عن طريق تطبيق كريم إزالة الشعر و / أو استخدام مقصات الفراء. إزالة الفراء من بين العينين إلى النصف الأمامي من الرقبة (الشكل 4A).
    ملاحظة: الاتصال المطول مع كريم إزالة الشعر سيحرق الجلد. بالنسبة إلى جراحات النوافذ القحفية المزمنة، اغسل فروة الرأس بمناديل متناوبة من البيتادين و70٪ EtOH بعد إزالة الفراء. إعداد المساحة الجراحية للجراحة العقيمة. يجب الحفاظ على العقم حتى الخطوة 2.15.
  8. لإزالة فروة الرأس، ارفع الجلد بين العينين باستخدام ملقط في اليد غير المهيمنة، على طول خياطة القوس. باستخدام مقص منحني، قم بإزالة الجلد لكشف العظام الجدارية (الشكل 4B). تطبيق ضغط ثابت مع مسحة القطن إذا كان هناك نزيف من الجمجمة أو فروة الرأس; يجب إيقاف النزيف قبل التقدم إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: بالنسبة للجراحات الحادة، يمكن دفع الجلد إلى الخلف والالتزام بالجمجمة باستخدام غراء سيانواكريلات سائل أو لاصق للأنسجة.
  9. إزالة periosteum تغطي السطح الخارجي للجمجمة باستخدام مسحات القطن.
  10. باستخدام مجهر التشغيل (6-25x) ومثقاب الأسنان (0.5 ملم حفر بور، متوسط السرعة)، مخطط دائرة على العظام الجدارية للاحتفال الموقع المطلوب من النافذة الجمجمة على الجمجمة (الشكل 5). تجنب خياطة القوس، لامبدا، وبريغما، وهذه المناطق هي أرق وتراكب الأوعية الدموية الكبيرة.
    ملاحظة: لتسهيل الحفر، يمكن رسم مخطط إطار الجمجمة على الجمجمة باستخدام علامة والاستنسل (الشكل 5A). بالنسبة للفئران ، قد يكون من الأسهل حفر نافذة مستطيلة ، بدلا من دائرية ، الجمجمة. نظرا لسمك عظمة جمجمة الفئران، استخدم بت حفر 0.7 مم لتحديد نافذة الجمجمة في العظم المضغوط قبل استخدام بت حفر 0.5 مم لإكمال عملية الحفر.
  11. تطبيق ضغط لطيف مع بت الحفر. يزيد الضغط المفرط من خطر التسبب في تلف أنسجة الدماغ. لمنع الجمجمة من ارتفاع درجة الحرارة أثناء الحفر ، بالتنقيط المالحة على الجمجمة باستخدام حقنة ، أو تطبيق قطعة من الإسفنج الجراحي غارقة في المالحة.
  12. بالتناوب بين الحفر وتبريد الجمجمة حتى تنفصل جزيرة العظام الناتجة عن بقية الجمجمة. تحقق من تقدم الحفر عن طريق تطبيق ضغط لطيف على جزيرة العظام باستخدام ملقط أو بت الحفر. واصل الحفر حتى تنفصل جزيرة العظام عن بقية الجمجمة.
    ملاحظة: الشقوق الصغيرة في أنحف مناطق الجمجمة هي مؤشر جيد على أن الحفر قد اكتمل تقريبا. محاولة إزالة جزيرة العظام قبل الأوان يمكن أن يسبب قطعة من العظام لاختراق أنسجة الدماغ، وإتلاف دورا وتسبب الالتهاب والنزيف.
  13. إزالة جزيرة العظام باستخدام زوج من ملقط ناعم لفهم حواف، أو طبقة العظام المدمجة العليا، من جزيرة العظام (الشكل 6A). تأكد من أن الدماغ يبقى رطبا عن طريق وضع قطعة من الإسفنج الجراحي الذي تم نقعه مسبقا في المالحة. إذا لوحظ النزيف، ضع الإسفنج الجراحي على المنطقة التي تنزف. لا تنتقل إلى الخطوة التالية حتى يتوقف النزيف.
    ملاحظة: إذا استمر النزيف بعد 5 دقائق، فلا يمكن استخدام الحيوان في تجارب التصوير متعددة الفوتون. بالنسبة للفئران ، قد يكون من الضروري إزالة الدورا إذا كانت سميكة. لإزالة دورا، استخدم تكبير عالية على المجهر التشغيل وزوج من ملقط غرامة.
  14. لوضع نافذة الجمجمة، والتقاط غطاء زجاجي مع زوج من ملقط، ووضع قطرة من المالحة على جانب واحد، والمناورة على ثقب في الجمجمة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء تحت غطاء.
    ملاحظة: استخدم غطاء زجاجي مقاس 5 مم للفئران، و8 مم للفئران. بالنسبة للفئران ، بسبب سماكة عظم الجمجمة ، استخدم محلول الآجروز بدلا من المالحة لملء الفراغ بين الغطاء والدماغ. كما يمكن أيضا الالتزام بالمحول وزلة الأغطية الخاصة به مباشرة على الجمجمة ، بدلا من استخدام غطاء منفصل للنافذة القحفية. لهذا الخيار، انتقل إلى الخطوة 3.1. راجع الشكل 1 للحصول على التفاصيل.
  15. نشر طبقة من الغراء سيانواكريلات حول محيط غطاء (الشكل 6B) لإرفاقه إلى الجمجمة. تأكد من عدم وجود الغراء تحت غطاء. تطبيق الضغط على غطاء لضمان أن الغراء لا يأتي في اتصال مع الدماغ.
  16. مرة واحدة في الغراء جافة تماما، حتى خارج سطح الغراء باستخدام حفر الأسنان. تأكد من إزالة جميع حطام الغراء من المنطقة الجراحية.
    ملاحظة: بالنسبة للنوافذ القحفية المزمنة، قم بحقن الأدوية اللازمة بعد الجراحة (انظر جدول المواد)، وتوفير مرهم للعناية بالجروح والأطعمة اللينة، واستعادة الحيوان تحت مصباح حراري.

3. وضع محول الحلقة

  1. إعداد الحل 1٪ (ث / v) agarose. في كوب صغير أو قارورة Erlenmeyer، أضف 0.1 غرام من الآغروز و10 مل من PBS (1x) أو المالحة. يغلي الحل حتى يذوب الأغاروز بالكامل عن طريق وضع الكأس على لوحة ساخنة أو تسخين المحلول في فرن الميكروويف (30-45 ق).
  2. الخطوات 3.2-3.5 حساسة للوقت حيث يبرد حل الآغاروز بسرعة. سحب ~ 0.5 مل من الآغاروز في حقنة 1 مل.
    ملاحظة: لحماية سلامة الدماغ، تأكد من أن درجة حرارة الآغاروز تقارب درجة حرارة الجسم قبل الاستخدام.
  3. إيداع agarose بتحرر على غطاء النافذة القحفية.
    ملاحظة: إذا كان الأنسجة بلانش، كانت درجة حرارة agarose عالية جدا. يجب أن يقتل الحيوان إذا لم يكن هناك غطاء منفصل يغطي الدماغ (أي يتم وضع محول وغطاء له مباشرة على الدماغ، انظر الخطوة 2.14)، ثم ينبغي أن تودع agarose على سطح الدماغ في هذه الخطوة.
  4. ضع محول على النافذة القحفية (الشكل 6C). تطبيق ضغط ثابت بحيث يكون هناك الحد الأدنى من الآجروز بين محول ونافذة الجمجمة. تأكد من أن يتم توسيط محول (XY-plane) ومتوازي (Z-plane) إلى نافذة الجمجمة، وأنه لا توجد فقاعات الهواء في agarose.
  5. عندما يبرد الآغروز إلى اتساق يشبه جيلو ، اقطع الآغاروز الزائد من محيط غطاء المحول باستخدام ملعقة أو مشرط. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء تحت غطاء محول.
  6. باستخدام ملعقة ، نشر طبقة من الغراء السيانواكريلات على محيط غطاء محول ، وتمتد إلى الجمجمة ، بحيث يتم الالتزام بقوة محول إلى الجمجمة.
  7. الحفاظ على ضغط ثابت على محول حتى الغراء قد جفت تماما (10-15 دقيقة).

4. التصوير المجهري متعدد الفوتون

  1. ضع الحيوان تحت العدسة الموضوعية (الشكل 7A). تأكد من أن العدسة الهدف يتمحور في محول الحلقة، وبالتوازي مع محول (الشكل 7B). إذا تم استخدام عدسة هدف الغمر بالماء، املأ مركز محول الحلقة بالماء المتأين والمتخلص من الغاز.
    ملاحظة: الماء degassed مهم لنشر الموجات فوق الصوتية المناسبة.
  2. ابدأ بعدسة الهدف في أعلى موضع لها، ثم قم بخفض العدسة الهدف ببطء حتى تصبح داخل محول الحلقة (الشكل 7A، B). تأكد من أن العدسة الموضوعية لا تصطدم مع محول أو غطاء.
    ملاحظة: بالتناوب بين العدسة للتحقق مما إذا كان وضع Z للعدسة الهدف في المستوى مع سطح الدماغ، والعين لضمان أن العدسة الهدف لا تصطدم مع محول أو coverslip. قد يكون من الأسهل تصور الأوعية الظنسة من خلال العدسة بعد حقن ديكتران الفلورسنت من خلال الوريد الذيل (الشكل 7C).
  3. قم بإعداد المجهر متعدد الفوتون للتصوير.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مجهرا متعدد الفوتون مستقيما وعدسة موضوعية 20-25x التي لديها مسافة عمل 2 مم ، وهو ما يكفي للتركيز خارج الغطاء (الأغطية) ، إلى بارنشيما الدماغ.
  4. أعد الدكستران. إضافة المبلغ المناسب من برنامج تلفزيوني إلى قارورة dextran، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. دوامة حل dextran لمدة 1-3 دقيقة لضمان أن مسحوق dextran يذوب تماما. حقن محلول الدكستران في الوريد الذيل.
  5. إعداد مسح للصور
    1. باستخدام العدسة، تأكد من أن العدسة الموضوعية موازية للدماغ. إمالة الحيوان لتصحيح لXZ وYZ المحاذاة.
    2. حدد حقل الرؤية في مجهر متعدد الفوتون. إعداد فحص XYZ قبل التعرض بالموجات فوق الصوتية للحصول على صورة أساسية للvasculature قبل التعرض للموجات فوق الصوتية.
      ملاحظة: معلمات التصوير النموذجية كما يلي: 300-800 ميكرومتر في العمق، 2-5 ميكرومتر حجم الخطوة، و 10-20 وقت مكدسات. تأكد من عدم ملامسة العدسة الموضوعية للمحول أو غطاء الغطاء عند أدنى نقطة له أثناء تسلسل التصوير.

5. التعرض بالموجات فوق الصوتية

  1. تأكد من توصيل جميع كبلات BNC بشكل صحيح (الشكل 3).
  2. قم بإعداد فحص صور XYZT طويل بما يكفي لالتقاط أكوام الصور قبل وأثناء وبعد علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble.
  3. إعداد الفقاعات الدقيقة باتباع تعليمات الشركة المصنعة. حقن الفقاعات الدقيقة في الوريد الذيل والبدء في التصوير.
    ملاحظة: يمكن أن يتم حقن Microbubble مع ضخ مضخة لضمان معدل حقن متسقة وتمكين حقن الفقاعات الدقيقة المتزامنة والتصوير. إذا كان سيتم حقن الفقاعات الدقيقة أثناء التصوير، فتأكد من إمكانية الوصول بسهولة إلى وريد الذيل دون تعريض الكاشفات للضوء المحيط.
  4. بدء سونيكيشن.
    ملاحظة: معلمات sonication النموذجية هي كما يلي: 10 دورات مللي ثانية، ومؤشر ميكانيكي من 0.2-0.4، وترددات تكرار النبض بين 1-4 هرتز. تم دراسة معلمات سونيكيشن والميكروبل المستخدمة في دراسات الموجات فوق الصوتية قبل السريرية microbubble على نطاق واسع وموثقة توثيقا جيدا في الأدب (على سبيل المثال انظر 40 للمراجعة).
  5. مواصلة التصوير متعدد الفوتون طوال مدة سونيكيشن وبعد نهاية sonication. كن ملاحظا للبذخ الدكستران من الأوعية الدموية ، لأن هذا يدل على زيادة نفاذية BBB.
    ملاحظة: إذا تم الكشف عن الدكستران في الفضاء خارج الأوعية الدموية، ولكن في محيط مجال الرؤية، ثم قد يكون هناك الأوعية الدموية المتضررة خارج مجال الرؤية. وهذا يمكن أن ينتج عن اختلال محول مع التركيز من العدسة الهدف. في هذا السيناريو، من الأسهل ضبط مجال الرؤية عن طريق تحريك العدسة الموضوعية أو عن طريق إعادة وضع الحيوان، بدلا من إعادة تنظيم المحول.
  6. بمجرد الانتهاء من التصوير، قتل خلع عنق الرحم الحيواني تحت التخدير العميق أو الاختناق ثاني أكسيد الكربون. للنوافذ القحفية المزمنة، نشر طبقة من أسمنت الأسنان على الجمجمة المكشوفة.
    ملاحظة: بالنسبة للنوافذ القحفية المزمنة، يمكن خياطة الجلد المحيط بالنافذة، على الرغم من أن ذلك ليس ضروريا، بسبب إزالة فروة الرأس في الخطوة 2.8.

6. تحليل الصور

  1. تصدير مداخن الصور.
  2. تحليل الصور مع برامج تحليل الصور (على سبيل المثال، أوليمبوس فلوفيو، ImageJ / فيجي، بيتبلان Imaris، ThermoFisher العلمية أميرة) و / أو أدوات البرمجة (على سبيل المثال، بيثون، MATLAB).

النتائج

يمكن الكشف عن علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble الناجحة عن طريق البذخ من الدكستران الفلوري من داخل الأوعية الدموية إلى الفضاء خارج الأوعية الدموية (الشكل 8) ، مما يشير إلى زيادة في نفاذية BBB. اعتمادا على مجال الضغط من محول الحلقة، سوف تتأثر الأوعية الدموية و / أو الشعيرات الدموية.

لتقييم التغيرات الوعائية الناجمة عن علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble ، يمكن قياس قطر وعاء الاهتمام قبل وأثناء وبعد العلاج بالموجات فوق الصوتية microbubble (الشكل 9). ويمكن القيام بذلك يدويا في برنامج متاح تجاريا (مثل برنامج أوليمبوس فلوفيو). أثناء الحصول على الصورة، يمكن أيضا استخدام حقن بولوس ديكتران ومسح الخط لتقييم تدفق الدم30,41. لتقييم الحركية من تسرب dextran كنموذج تمثيلي لتسليم المخدرات، وكثافة إشارة بين داخل وخارج الأوعية الدموية الفضاءات يمكن تقييمها باستخدام أدوات مثل MATLAB26،27،29،41 (الشكل 10).

ويمكن تحقيق مزيد من معالجة الصور باستخدام ImageJ / فيجي. ImageJ/FIJI هو برنامج مفتوح المصدر متوافق مع MATLAB ومناسب تماما لإجراء تحليلات شائعة في تحليل الصور البيولوجية ، مثل قياس تغيرات الأوعية الدموية ، أو أطوال أو المسافة بين الأجسام الفلورية (على سبيل المثال ، لويحات β أميلويد إلى الأوعية الدموية). يمكن أن تكون خطوط أنابيب معالجة الصور التي تم إنشاؤها في ImageJ/FIJI تلقائية عن طريق كتابة وحدات ماكرو مخصصة.

ويمكن إجراء تحليلات أكثر تعقيدا، مثل تجزئة الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد وتتبع الخلايا، باستخدام برامج أكثر تقدما وشبه آلية (الشكل 11). بعد التقسيم، يمكن إجراء تحليلات أكثر تحديدا، مثل تصنيف الأوعية الدموية كشرايين أو فينول أو الشعيرات الدموية، استنادا إلى القطر والمتفرعة وأنماط التوروسية واتجاه التدفق42,43. كما تم تطوير خوارزميات التعلم الآلي لأتمتة تجزئة الأوعية الدموية22244.

figure-results-2199
الشكل 1: سير العمل العام لتجارب الدماغ متعددة الفوتوناتات متعددة الفوتوناتات. يظهر سير عمل عام لتجارب الدماغ متعددة الفوتونات بالموجات فوق الصوتية والميكروبابل الموصوفة في هذا البروتوكول. هناك 6 خطوات: (أ) إعداد الحيوان للفئران (A1) و (A2) الفئران، (ب) حقن دكستران، (C) حقن الفقاعات الدقيقة، (D) التصوير قبل العلاج، (E) العلاج والتصوير، (F) التصوير بعد العلاج وتحليل البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3045
الشكل 2: المقطع العرضي وعرض أعلى من العفن المطبوعة 3D. (أ) المقطع العرضي من القالب. طبقة رقيقة من الغراء سيانواكريلات يتم تطبيقها على السطح العلوي من محول الحلقة، ويتم وضع غطاء على القمة. يمكن استخدام الطابع لتطبيق ثابت، حتى الضغط على غطاء الغطاء ومحول الحلقة. (ب) أعلى عرض للقالب. يمكن إضافة درجة في القالب لتسهيل إزالة محول المعدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3746
الشكل 3: إعداد الموجات فوق الصوتية. يتم عرض الأجهزة النموذجية لتجارب الموجات فوق الصوتية. يتم تعيين معلمات الموجات فوق الصوتية ويتم تشغيلها بواسطة مولد الإشارة وتضخيمها بواسطة مكبر الصوت. يمكن استخدام عداد الطاقة لتسجيل القوى الأمامية والمنعكسة قبل إرسال الإشارة إلى مربع المطابقة ، والذي يتطابق مع المحول. يتم تحقيق جميع الاتصالات باستخدام كبلات BNC ما لم يذكر خلاف ذلك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4451
الشكل 4: منطقة إزالة الفراء وإزالة فروة الرأس. (أ) يجب أن تبدأ إزالة الفراء من بين العينين وتمتد حتى النصف الأمامي من الرقبة. (ب) يجب أن تكون إزالة فروة الرأس كافية لكشف العظام الجدارية. يجب إيقاف النزيف قبل المتابعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5036
الشكل 5: مخطط تفصيلي للنافذة الجمجمة. تقع النافذة القحفية على عظمة الجدار. (أ) يمكن رسم مخطط للنافذة الجمجمة على الجمجمة للمساعدة في عملية الحفر. (ب) يمكن رؤية مخطط النافذة القحفية بعد الحفر من خلال العظام المدمجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5618
الشكل 6: نافذة الجمجمة ومحاذاة محول. (أ) يتم إنشاء نافذة الجمجمة على عظم الجدار. تمت إزالة جزيرة العظام، مما يعرض الدماغ تحتها. (ب) اكتمال النافذة القحفية عندما يتم إغلاق غطاء زجاجي على الجمجمة باستخدام الغراء السيانواكريلات. (ج) يتم توسيط محول إلى نافذة الجمجمة والالتزام باستخدام الغراء سيانواكريلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6305
الشكل 7: تحديد المواقع من عدسة الهدف والمحول. (A، B) وتتركز العدسة الهدف إلى محول الحلقة. (ج) الأوعية الدموية مليئة dextran الفلورسنت مرئية من خلال العدسة، تحت epifluorescence. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6849
الشكل 8: أقصى صور الإسقاط متعددة الصور من الموجات فوق الصوتية microbubble الزيادات الناجمة في نفاذية BBB. صور الإسقاط القصوى من الأوعية الدموية (A) قبل و (ب) بعد علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble. يمكن تأكيد علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble الناجحة من خلال ملاحظة الزيادات في نفاذية BBB بعد العلاج ، وتصور على أنها إسراف الفلورسنت dextran (السهام). شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7605
الشكل 9: تحليل التموج الوعائي الناجم عن علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble. صور الإسقاط القصوى للأوعية الدموية الدماغية قبل وأثناء وبعد علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble. الفقاعات الصغيرة موجودة في جميع الصور. بالمقارنة مع (أ) حالات ما قبل العلاج ، يمكن ملاحظة التموج الوعائي الواضح (B) أثناء علاجات الموجات فوق الصوتية الدقيقة (السهام الحمراء). الموجات فوق الصوتية microbubble بوساطة الزيادات في نفاذية BBB واضحة أيضا بعد العلاج من تسرب dextran الفلورسنت من داخل الأوعية الدموية إلى الفضاء خارج الأوعية الدموية (السهام الصفراء). (ج) عند إيقاف تشغيل الموجات فوق الصوتية، تعود أقطار الأوعية الدموية إلى ما قبل العلاج، وأحجام خط الأساس. (د) يمكن تحليل التغيرات الوعائية عن طريق رسم قطر وعاء الاهتمام قبل وأثناء وبعد العلاج بالموجات فوق الصوتية microbubble. شريط المقياس: 100 ميكرومتر (عمل غير منشور). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8814
الشكل 10: تحليل حركية التسرب بعد علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble. يتم تصور الزيادة في نفاذية BBB كتسرب من الدكستران الفلوري من داخل الأوعية الدموية إلى الفضاء خارج الأوعية الدموية. التغيرات في نفاذية BBB واضحة عند مقارنة أكوام الصور المكتسبة (A) قبل و (ب) بعد علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble. (ج) يمكن تحليل حركية التسرب عن طريق تتبع كثافة وحجم وسرعة الدكستران في مقصورات خارج الأوعية الدموية (المستطيل الأصفر). شريط المقياس: 50 ميكرومتر (عمل غير منشور.) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9670
الشكل 11: تجزئة الأوعية الدموية من مكدس XYZ المجهر متعدد الفوتون. (A) عمق (XYZ) كومة من الأوعية الدموية في الفئران EGFP المعدلة وراثيا. يتم تصور الأوعية الدموية عن طريق الحقن الوريدي من الفلورسنت تكساس الأحمر 70 kDa dextran (أحمر). تظهر القناة الخضراء الخلايا الفلورية والأنسجة الذاتية. (ب) يتم إنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية، ثم يتم ترميزها بالألوان وفقا لنوع الأوعية الدموية لتسهيل التحليلات الخاصة بنوع معين. الوريد / venules زرقاء ، والشرايين / الشرايين حمراء ، والشعيرات الدموية هي سماوي. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. عمليات إعادة الإعمار التي تم إنشاؤها باستخدام بيتبلان Imaris. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

مراقبة المجهر متعدد الفوتون داخل الدماغ هو أداة قيمة لدراسة استجابات الدماغ أثناء التعرض للموجات فوق الصوتية. على حد علمنا ، فإن البروتوكول الموصوف هنا هو الطريقة الوحيدة لإجراء تصوير مجهري متعدد الفوتون لبارنشيما الدماغ أثناء علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble. إنشاء النوافذ القحفية واستخدام محولات الحلقة تسمح في الوقت الحقيقي رصد الأوعية الدموية والخلوية ، وغيرها من الاستجابات المصب لعلاجات الموجات فوق الصوتية microbubble في ارتفاع القرار المكاني والزمني. وقد أجرت مجموعات أخرى التصوير المجهري متعدد الفوتون بعد الانتهاء من علاجات الموجات فوق الصوتية microbubble ، وبالتالي في عداد المفقودين استجابة في الوقت الحقيقي من parenchyma الدماغ للعلاجات19. يوفر الإجراء الموصوف تحكما زمنيا محسنا ، مما يسمح بجمع البيانات التي قد تساعد في إلقاء الضوء على الآليات الحادة وراء علاجات الموجات فوق الصوتية. يمكن استخراج البيانات الكمية والنوعية وتحليلها من أكوام الصور المكتسبة ، مثل الحركية البذخ27،29،30 ، والتغيرات في حجم لوحة β اميلويد31 ، وديناميات الخلية32.

تم تمييز عدة خطوات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في البروتوكول. أولا، تم التأكيد على الخطوات الجراحية المعرضة بشكل خاص لخطأ المشغل، مثل استخدام الآغاروز أثناء جراحة نافذة الجمجمة ووضع المحول. كما تم توفير خطوات لمنع إزعاج الحيوانات ووفاتها، بما في ذلك مراقبة فسيولوجيا الحيوان أثناء الجراحة، ودوامة الدكستران بدقة قبل الحقن. ثانيا، تم تسليط الضوء أيضا على المواصفات الفيزيائية للمحول، ومحاذاة العدسة الهدف، والمحول، والنافذة القحفية. يجب تحديد مواصفات محول الحلقة وخصائصه الصوتية في الاعتبار العدسة الموضوعية المستخدمة وكذلك النموذج الحيواني. على وجه التحديد ، يجب أن يكون القطر الداخلي لمحول الحلقة كبيرا بما يكفي لمحاصرة العدسة الموضوعية ، ولكنه صغير بما يكفي لتركيبه بشكل آمن على جمجمة الحيوان. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تتوافق المنطقة المحورية للمحول مع نطاق العدسة الموضوعية المستخدمة.

التحدي المشترك هو أن نافذة الجمجمة ومحول الحلقة هي الزاوية بالنسبة للعدسة الهدف. يضمن التوسيط السليم (XY) والمحاذاة (Z) للعدسة الهدف مع النافذة القحفية والمحول أن المنطقة المحورية للمحول ، وبالتالي منطقة أنسجة الدماغ المعالجة ، تتماشى مع مجال الرؤية التصويري ، وتقلل من خطر الاصطدام بين العدسة الهدف والمحول أثناء التصوير. يمكن تحقيق المحاذاة عن طريق ضبط موضع رأس الحيوان و / أو عن طريق تدوير الإطار المجسم الذي يتم إصلاحه فيه.

وينبغي اختيار مكونات المجهر (مثل أجهزة الكشف، ومقسمات الشعاع) ومعلمات الحصول على الصور على أساس هدف الدراسة. هنا ، يتم استخدام عدسة موضوعية مع طول بؤري طويل (> 2 ملم) بسبب وجود coverslip (ق) ومحول حلقة تقع بين العدسة الهدف والدماغ. كما يوصى بالمجهر المستقيم لأنه يسمح بمساحة أكبر للمناورة على الحيوان ، خاصة بالنسبة لتجارب الدماغ. لالتقاط حركية التسرب الناجم عن الموجات فوق الصوتية microbubble للصبغة داخل الأوعية الدموية ، فإن الدقة الزمنية العالية مواتية ، والتي يمكن تحقيقها باستخدام نظام المسح بالرنين. الجمع بين هذا مع نظام الكشف عن حساسية عالية، مثل أجهزة الكشف عن الفوسفيد أرسينيد الغاليوم (GaAsP)، وسوف يؤدي أيضا إلى صور أكثر ملاءمة.

الإجراء التجريبي المقدم له عدة قيود. أولا ، الإجراء الجراحي هو الغازية جدا ، وأفيد أن يسبب التهاب45 ، على الرغم من أن الالتهاب يمكن التقليل من 46. وعلاوة على ذلك، لوحظت الاستجابات المناعية الناجمة عن جراحات نافذة الجمجمة لحلها من قبل 2-4 أسابيع بعد الجراحة23،24،25. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسبب عملية الحفر، خاصة عندما تتم بقوة أو سرعة مفرطة، تلفا للأنسجة الأساسية بسبب توليد الحرارة والاهتزاز والضغط المطبق. كما لوحظ أن جراحات النوافذ القحفية والتصوير متعدد الفوتون تؤثر على درجة حرارة الدماغ47. يمكن تقليل هذه القيود إلى حد ما من خلال إنشاء دقيق للنوافذ القحفية البكر ، والتعافي السليم للحيوانات ذات النوافذ القحفية المزمنة ، والحفاظ على درجة حرارة الجسم normothermic باستخدام مصدر التدفئة مع التحكم في التغذية المرتدة. ثانيا، عمق التصوير محدود بالمجهر والعدسة الموضوعية المستخدمة. على سبيل المثال ، لا يمكن دراسة تأثير علاج الموجات فوق الصوتية الدقيقة في هياكل الدماغ العميقة ، مثل قرن آمون ، دون تدابير أكثر غزوا ، مثل إزالة الأنسجة القشرية المفرطة48 ، أو استخدام الميكروسيلينات بالتزامن مع الاختراق القشري49. استخدام عدسة موضوعية مع مسافة عمل طويلة يمكن حل هذه المسألة إلى حد ما، ولكن تغلغل الضوء محدودة أيضا في أعماق أكبر.

في حين تم الحصول على الصور التمثيلية لهذا البروتوكول من القوارض البرية ، يمكن أيضا تطبيق الإجراء التجريبي المقدم على الحيوانات المعدلة وراثيا ونماذج المرض ، مثل مرض الزهايمر31. يمكن أيضا مراقبة تجارب الموجات فوق الصوتية التي لا علاقة لها بتعديل BBB ، مثل التعديل العصبي الناجم عن الموجات فوق الصوتية ، باستخدام هذا البروتوكول3334. يمكن تحقيق تطبيقات أخرى ممكنة باستخدام مجهر مختلف أو أجهزة كشف مختلفة ، مثل إقران المجهر البؤري بكاميرا فائقة السرعة50. في حين أن photobleaching والسمية الضوئية هي أسوأ نسبيا في المجاهر confocal بسبب حجم الإثارة الكبيرة ، والتصوير فائق السرعة قد تمكن التصور من الدماغ الشعيرات الدموية الخلايا الظهارية التفاعلات مع ارتفاع الدقة الزمنية ، والتي يمكن أن تزيد من إلقاء الضوء على آليات قيادة الموجات فوق الصوتية microbubble BBB العلاجات. في الختام ، يوفر البروتوكول الموصوف طريقة لمراقبة الآثار الوعائية والخلوية الناجمة عن تجارب BBB بالموجات فوق الصوتية الدقيقة في الوقت الفعلي ، مما يوفر أداة لزيادة تحديد الآليات التي تقود هذه العلاجات ، وكذلك إلقاء الضوء على استجابات المصب من parenchyma الدماغ لعلاجات الموجات فوق الصوتية microbubble.

Disclosures

وتعلن تشاريسا بون وميلينا مولينبفوردت وماريك أولسمان وكاثارينا دي لانج ديفيز عدم وجود تضارب مالي أو غير مالي في المصالح. سبيروس كوتوبوليس هو موظف بدوام كامل ويملك أسهما في EXACT Therapeutics AS ، وهي شركة تطور الموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة / الكتلة المعززة تسليم الأدوية. كولرفو هاينينن هو مؤسس FUS Instruments ، الذي يتلقى منه دعما غير متعلق بالأبحاث.

Acknowledgements

تم توفير سكن الحيوانات من قبل مرفق الطب المقارن الأساسي (CoMed، NTNU). تم إنشاء الشكل 3 في BioRender.com. تم تسجيل الفيديو وتحريره من قبل بير هينينغ، مشرف الموقع في كلية العلوم الطبيعية في NTNU. تم تمويل المشروع من قبل الجامعة النرويجية للعلوم والتكنولوجيا (NTNU، تروندهايم، النرويج)، ومجلس البحوث النرويجي (RCN 262228)، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (FDN 154272)، والمعهد الوطني للصحة (R01 EB003268)، وكرسي تمرزتي في أبحاث الموجات فوق الصوتية المركزة في مركز سانيبروك للعلوم الصحية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ring transducer placement
Agarose (powder)Sigma-AldrichA9539
Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml)VWR213-0462 or 214-1130
Cyanoacrylate glue (gel)Loctite1363589
Glass coverslips (13 mm)Thermo Fisher ScientificCB00130RA120MNT0Coverslip for ring transducer.
Hot plate or microwaveCorningPC-400DTo heat agarose solution.
PBS (1X)Sigma-AldrichP4417
Ring transducerCustom-madeCustom-madeCustom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518
Rubber stopperVWR217-0867
Animal preparation and drugs
Bupivacaine*AAspen169912Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site.
Buprenorphine*AIndivior521634Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery.
Buprenorphine*AIndivior521634Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c..
Carprofen*CPfizerDIN 02255693Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery.
Depilatory creamVeetN/AFor complete fur removal after trimming.
Dexamethasone*CSandozDIN 00664227, 2301Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery.
Enrofloxacin*CBayerDIN: 02249243Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery.
Fur clippersAesculap90200714Exacta/Isis.
Heating padPhysitemp Instruments INCHP-1M
IsofluraneBaxterESDG9623CDose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic.
Meloxicam*ABoehringer Ingelheim Vetmedica GmbH25388Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery.
Meloxicam*ABoehringer Ingelheim Vetmedica GmbH25388Dose rat: 1 mg/kg, s.c.
Pulse oximeterSTARR Life Sciences CorpN/AMouseOx.
Stereotaxic frameKopfKopf 900
Sterile ophthalmic ointmentThéa597562Viscotears.
Tail vein catheter (24 G)BD Neoflon391350
* Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified.
Material and equipment for cranial window placement
Alcohol swabsBD326895
Curved fine surgical scissorsFine Science Tools14002-12
Cotton or fibreless swabsChemtronicsCX50
Cyanoacrylate glue (gel)Loctite1594457 (gel), 230992 (liquid)If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder.
Dental cementLang DentalJet Set-4 Denture Repair Package
Dental micromotor hand drillFOREDOMK.1070-2High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet.
ForcepsFine Science Tools11152-10, 11370-40
Glass coverslipsThermo Fisher ScientificCB00050RA120MNT0 (5 mm)Mouse cranial windows.
Glass coverslipsThermo Fisher ScientificCB00080RA120MNT0 (8 mm)Rat cranial windows.
Micro drill burrs (0.5 mm)MeisingerHM71005 (0.5 mm)
Micro drill burrs (0.7 mm)MeisingerHM71007 (0.7 mm)
Stereo microscopeNikonSMZ645
Surgical gelatin spongeEthiconMS0005
Vetbond Tissue adhesive3M1469SB
Weigh boats / traysVWR10803-148
* Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries.
Multiphoton microscopy
20x water immersion objectiveOlympusXLUMPLFLN20 XWNumerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm.
Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa)Sigma Aldrich46945Recommended 10 kDa-2 MDa.
MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillatorSpectra-PhysicsN/A
SliceScope microscopeScientificaN/A
Ultrasound treatment
50 dB RF AmplifierE&I2100L
Matching circuitCustom-madeCustom-madeCustom-made.
MicrobubblesBracco ImagingN/ASonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg.
MicrobubblesLantheusN/ADefinity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg.
Signal generatorAgilent Technologies33500B

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Kalladka, D., et al. Human neural stem cells in patients with chronic ischaemic stroke (PISCES): a phase 1, first-in-man study. Lancet. 388 (10046), London, England. 787-796 (2016).
  3. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: Bottleneck in brain drug development. the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 12(2005).
  4. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2012).
  5. Nagy, Z., Pappius, H. M., Mathieson, G., Hüttner, I. Opening of tight junctions in cerebral endothelium. I. Effect of hyperosmolar mannitol infused through the internal carotid artery. The Journal of Comparative Neurology. 185 (3), 569-578 (1979).
  6. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  7. Burgess, A., et al. Alzheimer disease in a mouse model: MR imaging-guided focused ultrasound targeted to the hippocampus opens the blood-brain barrier and improves pathologic abnormalities and behavior. Radiology. 273 (3), 736-745 (2014).
  8. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373(2019).
  9. Hynynen, K., Jones, R. M. Image-guided ultrasound phased arrays are a disruptive technology for non-invasive therapy. Physics in Medicine and Biology. 61 (17), 206-248 (2016).
  10. Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877(2011).
  11. McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
  12. Downs, M. E., et al. Long-term safety of repeated blood-brain barrier opening via focused ultrasound with microbubbles in non-human primates performing a cognitive task. PLOS One. 10 (5), 0125911(2015).
  13. Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102(2018).
  14. Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103-112 (2019).
  15. Bing, C., et al. Transcranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using a stereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2, 13(2014).
  16. O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Blood-brain barrier: Real-time feedback-controlled focused ultrasound disruption by using an acoustic emissions-based controller. Radiology. 263 (1), 96-106 (2012).
  17. Jones, R. M., Deng, L., Leung, K., McMahon, D., O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Three-dimensional transcranial microbubble imaging for guiding volumetric ultrasound-mediated blood-brain barrier opening. Theranostics. 8 (11), 2909-2926 (2018).
  18. Jones, R. M., McMahon, D., Hynynen, K. Ultrafast three-dimensional microbubble imaging in vivo predicts tissue damage volume distributions during nonthermal brain ablation. Theranostics. 10 (16), 7211-7230 (2020).
  19. Arvanitis, C. D., et al. Mechanisms of enhanced drug delivery in brain metastases with focused ultrasound-induced blood-tumor barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (37), 8717-8726 (2018).
  20. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, (2012).
  21. McCarter, J. F., et al. Clustering of plaques contributes to plaque growth in a mouse model of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 126 (2), 179-188 (2013).
  22. Cruz Hernández, J. C., et al. Neutrophil adhesion in brain capillaries reduces cortical blood flow and impairs memory function in Alzheimer's disease mouse models. Nature Neuroscience. 22 (3), 413-420 (2019).
  23. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  24. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  25. Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (71), e50148(2013).
  26. Nhan, T., Burgess, A., Hynynen, K. Transducer design and characterization for dorsal-based ultrasound exposure and two-photon imaging of in vivo blood-brain barrier disruption in a rat model. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 60 (7), 1376-1385 (2013).
  27. Cho, E. E., Drazic, J., Ganguly, M., Stefanovic, B., Hynynen, K. Two-photon fluorescence microscopy study of cerebrovascular dynamics in ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (9), 1852-1862 (2011).
  28. Burgess, A., Nhan, T., Moffatt, C., Klibanov, A. L., Hynynen, K. Analysis of focused ultrasound-induced blood-brain barrier permeability in a mouse model of Alzheimer's disease using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 192, 243-248 (2014).
  29. Nhan, T., et al. Drug delivery to the brain by focused ultrasound induced blood-brain barrier disruption: Quantitative evaluation of enhanced permeability of cerebral vasculature using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 172 (1), 274-280 (2013).
  30. Nhan, T., Burgess, A., Lilge, L., Hynynen, K. Modeling localized delivery of Doxorubicin to the brain following focused ultrasound enhanced blood-brain barrier permeability. Physics in Medicine and Biology. 59 (20), 5987-6004 (2014).
  31. Poon, C. T., et al. Time course of focused ultrasound effects on β-amyloid plaque pathology in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 8 (1), 14061(2018).
  32. Poon, C., Pellow, C., Hynynen, K. Neutrophil recruitment and leukocyte response following focused ultrasound and microbubble mediated blood-brain barrier treatments. Theranostics. 11 (4), 1655-1671 (2021).
  33. Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
  34. Chu, P. -C., et al. Neuromodulation accompanying focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 5 (1), 15477(2015).
  35. Yddal, T., Kotopoulis, S., Gilja, O. H., Cochran, S., Postema, M. Transparent glass-windowed ultrasound transducers. , at http://eprints.gla.ac.uk/158176/ 2079-2082 (2014).
  36. Santos, M. A., Goertz, D. E., Hynynen, K. Focused ultrasound hyperthermia mediated drug delivery using thermosensitive liposomes and visualized with in vivo two-photon microscopy. Theranostics. 7 (10), 2718-2731 (2017).
  37. Mullin, L., et al. Effect of anesthesia carrier gas on in vivo circulation times of ultrasound microbubble contrast agents in rats. Contrast Media & Molecular Imaging. 6 (3), 126-131 (2011).
  38. Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Molecular Imaging and Biology. 14 (1), 40-46 (2012).
  39. Baum, J. A. The carrier gas in anaesthesia: Nitrous oxide/oxygen, medical air/oxygen and pure oxygen. Current Opinion in Anaesthesiology. 17 (6), 513-516 (2004).
  40. Poon, C., McMahon, D., Hynynen, K. Noninvasive and targeted delivery of therapeutics to the brain using focused ultrasound. Neuropharmacology. , 20-37 (2017).
  41. Joo, I. L., et al. Early neurovascular dysfunction in a transgenic rat model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 7, 46427(2017).
  42. Dorr, A., et al. Amyloid-β-dependent compromise of microvascular structure and function in a model of Alzheimer's disease. Brain: A Journal of Neurology. 135, Pt 10 3039-3050 (2012).
  43. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: An optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLOS One. 7 (6), 38590(2012).
  44. Teikari, P., Santos, M., Poon, C., Hynynen, K. Deep learning convolutional networks for multiphoton microscopy vasculature segmentation. arXiv. , at http://arxiv.org/abs/1606.02382 (2016).
  45. Denes, A., et al. Surgical manipulation compromises leukocyte mobilization responses and inflammation after experimental cerebral ischemia in mice. Frontiers in Neuroscience. 7, 00271(2014).
  46. Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9 (1), 5499(2019).
  47. Podgorski, K., Ranganathan, G. Brain heating induced by near-infrared lasers during multiphoton microscopy. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1012-1023 (2016).
  48. Ulivi, A. F., et al. Longitudinal two-photon imaging of dorsal hippocampal CA1 in live mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59598(2019).
  49. Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
  50. Beekers, I., et al. Combined confocal microscope and Brandaris 128 ultra-high-speed camera. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (9), 2575-2582 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved