في المختبر 3D نماذج الشرايين الخلية المستزرعة لدراسة استهداف المخدرات الأوعية الدموية تحت التدفق

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا جديدا لدراسة وخريطة الترسب المستهدف لناقلي المخدرات للخلايا البطانية في نماذج الشرايين البشرية المصنعة والحقيقية الحجم وثلاثية الأبعاد تحت التدفق الفسيولوجي. وقد تكون الطريقة المعروضة بمثابة منصة جديدة لاستهداف حاملي المخدرات داخل نظام الأوعية الدموية.

Abstract

إن استخدام نماذج ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للشرايين البشرية ، والتي تم تصميمها بالأبعاد الصحيحة والتشريح ، يمكن من النمذجة المناسبة لمختلف العمليات الهامة في نظام القلب والأوعية الدموية. في الآونة الأخيرة ، على الرغم من إجراء العديد من الدراسات البيولوجية باستخدام مثل هذه النماذج ثلاثية الأبعاد من الشرايين البشرية ، إلا أنها لم تطبق لدراسة استهداف الأوعية الدموية. تقدم هذه الورقة طريقة جديدة لتصنيع نماذج شريانية بشرية حقيقية الحجم أعيد بناؤها باستخدام تقنية طباعة ثلاثية الأبعاد ، وخطها مع الخلايا البطانية البشرية (ECs) ، ودراسة استهداف الجسيمات تحت التدفق الفسيولوجي. هذه النماذج لديها ميزة تكرار الحجم الفسيولوجي وظروف الأوعية الدموية في جسم الإنسان باستخدام مكونات منخفضة التكلفة. قد تكون هذه التقنية بمثابة منصة جديدة لدراسة وفهم استهداف الأدوية في نظام القلب والأوعية الدموية وقد تحسن تصميم الأدوية النانوية الجديدة القابلة للحقن. وعلاوة على ذلك، قد يوفر النهج المقدم أدوات هامة لدراسة الولادة المستهدفة لمختلف العوامل لأمراض القلب والأوعية الدموية في ظل التدفق الخاص بالمرضى والظروف الفسيولوجية.

Introduction

وقد تم مؤخرا تطبيق عدة نهج باستخدام نماذج 3D من الشرايين البشرية^{1،2،3،4،5}. هذه النماذج تكرار التشريح الفسيولوجي والبيئة من الشرايين المختلفة في جسم الإنسان في المختبر. ومع ذلك ، فقد استخدمت أساسا في دراسات بيولوجيا الخلية. وتشمل الدراسات الحالية على استهداف الأوعية الدموية من الجسيمات إلى بطانة الرحم في المحاكاة الحسابية سيليكو ^6،7،8، في المختبر نماذج microfluidic^9،10،11، وفي نماذج حيوانية فيفو ¹². وعلى الرغم من الرؤى التي قدمتها، فشلت هذه النماذج التجريبية في محاكاة عملية الاستهداف التي تحدث في الشرايين البشرية بدقة، حيث يشكل تدفق الدم والديناميكا الدموية عوامل مهيمنة. على سبيل المثال ، دراسة استهداف الجسيمات إلى المناطق تصلب الشرايين في تشعب الشريان السباتي ، والتي تشتهر بنمط تدفق إعادة الدوران المعقد وتدرج إجهاد القص الجداري ، قد تؤثر على الرحلة التي تقوم بها الجسيمات قبل وصولها إلى بطانة الرحم^13و14و^15و16. لذلك، يجب إجراء هذه الدراسات في ظل ظروف تكرر البيئة الفسيولوجية، أيالحجم والبعد والتشريح وملف التدفق.

في الآونة الأخيرة ، قام هذا الفريق البحثي بتصنيع نماذج شريانية بشرية ثلاثية الأبعاد لدراسة ترسب واستهداف الجسيمات إلى الأوعية^{الدموية 17.} واستندت النماذج على نسخ هندسية ثلاثية الأبعاد من الأوعية الدموية البشرية، والتي كانت بعد ذلك مثقفة مع ECs الإنسان التي اصطف في وقت لاحق جدرانها الداخلية. بالإضافة إلى ذلك ، عندما تتعرض لنظام التشوه الذي ينتج التدفق الفسيولوجي ، فإن النماذج تكرر بدقة الظروف الفسيولوجية. تم تصميم نظام التشويش لتشويش السوائل بمعدل تدفق ثابت ، وذلك باستخدام مضخة معمومة في كل من تكوينات الدائرة المغلقة والمفتوحة(الشكل 1). يمكن استخدام النظام كدائرة مغلقة لرسم خريطة لترسب الجسيمات واستهداف الخلايا المصنفة داخل النموذج السباتي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامه كدائرة مفتوحة لغسل الجسيمات غير الملتصقة في نهاية التجارب وتنظيف النظام وصيانته. تقدم هذه الورقة بروتوكولات لتصنيع نماذج ثلاثية الأبعاد للتشعب السباتي البشري ، وتصميم نظام التشويش ، ورسم خرائط لترسب الجسيمات المستهدفة داخل النماذج.

Protocol

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تصنيع نموذج ثلاثي الأبعاد للشريان السباتي ويمكن تطبيقه لتوليد أي شريان آخر مهم بمجرد تعديل المعلمات الهندسية.

1. تصميم وتصنيع تشعب ثلاثي الأبعاد لنموذج الشريان السباتي البشري

1. اختر صورا من المرضى أو هندسات مدروسة سابقا لتشعب الشريان السباتي البشري ، وإنشاء نموذج تصميم بمساعدة الكمبيوتر للقالب يحتاج إلى طباعة.
   ملاحظة: يحتوي تشعب الشريان السباتي على مدخل واحد ومنفذين. من المهم تصميم إطار قالب ثلاثي الأبعاد حول الشريان ويدعم الطباعة المؤقتة بين الإطار وقالب الشريان (الشكل 2A- C).
2. طباعة الأشكال الهندسية باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. قطع يدعم الطباعة المؤقتة، واستخدام الصنفرة لتلميع وسلس القوالب، وخاصة في المناطق التي قطعت يدعم. شطف نموذج الرملي مع الكحول isopropyl لإزالة الغبار البلاستيك، والسماح لتجف تماما في غطاء محرك السيارة الكيميائية لمدة 2-3 ساعة.
   ملاحظة: هنا، قوالب المطبوعة مصنوعة من الراتنج v4 واضحة (الشكل 2D،ه).
3. لحل البلاستيك بسهولة، رش القوالب مع ورنيش شفاف داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية، والسماح للهواء الجاف لمدة 1 ساعة. كرر هذا 3x.
   ملاحظة: هنا، تم استخدام 2X الترا الغطاء رذاذ واضح، ولكن أي نوع آخر ينبغي أن تكون مناسبة طالما أنها ليست ورنيش الخشب. تأكد من عدم وجود البلاستيك المكشوفة اليسار لأن البلاستيك قد تتفاعل مع السيليكون ومنعها من ترسيخ بشكل صحيح. نوعية السطح رش ستحدد نوعية سطح نموذج السيليكون النهائي.
4. قطع الشرائح مستطيلة شفافة / شرائط من البلاستيك السلس من نفس أبعاد الإطار العفن، والغراء لهم باستخدام ورنيش إلى الإطار على جميع الجوانب ومن جانب واحد من الإطار، بحيث سيتم مختومة في الجزء السفلي وفتح في الجزء العلوي. تطبيق ورنيش باستخدام فرشاة الطلاء داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية، والسماح للشرائح لتجف تماما لمدة 24 ساعة على الأقل(الشكل 2F).
5. لإعداد خليط المطاط السيليكون، إضافة السيليكون السائل مع عامل المعالجة (نسبة الكتلة 1:10) في لوحة بلاستيكية، ويحرك جيدا لضمان الاختلاط الكامل. للنموذج السباتي، أضف 54 غرام من السيليكون و 6 غرام من وكيل المعالجة.
6. يبرد الخليط لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، ثم يزيل الغاز في مجفف فراغ حتى يتم القضاء على جميع فقاعات الهواء. ضع القالب في المجفف (مع الجانب المفتوح الذي يواجه الأعلى) ، صب ببطء خليط السيليكون في القالب ، ومرة أخرى إزالة فقاعات الهواء حتى يصبح الخليط واضحا.
7. دع القالب يقف مع السيليكون بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (إذا كان ذلك ممكنا، اتركه في المجفف دون فراغ). إذا لم يجف الخليط بالكامل، احتضنه عند 60 درجة مئوية لبضع ساعات أخرى.
8. بمجرد أن يجف الخليط بالكامل ، قم بإزالة الشرائح الشفافة ، وغمر النموذج في الأسيتون المطلق لمدة 48 ساعة في غطاء محرك السيارة الكيميائي حتى يذوب البلاستيك بالكامل. إزالة أي بقايا بلاستيكية بعصا خشبية. لتتبخر الأسيتون المحاصرين داخل النموذج، واحتضانه في 60 درجة مئوية لمدة 4 أيام على الأقل قبل بذر الخلية.

2. خلية الثقافة وبذر في نماذج

1. إعداد ثلاثة موصلات لنموذج السباتي: واحد للمدخل واثنين للمنافذ (انظر جدول المواد). تعقيم النموذج والموصلات عن طريق الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة البيولوجي لمدة 20 دقيقة.
2. معطف النماذج مع 4 مل من 100 ميكروغرام / مل فيبروكتين (في 1x الفوسفات العازلة المالحة، (PBS)) لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. حقن محلول فيبروكتين في النموذج من خلال مدخل باستخدام حقنة بلاستيكية 5 أو 10 مل. إزالة فيبروكتين من خلال منفذ, وغسل النموذج مع المتوسطة EC.
3. تعليق 2.5 × 10⁶ خلايا / مل الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs، مرور < 6)، وملء النموذج مع 4 مل من تعليق الخلية باستخدام حقنة بلاستيكية 5 أو 10 مل(الشكل 3A). ضع النموذج على دوار داخل حاضنة (37 درجة مئوية) بسرعة دورة واحدة في الدقيقة لمدة 48 ساعة لضمان البذر المتجانس. تأكد من أن النموذج موصول بشكل جيد بالمدور(الشكل 3B). تغيير المتوسط بعد 24 ساعة داخل غطاء محرك السيارة البيولوجية، والعودة إلى الدوار داخل الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى.
   ملاحظة: بعد 24 ساعة، يتم بذر الخلايا ويمكن تصويرها باستخدام المجهر.
4. إزالة النموذج من الدوار، ويغسل مع برنامج تلفزيوني 1x باستخدام حقنة بلاستيكية 10 مل. لإصلاح الخلايا، واحتضان الخلايا مع 4 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) إلى النموذج لمدة 15 دقيقة داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية، ومن ثم شطف 3x مع برنامج تلفزيوني. إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى التجربة (الشكل 3C). وصمة عار الخلايا داخل النموذج باستخدام بروتوكولات تلطيخ القياسية(على سبيل المثال، تلطيخ النووية مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), الشكل 3D).

3. تصميم نظام التشويش

1. نظام التشوه له مدخلين وأنابيب منفذين. دمج مدخلين في أنبوب معرف واحد 4 ملم ومرة أخرى في اثنين من أنابيب معرف 6 ملم، والتي تتصل مضخة العجان. دمج اثنين من أنابيب معرف 6 ملم الخروج من مضخة التجبير في أنبوب واحد 4 ملم، وربطه إلى المثبط التذبذب للقضاء على أي تذبذبات من المضخة. استخدم زجاجة ضيقة الفم سعة 250 مل مع غطاء ثلاثي الفتحات كمخمد.
2. ربط فتحة واحدة إلى مدخل من المضخة، وإغلاق الثانية مع الفلين الذي يستخدم للتنفيس عن الضغط في حالات الطوارئ، وتوسيع فتحة الثالث (وهو منفذ) إلى الجزء السفلي من الزجاجة.
3. ربط المثبط إلى مدخل نموذج السباتي المثقف باستخدام أنابيب منفذ. دمج منفذين من النموذج إلى أنابيب واحدة، والتي ستكون منفذ للنظام (جميع الأنابيب هي معرف 4 ملم).
4. تقسيم أنابيب منفذ لاثنين من أنابيب منفذ (واحد للدائرة مغلقة والآخر للحاوية النفايات في الدائرة المفتوحة). إرفاق المشبك البلاستيك إلى كل أنبوب.
   ملاحظة: سوف يحدد تركيبة المشابك المفتوحة/المغلقة ما إذا كان النظام في تكوين دارة مغلق أو مفتوح. كما هو مبين في الشكل 1، إذا المشابك أ و د هي قريبة في حين ب وجيم مفتوحة ، والنظام هو دائرة مغلقة ؛ العكس يجلب النظام لفتح تكوين الدائرة.
5. إعداد ثلاث حاويات: واحدة يمكن أن تعقد 300 مل السائل (للدائرة المغلقة) واثنين آخرين من 1 لتر لكل منهما: واحدة لغسل والآخر للنفايات (للحلبة المفتوحة).

4. تكوين الدائرة المغلقة: تجربة التشويش والتصوير

1. إضافة 300 مل من برنامج تلفزيوني إلى حاوية الدائرة المغلقة، وهو ما يكفي لملء النظام بأكمله، بما في ذلك الأنابيب والنموذج. ضع أنبوب مدخل واحد وأنبوب منفذ واحد (المشابك المفتوحة ب و ج) داخل الحاوية.
2. املأ حاوية الغسيل 1 لتر بالماء المقطر (للغسيل في نهاية التجربة)، واترك حاوية النفايات الأخرى 1 لتر فارغة. ضع مدخل ومنفذ الأنابيب الأخرى (المشابك القريبة أ و د) في حاويات الغسيل والنفايات، على التوالي.
3. خذ نموذج السباتية المثقفة للخلية الثابتة من 4 درجات مئوية، وافراغ برنامج تلفزيوني. قم بتوصيل مدخل ومنافذ السباتي كما هو موضح في الخطوات 3.3-3.4. لا تترك النموذج الجاف لفترة طويلة. بمجرد توصيل النموذج، قم بتنشيط المضخة لتشويش السائل.
4. ضع النموذج السباتي تحت المجهر. فتح الأنابيب قبل مدخل وبعد منفذ النموذج السباتي. ضبط مضخة التجبير في 10 دورة في الدقيقة، وتحويله. زيادة السرعة بزيادات 5 دورة في الدقيقة، كل 4-5 دقائق. تأكد من عدم وجود تسرب.
5. عند 100 دورة في الدقيقة، وهو ما يعادل معدل التدفق الأقصى للموجة الفسيولوجية للشريان السباتي البشري (~ 400 مل/دقيقة)، أضف جزيئات البوليسترين الفلورية (PS) (2 ميكرومتر، بتركيز 1.6 ميكروغرام/مل) إلى 300 مل من برنامج تلفزيوني في حاوية الدائرة المغلقة. صورة المنطقة ذات الاهتمام كل 10 ق لمدة 1.5 ساعة (لا تزال واحدة الصور أو الفيديو حسب الحاجة).

5. تكوين الدائرة المفتوحة: خطوة الغسيل

1. افتح المشابك من أنابيب الغسيل والنفايات في حاويات 1 L (المشابك أ و د)، وإغلاق المشابك فورا من كل من مدخل ومنفذ أنابيب في حاوية 300 مل (المشابك ب ج) لتغيير النظام من مغلقة لفتح تكوين الدائرة.
2. السماح لمعظم تدفق المياه من وعاء الغسيل إلى حاوية النفايات في 100 دورة في الدقيقة. قبل أن يتم نقلها تماما، اضغط على التوقف عن مضخة العجق، وإغلاق المشابك أنبوب قبل مدخل وبعد منفذ النموذج السباتي.
3. باستخدام المرشحات المناسبة، التقط صورا للنموذج في المنطقة ذات الأهمية لإظهار ترسب الجسيمات والتصاقها بالخلايا. قطع الاتصال نموذج السباتي. بعناية وببطء إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني مع حقنة 10 مل من خلال مدخل النموذج.
4. ربط "نموذج وهمية"، (وهو أيضا نموذج السباتي المطاط السيليكون 3D تستخدم فقط لغسل، دون خلايا مثقفة) بدلا من نموذج السباتي، وشطف النظام. إضافة 1 لتر آخر من الماء، وغسل النظام مرة أخرى حتى يتم نقل جميع المياه من وعاء الغسيل إلى النفايات. إيقاف تشغيل مضخة التجبير.

6. الحصول على البيانات وتحليلها

1. الحصول على فيلم رقمي لترسب الجسيمات في المنطقة ذات الاهتمام مع الصور التي التقطت أثناء التجربة ، وذلك باستخدام رمز برنامج مخصص (انظر جدول المواد).
2. لرسم خرائط لترسب الجسيمات على طول النموذج، بلاط صور متعددة لتغطية المنطقة التي تم فحصها من الفائدة (الشكل 4A،B).
   ملاحظة: يمكن كتابة رمز برنامج مخصص لتحديد عدد الجسيمات التي تم الالتزام بها في موقع الاهتمام (تم توفير ملف عينة كمعلومات تكميلية)¹⁷.

النتائج

تقدم هذه الورقة بروتوكولا جديدا لرسم خريطة لترسب الجسيمات داخل نماذج الشرايين البشرية ثلاثية الأبعاد ذات الحجم الحقيقي ، والتي قد توفر منصة جديدة لأبحاث توصيل الأدوية. باستخدام تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد ، تم تصنيع نموذج من الشريان التشعب السباتي البشري(الشكل 2). وقدم ا...

Discussion

النهج الحالية لدراسة استهداف الأوعية الدموية من الجسيمات تقصر في تكرار الظروف الفسيولوجية الموجودة في جسم الإنسان. يقدم هنا بروتوكول لتصنيع نماذج أعيد بناؤها ثلاثية الأبعاد من الشرايين البشرية لدراسة استهداف الجسيمات إلى المركبات المائية بطانة الشريان تحت التدفق الفسيولوجي تطبيقها با...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID