خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

Summary

نسبة الإشارة إلى الضوضاء من البيانات هي واحدة من أهم الاعتبارات في إجراء قياسات الحيود الأشعة السينية من البلورات الدقيقة. يوفر خط الحزم VMXm بيئة منخفضة الضوضاء والميكروبات لمثل هذه التجارب. هنا، ونحن نصف أساليب إعداد عينة لتركيب وتبريد البلورات الدقيقة لVMXm وغيرها من الخطوط شعاعية البلورات الجزيئية الدقيقة.

Abstract

تركيب البلورات الدقيقة (<10 ميكرومتر) لبلورة واحدة بلورية بلورية يمثل تحديا غير تافهة. وقد شوهدت تحسينات في جودة البيانات للبلورات الدقيقة مع تطوير البصريات الحزمة، والاستقرار شعاع وحجم شعاع متغير مع التركيز من submicron إلى ميكرون، كما هو الحال في خط الحزم VMXm في مصدر ضوء الماس¹. وسيكتسب المزيد من التحسينات في نوعية البيانات من خلال إدخال تحسينات على بيئة العينة وإعداد العينات. تولد البلورات الدقيقة بطبيعتها حيود أضعف ، وبالتالي فإن تحسين الإشارة إلى الضوضاء هو المفتاح لجمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الجودة وسيأتي في الغالب من انخفاض في ضوضاء الخلفية. المصادر الرئيسية للضوضاء الخلفية بالأشعة السينية في تجربة الحيود هي من تفاعلها مع مسار الهواء قبل وبعد العينة ، محلول التبلور الزائد المحيط بالعينة ، وجود الجليد البلوري والتشتت من أي أجهزة شعاعية أخرى أو نوافذ الأشعة السينية. يتضمن خط الحزم VMXm أجهزة وبروتوكول إعداد عينة لتقليل جميع مصادر الضوضاء هذه.

أولا، تزيل بيئة عينة في الفراغ في VMXm مسار الهواء بين مصدر الأشعة السينية والعينة. بعد ذلك ، تستخدم بروتوكولات إعداد العينة للبلورات الجزيئية الكلية في VMXm عددا من العمليات والأدوات المكيفة من cryoTEM. وتشمل هذه الشبكات النحاسية مع أفلام دعم الكربون هولي، النشاف الآلي والروبوتات التبريد يغرق الاستفادة من الإيثان السائل. تمكن هذه الأدوات من إعداد مئات البلورات الدقيقة على شبكة cryoTEM واحدة مع الحد الأدنى من السائل المحيط على دعم منخفض الضوضاء. كما أنها تقلل من تكوين الجليد البلوري من أي سائل متبقي يحيط بالبلورات.
نقدم عملية إعداد وتقييم جودة البلورات الدقيقة للبروتين القابلة للذوبان باستخدام الضوء المرئي ومسح المجهر الإلكتروني قبل تركيب العينات على خط الحزم VMXm لتجارب حيود الأشعة السينية. كما سنقدم أمثلة على عينات ذات نوعية جيدة وكذلك تلك التي تتطلب المزيد من التحسين والاستراتيجيات للقيام بذلك.

Introduction

يبقى الحاجز الرئيسي لتحديد الهياكل عالية الدقة للجزيئات البيولوجية بواسطة علم البلورات الجزيئية الكلية (MX) هو إنتاج بلورات منتشرة بشكل جيد بحجم قابل. هناك العديد من الاستراتيجيات لتحقيق هذا الهدف من بناء الجينات البروتين المؤتلف تصميم من خلال البحث مصفوفة متناثرة كبيرة عن الكوكتيلات الكيميائية التي قد تولد بلورات^{الأولية 2}. بالنسبة لهذا الأخير ، غالبا ما يكون الحال أن البلور سوف تحتاج إلى تحسين أي يضرب الأولية للحصول على بلورات مع جودة الحيود كافية وحجم لدراسات تحديد الهيكل³. على الرغم من هذه الخيارات، قد لا تولد بعض الجزيئات المستهدفة أبدا بلورات كبيرة (>10 ميكرومتر)، وبلورات منتشرة جيدا، ونتيجة لذلك يجب على عالم البلورات المثابرة مع البلورات الدقيقة والتحديات التي تمثلها هذه العينات. وتشمل هذه التركيب المناسب وحماية البلورات، وإدارة الحيود الأضعف بطبيعته وزيادة حساسية الإشعاع. تتشكل البلورات الدقيقة من خلايا وجزيئات أقل من البلورات الكبيرة ، وعلى هذا النحو ، لا يتم تضخيم الحيود بنفس القدر مقارنة بالبلورات الأكبر ، مما يؤدي إلى كثافة حيود أضعف بطبيعتها. من المهم أن إشارة الخلفية لا يخفي هذه الانعكاسات، لا سيما في دقة أعلى حيث يمكن أن تضيع كثافة انعكاس ضعيفة⁴. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البلورات الدقيقة أكثر حساسية للتلف الإشعاعي وعلى الرغم من تسجيل الحيود في درجات حرارة النيتروجين السائل⁵، فقد لا يكون من الممكن جمع بيانات كاملة من بلورة واحدة ، مما يجعل من الضروري جمع البيانات من عدد كبير جدا من البلورات لإنتاج مجموعة بيانات كاملة واحدة⁶.

وقد وفرت زيادة توافر أشعة الليزر الإلكترونية الحرة بالأشعة السينية (XFELs) وتطور أساليب البلورات التسلسلية (SFX)⁷ طرقا لجمع البيانات من البلورات الدقيقة الأصغر. ومع ذلك ، هذه هي طرق تسليم العينات حسب الطلب ، والتي تتطلب قدرا كبيرا من الخبرة في الأجهزة والبرامج ، حيث تقتصر التجارب على درجة حرارة الغرفة وعادة ما يكون استهلاك العينة مرتفعا (مئات الميكرويتر) ولا يزال قد يتطلب المزيد من التحسين⁸. على هذا النحو، المشاريع التي يمكن أن تكون فيها كمية محدودة فقط من البلورات الدقيقة غير مناسبة لSFX.

وفي الوقت نفسه، تقدمت تكنولوجيا خط الحزم السنكروترون على مدى العقود الأخيرة لإنتاج أصغر وأكثر استقرارا الحزم⁹ مع تألق التي سمحت لجمع البيانات من بلورات أصغر من أي وقت^{مضى 10،11}. وقد تمكنت خطوط الحزم Microfocus مثل FMX في NSLS-II و I24 في Diamond Light Source من تحديد هياكل جديدة من بلورات ذات أبعاد قصوى تبلغ ~ 3 ميكرومتر¹² وإظهار القدرة على جمع البيانات القابلة للاستخدام من بلورات أصغر قياس ~ 1 ميكرومتر¹³. يجب تكوين خط الحزم بدقة ، مع بصريات ممتازة وعالية الدقة على المحور ، ومجال أدنى من الارتباك لدوران العينة ومحور دوران متوائم بدقة يتزامن مع شعاع الأشعة السينية. من المهم أن تتطابق عن كثب مع ملف شعاع الأشعة السينية إلى حجم الكريستال وضمان محاذاة الكريستال بدقة في شعاع الأشعة السينية - وهو تحد للبلورات <5 ميكرومتر¹⁴. تلبية هذه الشروط التجريبية في خط الحزم ضروري لتسجيل أفضل البيانات جودة من البلورات الدقيقة.

الجانب المتبقي وربما الأكثر أهمية لجمع البيانات من البلورات الدقيقة هو عرض الكريستال على شعاع الأشعة السينية. وغالبا ما شنت Microcrystals على يتصاعد عينة ميكروميش، المصنعة من البوليميد، وانخفاض المواد التشتت الأشعة السينية مع فتحات صغيرة مثل 10 ميكرومتر^15،16. يتم تركيب شبكة البوليميد على دبوس قياسي يتم تعيينه في قاعدة العمود الفقري المغناطيسي ، مما يجعله متوافقا مع معظم خطوط شعاع MX¹⁷. يتم استخدام جبل شبكة لصيد بلورات من قطرة تبلور غالبا ما تتبع نفس الإجراء كما تصاعد الكريستال 100 ميكرومتر باستخدام جبل نمط حلقة القياسية. في حين أن بلورات يمكن توزيعها عبر شبكة، عيب رئيسي هو أن حجم كبير نسبيا من السائل يمكن أن يتم بواسطة شبكة ودبوس أثناء الحصاد(الشكل 1C،D). هذا الحجم من السائل، التي يمكن أن تكون أكبر عدة مرات من البلورات نفسها، وسوف تسهم في الضوضاء الخلفية عندما تضيء مع الأشعة السينية. يمكن أن يكون هذا التشتت الخلفية أقوى إذا شكل السائل الجليد البلوري أثناء التبريد فلاش، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء من كثافة ضعيفة بالفعل داخل قرارات الحيود الجليد. لذلك، من المهم إزالة السائل الزائد من العينة، لضمان إمكانية تسجيل جميع الإشارات الممكنة. هذا التحدي هو أكبر في حالة بلورات البروتين الغشاء تشكلت داخل مرحلة مكعب الدهون (LCP)، حيث يولد LCP مبعثر خلفية قوية وأيضا من الصعب إزالتها من جميع أنحاء بلورات ¹⁸.

يوفر خط الحزمة الجديد متعدد الجزيئات البلورية البلورية (VMXm) في Diamond Light Source الظروف التي يمكن من خلالها جمع البيانات من بلورات يحتمل أن يكون حجمها أقل من ميكرون. وقد تم تصميم خط الحزم لتقديم صورة شعاع قياس 0.3 ميكرومتر × 0.5 ميكرومتر (VxH)¹، وهو مقياس ال غونيمتر مع مجال من الارتباك لا يزيد عن 60 نانومتر وفي بيئة عينة vacuo. هذه الميزات تصميم محطة نهاية VMXm تقليل توليد الخلفية الأشعة السينية الضوضاء من قبل جهاز الحزمة أثناء جمع البيانات مع أكبر مصدر المتبقية من الخلفية التي تم إنشاؤها بواسطة العينة¹⁴.

وتتيح أساليب إعداد العينة المحددة المصممة لشعاع VMXm فرصة للحد من هذه الخلفية وزيادة تحسين الإشارة إلى الضوضاء لبيانات الحيود، مما يزيد من جودة البيانات التي يمكن تسجيلها من البلورات الدقيقة التي تبلغ قوتها <10 ميكرومتر. العديد من المتطلبات المبينة هنا للانعراج منخفض الخلفية من البلورات الدقيقة شائعة أيضا في المجهر الإلكتروني الإرسال المبرد (cryoTEM)¹⁹ والكفر الإلكتروني microcrystal (microED)²⁰. ونتيجة لذلك، فإن العديد من الأدوات التي تم تطويرها بالفعل لإعداد عينات cryoTEM مناسبة، مع بعض التعديلات، لإعداد البلورات الدقيقة. في إعداد عينات لكريوتيم الجسيمات واحد، يتم تضمين الجسيمات قيد التحقيق في طبقات رقيقة جدا (عادة <100 نانومتر) من الجليد الزجاجي بحيث الإلكترونات قادرة على نقل من خلال العينة. ويتحقق طبقة موحدة رقيقة عن طريق النشاف بعيدا السائل الزائد ويتحقق التزجيج من العينة عن طريق التبريد السريع للعينة (~ 104 K ق^-1)²¹ من خلال الغطس في الإيثان السائل الذي عقد في ~ 93 K²². في المقابل، النيتروجين السائل، كما تستخدم بشكل روتيني لإعداد عينة MX، هو cryogen أقل كفاءة من الإيثان ولديه ميل أكبر لتشكيل الجليد البلوري داخل العينة²¹. تشكيل الجليد البلوري ، الذي يمكن أن يتحلل الحيود وتوليد الضوضاء الخلفية ، وعادة ما يتم تخفيفها من خلال استخدام المركبات المبردة²³. يمكن إضافة البوليمرات منخفضة الوزن الجزيئي مثل بولي إيثيلين غليكول (PEG) 400 وميثيل-2,4-pentanediol (MPD) والسكريات والزيوت أو الأملاح المشبعة إلى محلول التبلور في تركيزات منخفضة²⁴- لا يوجد حل "مقاس واحد يناسب الجميع" لاختيار أكثر المبردات ملاءمة وهذا يتطلب في كثير من الأحيان التحسين²⁵ . الكريستال يخضع أيضا التلاعب متعددة خلال عملية الحصاد وحماية التبريد والتي قد تؤدي إلى تلف الكريستال، وفرصة للاستفادة من الإيثان السائل يسمح إغفال هذه الخطوة ويساعد على حماية سلامة الكريستال.

في حين أن الإيثان السائل هو cryogen فعالة للبلورات الدقيقة (<10 ميكرومتر) بسبب نحافة العينة، وهناك طرق بديلة لمنع تشكيل الجليد البلوري، لا سيما في بلورات أكبر، بما في ذلك الحد من محتوى المياه من الكريستال عن طريق استخدام بيئة رطبة تسيطر عليها بإحكام^26،أو من خلال فتل السائل الزائد بعيدا عن كل من حلقة وسطح الكريستال²⁷ ، ومع ذلك، تتطلب هذه مرة أخرى معالجة أكبر للعينة. استخدام النشاف الآلي ويغرق تجميد مع الإيثان السائل، كما هو الحال في cryoTEM، معا إزالة محلول التبلور الزائد وتوفير وسيلة لوميض البلورات الدقيقة بارد بطريقة تسيطر عليها في حين تحاول تقليل التلاعب.

هنا، نقدم بروتوكولا يمكن استخدامه ليس فقط من قبل كل من مستخدمي خط الحزم VMXm وفي خطوط الحزم microfocus الأخرى لجمع بيانات حيود عالية من إشارة إلى ضوضاء ولكن قد تكون مفيدة أيضا لأولئك الذين يعدون عينات بلورية البروتين القابلة للذوبان والمنظفات القائمة على بروتين الغشاء لإجراء تجارب microED. في حين أن جميع المرافق لإعداد وتقييم العينات متوفرة في VMXm ، فإن العديد من مختبرات البيولوجيا الهيكلية مجهزة بشكل متزايد لإعداد عينات cryoTEM. ونتيجة لذلك، نتصور أن بعض المستخدمين قد يرغبون في استخدام مرافقهم الخاصة لإعداد عيناتهم لوقت البث في VMXm.

Protocol

1. إعداد المعدات

ملاحظة: الأساليب الموصوفة هنا استخدام أداة تجميد يغرق مع ذراع النشاف واحد. وقد تم تجهيز بعض الأدوات مع اثنين من الأسلحة النشاف، ونحن ننصح المستخدم للتحقق من تعليمات الشركات المصنعة لضبط الصك حتى ذراع واحد فقط النشاف قيد الاستخدام.

1. تأكد من وضع المجهر الخفيف بالقرب من أداة التجميد الهبوط ، من الناحية المثالية بحيث يكون كل من المجهر والفريزر في متناول المستخدم.
2. إعداد وتبريد المجمد يغرق الآلي وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
   ملاحظة: يجب تعيين درجة حرارة غرفة العينة إلى درجة الحرارة التي نمت البلورات. لا تضع ورق النشاف في غرفة العينة.
   تنبيه: الإيثان السائل هو مادة متفجرة شديدة الاشتعال ويجب استخدامه فقط في منطقة جيدة التهوية بعيدا عن مصادر الشرارة المحتملة.
3. تسمية صناديق الشبكة بشكل مناسب وتبريدها في ديوار صغيرة باستخدام النيتروجين السائل.
4. وضع بعناية الشبكات، الجانب فيلم الكربون حتى، على الناقل المناسب لتوهج تفريغ (مثل شريحة المجهر الزجاجي ملفوفة في parafilm).
5. توهج التفريغ cryoTEM الشبكات لمدة 25 ق في 0.39 mBar، وذلك باستخدام تيار من 15 mA. توهج التفريغ قبل أن يتم استخدام الشبكات. الحفاظ على توهج الشبكات تفريغها في طبق بيتري مغطاة حتى تصبح جاهزة; إذا هفوات 30 دقيقة بعد توهج التفريغ، كرر توهج تفريغ.
   ملاحظة: مع استعداد الفريزر المغرق وإعداد الشبكات، يمكن أن يتحول الانتباه إلى العينة.

2. تحديد المعلمات النشاف الأولي

1. تعيين الرطوبة النسبية للغرفة عينة إلى 90٪ ووقت النشاف إلى 5 ق وضمان أن يتم تعيين الفريزر يغرق تلقائيا العينة بعد النشاف كاملة.
   ملاحظة: هذه المعلمات البداية هي الأكثر ملاءمة للثلاجة لايكا GP يغرق, معلمات أخرى مثل قوة النشاف متوفرة على VITROBOT FEI. ومع ذلك، في تجربتنا سلامة الكريستال هو أكثر عرضة للحفاظ عليها باستخدام ذراع النشاف واحد.
2. لتكون قادرة على ختم علبة تبلور بمجرد فتح بئر من الفائدة، وقطع شريط صغير من الشريط وأضعاف على نهاية واحدة لإنشاء علامة تبويب لتسهيل فتح الختم ومكان بعناية إلى جانب واحد.
3. قطع فتح الختم على البئر تبلور، بما في ذلك الخزان. العمل بسرعة، وتطبيق 2-5 ميكرولتر من محلول الخزان إلى الكريستال التي تحتوي على قطرة للحفاظ على حجم السائل في الانخفاض.
4. استخدام علامة التبويب من الشريط ثم إعادة ختم البئر والتأكد من أن قطرة تبلور لا تجف.
5. في حين عقد للحظات فتح الشريط على البئر تبلور، نقل 10 ميكرولتر من محلول الخزان إلى أنبوب 0.5 مل لاستخدامها في الخطوات اللاحقة.
6. إعادة إغلاق البئر.
7. ضع قطعة من ورق النشاف قبل القطع على ذراع النشاف من أداة تجميد الغطس.
8. وضع توهج واحد تفريغ الشبكة في ملقط تجميد يغرق وتحميل في الصك بحيث يواجه الجانب الكربون بعيدا عن الذراع النشاف.
9. تأكد من أن الرطوبة النسبية داخل غرفة النشاف هي في 90٪.
10. تدوير ملقط حتى الجانب الكربون فيلم يواجه الذراع النشاف.
11. باستخدام ماصة 2.5 ميكرولتر، استخدم 2 ميكرولتر من محلول الخزان من أنبوب 0.5 مل إلى الجانب غير الداعم (النحاس اللامع) من شبكة cryoTEM.
12. تدوير الشبكة بحيث يواجه الجانب دعم الكربون بعيدا عن الذراع النشاف وتكرار العملية، وتطبيق السائل بعناية إلى الجانب دعم فيلم الكربون من الشبكة. تجنب لمس الكربون فيلم مع طرف ماصة حتى لا تلحق الضرر الكربون الفيلم. يجب أن ينتشر السائل عبر الشبكة بسبب الشحنة المودعة أثناء تفريغ التوهج.
13. بدء عملية النشاف أثناء مراقبة الشبكة. يتوفر نطاق عرض على GP2 لايكا لهذا الغرض.
14. لاحظ ما إذا كان السائل يتم سحبه من سطح الكربون في الشبكة خلال هذا الوقت ، وهذا يبدأ مع غالبية البولوس السائل على الشبكة تسطيح بها كما السائل هو شرير من خلال الشبكة. كما يتم تقليل السائل في كل مربع الشبكة أكثر من ذلك، يمكن ملاحظة موجة من "ظهرت" عبر سطح الشبكة. إذا لوحظ هذا التأثير، يمكن إيقاف النشاف في غضون 2-3 ق من نهاية تأثير ظهرت. ليس من الضروري أن يغرق شبكة الاختبار التي يمكن تجاهلها.
15. إذا لم يتم ملاحظة ما يسمى تأثير "ظهرت"، كرر الخطوات 2.11-2.14، في كل مرة تمديد وقت النشاف من قبل 1-2 ق حتى لوحظ تأثير ظهرت قبل الذراع النشاف يتراجع من الشبكة. لاحظ هذه المرة للخطوة 3.
    ملاحظة: من المهم أن يتوقف النشاف بمجرد حدوث هذا التأثير المتفرقع لضمان عدم جفاف البلورات أثناء العملية من الإفراط في النشاف. استخدام محلول التبلور من الخزان للرقع الظهر والتخفيف من العينة، كما أنه يضمن أن البلورات تخضع لحل ثابت، والحد من خطر زعزعة استقرار بلورات.

3. حصاد بلورات

1. ضع لوحة التبلور تحت المجهر الخفيف وضع الهدف جيدا داخل مجال الرؤية.
2. ضع شبكة طازجة ومتوهجة في ملقط الفريزر المغرق وجبل ملقط في الثلاجة يغرق، مع الجانب الكربون فيلم تواجه بعيدا عن الذراع النشاف.
3. تدوير ملقط حتى الجانب الكربون فيلم يواجه الذراع النشاف.
4. باستخدام ماصة 2.5 ميكرولتر، قم بتطبيق 2 ميكرولتر من محلول الخزان من أنبوب 0.5 مل إلى الجانب غير الداعم لشبكة cryoTEM وتناوب الشبكة بحيث يواجه جانب دعم فيلم الكربون منفذ العينة من ثلاجة الهبوط.
5. قشر مرة أخرى الختم المؤقت ومع ماصة تعيين إلى 2 ميكرولتر، يستنشق بلطف قطرة تبلور مرارا وتكرارا لتعليق microcrystals (من المهم عدم إدخال فقاعات الهواء إلى قطرة).
   ملاحظة: من المهم مراقبة هذه العملية تحت المجهر الضوئي لضمان إطلاق البلورات من أي جلد سطحي أو قاعدة البئر. إذا كانت البلورات عالقة ولم يتم وضعها مع الطموح ، فإما أن طرف المصة أو أدوات التبلور الأخرى مثل إبرة الوخز بالإبر ، يمكن استخدامها لطرد البلورات بلطف. اعتمادا على حجم البلورات وعمق مجال المجهر الخفيف ، فمن الممكن في بعض الأحيان لعرض ، وذلك باستخدام المجهر ، وبلورات دخول طرف ماصة.
6. نقل 2 ميكرولتر من الطين microcrystal يستنشق إلى الثلاجة يغرق وتطبيق جميع العينة على الجانب الكربوني من شبكة cryoTEM.
7. لطخة للوقت المحدد في الخطوة 2 والشروع فورا يغرق تجميد. أثناء النشاف ، لاحظ حدوث تأثير موجة ظهرت عبر الشبكة ولاحظ ما إذا كان هذا قد حدث تماما عبر الشبكة. وجود بلورات يمكن أن تؤثر على وقت النشاف الأولي، وهذا قد تحتاج إلى تعديل لشبكات لاحقة من قبل 1-2 s.
8. العمل بسرعة، ونقل الشبكة من الإيثان السائل إلى مربع الشبكة مغمورة في النيتروجين السائل. يمكن أن يتحول الإيثان المتبقي إلى مادة صلبة بيضاء معتمة على الشبكة عندما يدخل النيتروجين السائل. للحد من ذلك، قم بإزالة الشبكة بثبات من الإيثان السائل، ثم نقل بسرعة إلى خزان النيتروجين السائل.
9. مرة واحدة وقد وضعت 4 شبكات في مربع الشبكة، وتأمين غطاء الصندوق مع المسمار ونقله إما إلى ديوار رغوة من النيتروجين السائل للسماح لمزيد من تقييم العينة مع المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) أو إلى تخزين النيتروجين السائل dewar باستخدام حاوية تخزين مناسبة.

4. تقييم كثافة العينة بواسطة المجهر الخفيف

تنبيه: هذه الطريقة مدمرة. إذا كان هناك توافر محدود للعينة، مثل قطرة تبلور واحدة أو اثنتين فقط، فمن المستحسن تخطي هذه الخطوة. بعد هبوط عينات التجميد (الخطوة 3.7) يمكن تقييم توزيع البلورات عبر الشبكة.

1. جبل الجافة، ودرجة حرارة الغرفة cryoTEM الشبكة في ملقط يغرق الفريزر ووضع ملقط على جانبهم على المجهر الخفيف، مع الشبكة في مجال الرؤية. تعيين تكبير وتركيز مناسبين بحيث يمكن حل الشبكة بأكملها ومربعات الشبكة الفردية.
2. اتبع الخطوات 3.1-3.7.
3. بدلا من نقل الشبكة إلى مربع الشبكة (الخطوة 3.8)، اسحب الشبكة المغرقة من الإيثان السائل عن طريق إعادة تعيين الفريزر.
   تنبيه: سوف تدفئ الشبكة والعينة لدرجة حرارة الغرفة ولا يمكن استخدامها لإجراء المزيد من تجارب الحيود.
4. إزالة ملقط من صك تجميد يغرق.
5. في حين عقد الشبكة داخل ملقط ، ووضع الشبكة تحت المجهر الخفيف -- سيتم بالفعل التركيز على تعيين تقريبا.
6. أداء التركيز غرامة وتقييم كثافة بلورات عبر الشبكة. شبكة جيدة سوف تحتوي على العديد من بلورات معزولة بعيدا عن أشرطة الشبكة داخل كل مربع الشبكة وتكتل بلورات هو الحد الأدنى.
7. حيث كثافة بلورات داخل الشبكة النتائج في تكتل بلورات مع بلورات معزولة قليلة فقط، مزيد من تمييع الطين الكريستال مع محلول الخزان وتكرار الخطوة 3. الحرص عند تمييع العينات بحيث لا يؤدي التخفيف إلى انحلال البلورات.
8. تمييع البلورات في خطوات باستخدام كميات صغيرة من 0.5-1 ميكرولتر.

5. تقييم العينة عن طريق المسح المجهري الإلكتروني

ملاحظة: إعداد البلورات الدقيقة على شبكات cryoTEM هو أفضل تقييم مع المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) في ظل ظروف التبريد، وهذا يمكن تحقيقه مع SEM مزودة مرحلة التبريد. في VMXm، يتم استخدام جيول JSM-IT100 SEM (مصدر التنغستن) مع القفل الهوائي PP3006 النصاب و cryostage. لضمان الحد الأدنى من الضرر الإشعاعي عند عرض عينات على VMXm^28،29، يتم استخدام الإعدادات التالية: 5 كيلو فولت الجهد المتسارع ؛ حجم بقعة من 40 (وحدات التعسفي على JSM-IT100 JEOL); 10 ملم مسافة العمل. يتم تسجيل الصور باستخدام كاشف الإلكترون الثانوي ، لمحاذاة العينة والتركيز على وقت السكن من 0.8 ميكروس يستخدم في حين يتم التقاط صور عالية الدقة من بلورات واحدة باستخدام وقت يسكن من 16 ميكروس. من المهم قبل تحميل عينة في SEM أن يتم محاذاة المجهر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وينصح بتحميل شبكة واحدة فقط في SEM بينما يتم حجز أي شبكات متبقية معدة بنفس المعلمات لتجارب الحيود بالأشعة السينية.

1. إعداد SEM عن طريق تبريد نموذج مرحلة التبريد إلى -180 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اتبع الإرشادات الخاصة بتحميل شبكات cryoTEM في النظام المحدد المتوفر.
2. مع تحميل العينة في SEM، قم بتشغيل شعاع الإلكترون، ومحاذاة العينة وتعيين التركيز باستخدام تكبير عالي (0.8 ميكروس وقت الإسهاب).
3. أولا، إجراء التقييم الأولي مع الشبكة بأكملها في عرض في التكبير منخفضة (x45). تسجيل صورة في هذا التكبير.
4. زيادة التكبير للسماح بفحص أوثق من المربعات الشبكة الفردية، وينبغي أن تكون بلورات الفردية يمكن ملاحظتها بوضوح شديد.
5. التحرك في جميع أنحاء الشبكة ، والتقاط الصور الثابتة (16 ميكروس يسكن الوقت) من بلورات ضمان أنها تلبي المتطلبات التالية قبل المتابعة :
   1. تأكد من أن الشبكات مسطحة ، وفيلم دعم الكربون سليم إلى حد كبير.
   2. تأكد من وجود العديد من البلورات المفردة مع هالة ضيقة من السائل المهتز المحيط بالكريستال.
   3. تأكد من أن الثقوب في فيلم دعم الكربون مرئية.
   4. تأكد من عدم وجود مناطق كبيرة من السائل الهازئ كما هو محدد من خلال مظهر داكن وسلس.
   5. تأكد من وجود القليل من الجليد السداسي أو عدم وجوده، أو الجليد السطحي المنتشر عبر الشبكة.
   6. تأكد من توزيع البلورات بالتساوي عبر فيلم الدعم وعدم تداخلها.
6. عند هذه النقطة، قياس بدقة أبعاد عدد من بلورات للسماح لدقة ارتباط حجم شعاع الأشعة السينية خلال تجارب الحيود في وقت لاحق.
7. ويمكن استخدام العينات التي يمكن استرجاعها بشكل موثوق من SEM وصيانتها في درجات حرارة المبردة في وقت لاحق لتجارب حيود الأشعة السينية. إذا لم يكن ذلك ممكنا، التخلص من هذه العينات.
   ملاحظة: أثناء تصوير كل من الشبكة بأكملها والبلورات الدقيقة الفردية (تقريبا x45 و x700 التكبير على التوالي)، ينبغي إجراء تقييم حول ما إذا كان المضي قدما إلى خط الحزم مع الشبكات المعدة باستخدام نفس المعلمات أو ما إذا كانت بعض المعلمات قد تحتاج إلى تعديل خلال الخطوة 3. يجب أن تفي الشبكات بالاختبارات الموضحة في الخطوة 5.5. إذا كانت الشبكات لا تفي بهذه المعايير، يلزم تحسينها خلال الخطوة 3 قبل تكرار الخطوة 5.

6. إعداد الشبكة لتجارب الحيود في VMXm

1. تبريد العدد المطلوب من أصحاب عينة VMXm (الشكل 4A) (حتى 5) تحميلها في خرطوشة العينة (مع غطاء) مع محمل العينة في ديوار رغوة كبيرة (الشكل 4B) باستخدام النيتروجين السائل - وهذا يمكن أن يتطلب كمية كبيرة من النيتروجين السائل. يجب أن يكون مستوى النيتروجين السائل أعلى بقليل من موضع العينة على محمل العينة.
2. إعداد التدور والأدوات.
3. وضع أدوات بما في ذلك أداة لقطة، ملقط وMVXm ملقط العينة، في ثقوب في محمل العينة لتبرد. يمكن أن يكون من المفيد ترتيب تسليط الضوء فوق ديوار.
4. نقل بسرعة مربع الشبكة التي تحتوي على شبكات microcrystal تحميلها إلى عطلة مربع الشبكة على محمل عينة وفك الغطاء بحيث يكون فضفاضة وقابلة للدوران (لا إزالة).
5. تحت النيتروجين السائل إزالة الغطاء من خرطوشة العينة مع ملقط كبيرة ووضعه تحت محمل العينة.
6. استخدم ملقط عينة VMXm لرفع حامل العينة إلى محمل العينة، مع التأكد من أن الحامل يواجه لأعلى حتى يتمكن من قبول الشبكة. عندما تكون في الموضع الصحيح، سوف دبوس صغير على محمل عينة التعامل مع ثقب صغير في منتصف حامل العينة.
7. مع ملقط غرامة تبريد، رفع بعناية الشبكة من مربع الشبكة ونقل قريبة من فتح الشبكة على حامل العينة. تدوير الشبكة بحيث يضع شقة (لا يهم الطريقة التي تواجه الجانب الفيلم الدعم).
8. خفض بلطف ملقط بحيث تكون الشبكة أقرب ما يمكن فوق فتح الشبكة (كن حذرا لعدم ثني الشبكة) وإطلاق الشبكة في الفتحة. إذا لم يتم مقعد الشبكة بشكل صحيح، استخدم ملقط الدقيقة بعناية لدفع الشبكة إلى موضعها أو انقر برفق على حامل العينة مع ملقط أكبر.
9. ضع بسرعة أداة circlip المبردة مسبقا فوق الشبكة في فتحة الشبكة ومقعد الدوران عن طريق الضغط على الزر. يمكن أن يكون من المفيد تطبيق 2 المنخفضات من الزر لضمان يجلس بشكل صحيح circlip.
10. أعلى النيتروجين السائل حتى يكون مستوى ~ 1.5 سم فوق حامل العينة. باستخدام ملقط عينة VMXm، ارفع حامل العينة المحمل بعناية إلى أعلى وعلى الدبوس الصغير الموجود على محمل العينة ثم قم بالعودة إلى خرطوشة العينة. لاحظ رقم موضع حامل العينة في خرطوشة العينة.
11. استمر في تحميل الشبكات في حاملات العينة حتى يتم تحميل كافة العينات.
12. إرجاع مربعات الشبكة إلى dewar التخزين إذا كانت العينات تبقى داخل وإزالة محمل عينة من ديوار لخلق مساحة أكبر.
13. استبدل غطاء الخرطوشة على الخرطوشة، وتأكد من أن الدبوس الموجود أعلى الخرطوشة يتفاعل مع الثقب الموجود في الغطاء.
14. بارد وملء ديوار القفل الهوائي VMXm مع النيتروجين السائل ومكان بجوار ديوار الرغوة التي تحتوي على خرطوشة عينة محملة.
15. باستخدام أداة خرطوشة VMXm، قم بدمج الأداة بعناية في التلال على جانب الخرطوشة وارفع الخرطوشة بسرعة إلى دوار القفل الهوائي.
16. تأكد من أن مستوى النيتروجين السائل يغطي الخرطوشة.
17. ضع غطاء على دوار القفل الهوائي ثم انتقل إلى محطة VMXm النهائية باستخدام خرطوشة العينة المحملة.
    ملاحظة: سيتم تحميل خرطوشة العينة في محطة VMXm النهائية من قبل موظفي الحزمة.

النتائج

الهدف من هذا البروتوكول هو تحقيق البلورات الدقيقة التزجيج مع الحد الأدنى من حجم السائل المحيطة الكريستال التي تمكن تجارب الحيود الأشعة السينية مع الحد الأدنى من التشتت الخلفية لتحسين إشارة الحيود. مثال تظهر صور SEM للبلورات الدقيقة المعدة على شبكات cryoTEM للنثر الخلفي الأدنى في الشكل 1A وB والشكل 2. الشبكات مع بلورات واحدة موزعة بالتساوي سوف توفر الاستخدام الأكثر كفاءة للشبكة، مع إشارة جيدة إلى الضوضاء. ومع ذلك، هذا غير ممكن عادة عبر الشبكة بأكملها وبعض المناطق قد تعرض قدرا من تكتل(الشكل 2A، B). على الرغم من هذا التكتل، لا تزال هذه الأمثلة تعرض عددا مفيدا من بلورات معزولة واحدة من شأنها أن توفر الحيود الخلفية المنخفضة(الشكل 5). يمكن أن يختلف مستوى النشاف الذي لا يزال يحافظ على تشتت منخفض الخلفية. النشاف قوية بحيث الثقوب في فيلم دعم الكربون واضحة للعيان ولكن بلورات لا تزال رطب هو الهدف (الشكل 2C, D). ومع ذلك ، لا يزال بإمكان شبكات ذات نوعية جيدة عرض بعض السائل داخل ثقوب فيلم الدعم على الرغم من أن موضع الثقوب يجب أن يكون لا يزال قابلا للتحديد(الشكل 2A ، B). الأهم من ذلك، كل هذه الأمثلة عرض بلورات واحدة معزولة مع هالة من السائل المهتز المحيطة الكريستال للحفاظ على الترطيب بين النشاف وتجميد يغرق.

قد تتطلب العديد من العينات المزيد من التحسين(الشكل 3)،والتي يمكن أن تشمل الاختلاف في وقت النشاف أو تركيز البلورات الدقيقة. الشبكات المحملة بالبلورات سوف تظهر انخفاض كفاءة النشاف ويمكن أن يؤدي إلى شبكات متعددة يتم تسجيلها في صور حيود واحدة(الشكل 3A، B). يمكن أن تؤدي ظروف التبلور اللزجة أكثر، مثل تلك الخاصة بالتريبسين الذي يحتوي على 8٪ PEG 4000 و 15٪ جلايكول الإيثيلين(الشكل 3C)،إلى الحاجة إلى فترات النشا أطول (>10 s). على العكس من ذلك ، يمكن أن تتبلور الظروف مع لزوجة منخفضة جدا أن لطخة بسرعة كبيرة ، تعاني من مشاكل في التوزيع بسبب الجاذبية مما تسبب في تسوية قبل النشاف يحدث ، مما أدى إلى استقرار جميع microcrystals على طول جانب واحد من الشبكة (الشكل 3د).

يسمح الإعداد الأمثل للعينات باستغلال القدرات الكاملة ل VMXm لجمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الجودة بأعلى دقة ممكنة مع إشارة عالية إلى ضوضاء (الشكل 5). وتستفيد هذه العينات من توافقها مع بيئة العينة داخل المهبل، مما يؤدي إلى انخفاض شديد أو صفر في متوسط عدد الخلفيات في صور الحيود. استخدام الإيثان السائل، دون حماية التبريد، يؤدي إلى عدم وجود حلقات الجليد (الشكل 5)، على الرغم من أن حيث بلورات تقع على مقربة من قضبان شبكة النحاس، شعاع الأشعة السينية يمكن إلقاء نظرة على القضبان مما أدى إلى حلقات حيود مسحوق النحاس في ~ 2.1 Å و ~ 1.8 Å.

الشكل 1: مقارنة تركيب البلورات الدقيقة على يتصاعد micromesh وشبكات cyoTEM. مسح ميكروجرافات الإلكترون من البلورات الدقيقة المجمدة من الفيروسات متعددة الأضلاع قياس 2.5 ميكرومتر عبر (A، B) 5 كيلو فولت الجهد المتسارع، وحجم بقعة من 39 (وحدات التعسفي) ووقت يسكن من 16 ميكرومتر. الشبكة خالية من السائل الزائد (A)، لوحظ هالة ضيقة من السائل المحيطة بلورات (ب). نفس العينات التي شنت على micromesh (20 ميكرومتر فتحات) قبل فلاش التبريد في النيتروجين السائل ولاحظ باستخدام نظام عرض على محور في الحزمة I24 وجها لوجه (C) والجانب على (D). التشوهات البصرية(C)عند عرض وجها لوجه تعطي مؤشرا على مدى سمك السائل عبر micromesh، وهذا هو أكثر وضوحا عند عرض الجانب micromesh على (D). يمثل الهدف الأحمر في C و D موضع شعاع الأشعة السينية وحجمه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: أمثلة على عينات ذات نوعية جيدة. بلورات بوليهيدرا(A)لوحظ عبر مربع شبكة واحدة ~ 100 ميكرومتر. في حين أن بعض البلورات متجمعة قليلا وتظهر بعض الاتصال من السائل المحيط بها، وهناك عدد من بلورات واحدة معزولة مع هالة صغيرة من السائل المحيطة الكريستال. بلورات الأنسولين أكبر قليلا (ب) قياس ~ 5 × 5 ميكرومتر تظهر أيضا بعض تكتل ولكن مرة أخرى هناك بلورات الفردية معزولة بشكل جيد. بلورات إبرة يمكن أن يكون لها بعد ضيق جدا وتتطلب الميكروبات، مثل هذه بلورات lysozyme على شكل إبرة(C). ويمكن رؤية نطاق ضيق من السائل المحيطة هذه البلورات (هالة رمادية فاتحة). أكبر microcrystals تصل إلى عشرات ميكرون أيضا يمكن تركيبها بشكل جيد على شبكات cryoTEM، مثل هذه بلورات البروتين ~7 ميكرومتر K (D). في كل من (C) و (D) وإلى حد أقل في (A) ، تكون ثقوب فيلم دعم الكربون مرئية بوضوح ، مما يدل على وجود القليل جدا / لا يوجد سائل. في المثال B ، في حين لا توجد ثقوب فارغة ، لا يزال من الممكن تحديد موضع الثقوب ، مما يشير إلى أن السائل يملأ الثقوب فقط في فيلم الدعم. في كل هذه الأمثلة ، يمكن رؤية هالة من السائل حول حافة مربع الشبكة (مربع داخلي مستدير) ، حيث يكون للثقوب مظهر رمادي أخف. هذه سمة مشتركة من الشبكات المعدة جيدا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3:أمثلة على العينات التي تتطلب المزيد من التحسين. شبكات مثقلة microcrystals (A ، B) يمكن أن تزيد من خلفية مبعثر كما العينات كتلة الثقوب في الفيلم دعم الحد من كفاءة النشاف ، ومع ارتفاع التوتر السطحي بين بلورات أكثر بقايا السائل. وبالإضافة إلى تدهور الإشارة إلى الضوضاء مما يؤدي إلى فقدان المعلومات، فمن المرجح أن يتم تسجيل شعريات متعددة. باستخدام وقت النشاف الذي ليس طويلا بما فيه الكفاية، أو حل بلورة لزجة للغاية يمكن أن يؤدي إلى عينة الرطب بشكل مفرط(C)،كما تنتج إشارة منخفضة إلى الضوضاء. ظروف التبلور مع عدم وجود مثبطات، مثل تلك للأنسولين البقري(D)،لديها لزوجة منخفضة جدا. في حين أن هذا يؤدي إلى وقت النشاف قصيرة جدا، فإنه يمكن أن يؤدي أيضا إلى حركة بلورات عبر الشبكة قبل وأثناء النشاف بسبب آثار الجاذبية. وهذا عادة ما يؤدي إلى شبكة فارغة إلى حد كبير مع تركيز عال من بلورات على طول حافة واحدة (D). يمكن أن يكون من المفيد إضافة عامل لزج مثل جلايكول الإيثيلين إلى الطين الكريستالي قبل وقت قصير من تطبيقها على الشبكة للحد من تدفق الكريستال وتحسين توزيع البلورات. هذا يمكن أيضا إطالة وقت النشاف، مما يجعل من الأسهل لمراقبة النشاف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: أدوات لتحميل العينة في VMXm. وقد تم تصميم مجموعة مفصلة من الأدوات لتحميل أصحاب عينة VMXm (أ). يحتوي محمل العينة(B)على مساحة لحامل عينة VMXm واحد ومربع الشبكة وتخزين الأداة أثناء العمل. كما أنها مصممة للسماح بالعمل تحت سطح النيتروجين السائل والسماح لخرطوشة العينة لتناسب تحت (ب). يتم استخدام ديوار القفل الهوائي (C) ، الذي يناسب مربع غاز النيتروجين القفل الهوائي على محطة VMXm النهائية ، لأخذ خرطوشة العينة المحملة من المختبر إلى كوخ الحزم التجريبي. لعرض العينات في SEM غير متصل، تم إجراء مكوك مفصل(D)يتألف من حامل عينة VMXm بدون قاعدة لتمكين التقييم في حامل العينة الذي يستخدم على خط الحزمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: مثال على الحيود من البلورات الدقيقة في VMXm. صورة حيود واحدة مسجلة باستخدام كاشف Pilatus 3 6M في VMXm من بلورة متعددة الهدرال فيروس ~ 3 ميكرومتر محمولة على شبكة cryoTEM باستخدام طريقة تجميد الهبوط. ويلاحظ الحيود إلى ما بعد 1.7 ألف وانعكاس (مربع أزرق) في 1.74 ألف هو inset ، مما يدل على انخفاض الخلفية مبعثر ، مع عدد كبير من بكسل مع العد صفر. تمت إضافة جلايكول الإيثيلين إلى تركيز نهائي قدره 50٪ v/v إلى الطين البلوري قبل تطبيقه على الشبكة. تظهر طبيعة الخلفية المنخفضة لموضع عينة VMXm من خلال الخلفية الثابتة عبر الصورة كما هو موضح من خلال الكثافات المرسومة تحت الخط الأزرق المتقطع ، حتى بالقرب من مركز الحزمة. تظهر الكثافات المرسومة أن الخلفية لا تزال أقل من 3 تهم. لوحظت حلقتان خافتتان عند 2.15 Å و 1.86 Å اللتين يتم إنشاؤهما بواسطة حيود مسحوق النحاس لشبكة cryoTEM. لا توجد حلقات جليدية يمكن اكتشافها ، مما يدل على فعالية النشاف تليها التبريد مع الإيثان السائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام أدوات إعداد عينة cryoTEM لإعداد البلورات الدقيقة لتجارب حيود الأشعة السينية في خطوط الحزم البؤرية الدقيقة. وتتركز الأجهزة الحزمة القياسية حول عينة مثبتة دبوس وبينما بذلت جهود لتوفير دعم عينة على هذه يتصاعد للبلورات الدقيقة، فإنها غالبا ما تكون صعبة لتحميل مع عينة مع ضمان أن يتم تحقيق أعلى إشارة إلى الضوضاء(الشكل 1C، D). قد تتطلب العديد من هذه العينات أيضا تحسين ظروف الحماية من التبريد لضمان أن تكون العينة ذات حيوية. طريقة تجميد يغرق يوفر طريقة قابلة للتكرار لإزالة السائل الزائد وفلاش تبريد العينة في cryogen كفاءة (الشكل 1A, B). في حين يمكن بعد ذلك تركيب الشبكة على خط شعاعي قياسي مع جبل دبوس قائم على ملاقط ، فقد تم تصميم حاملي عينات VMXm خصيصا لقبول الشبكات والاحتفاظ بها تحت درجة حرارة انتقال الزجاج في بيئة فراغ عبر التبريد التوصيلي. تتيح بيئة العينة في VMXm جمع بيانات الخلفية المنخفضة ، حيث تكون العينة هي المصدر المتبقي للخلفية ، وتوفر ميكروبا يمكن استخدامه لمطابقة البلورات ذات الأبعاد الأقل من 10 ميكرومتر. يمكن أيضا استخدام طريقة إعداد العينة هذه لإعداد البلورات النانوية للانعراج الإلكتروني حيث يوجد أيضا شرط لسائل فائض قليل جدا وعينة حيوى بسبب ضعف اختراق الإلكترونات. في حين أن شبكات cryoTEM هشة ، فإن تلك التي شهدت في حصاد البلورات في الحلقات سوف تتكيف بسرعة مع التعامل مع الشبكات. مع كمية صغيرة من الخبرة، سيتم فقدان شبكات قليلة خلال مراحل النشاف والتجميد والتحميل من البروتوكول. خطوات التحسين، ومع ذلك، حاسمة لهذا النجاح وإعداد دقيق سوف يقلل من فرص فقدان بلورات أو الحد من سلامة الكريستال.

توفر شبكات CryoTEM جبلا واحدا كبيرا نسبيا يمكن أن يحتوي على مئات البلورات ، وبالتالي تحسين الإنتاجية حيث قد يكون من الممكن فقط تسجيل إسفين صغير من بيانات الحيود. شبكة واحدة قد توفر أيضا ما يكفي من بلورات لتحديد بنية البروتين، لا سيما في بلورات من التماثل العالي. حيث واحد فقط أو اثنين من قطرات تبلور واحد قد ولدت microcrystals، النشاف المحاكمة من حالة التبلور وحدها يمكن أن تساعد على ضمان أنه عندما يتم مسح البلورات الدقيقة، والأوقات المستخدمة هي أقرب ما يمكن لتلك اللازمة لتوليد عينات ذات نوعية جيدة الأولية. تدعم أفلام الكربون غير مرئية للأشعة السينية وتتوفر مع تباعد الثقوب المختلفة ، والتي يمكن استخدامها لتناسب مورفولوجيا معينة. نحن الأكثر شيوعا الاستفادة من أفلام الدعم مع ثقوب 2 ميكرومتر في تباعد 2 ميكرومتر، ولكن ثقوب أصغر مع تباعد أكبر قد تكون أكثر ملاءمة للبلورات أصغر من 2 ميكرومتر. تتوفر أفلام دعم أخرى مثل تلك التي بها ثقوب 1 ميكرومتر مع تباعد 4 ميكرومتر بالإضافة إلى أفلام الدعم ذات الثقوب المختلفة الشكل ، وكلها ستؤثر على وقت النشاف. شبكة مربعة حجم شبكة من 200 (200 مربع لكل بوصة) كما يوفر مساحة كافية (~ 100 ميكرومتر) بين قضبان شبكة النحاس بحيث شعاع الأشعة السينية لا تتفاعل بقوة مع النحاس في حين توفير الدعم الهيكلي الكافي لفيلم الكربون محملة بلورات. استخدام الإيثان السائل ينفي الحاجة إلى المبردات، مما يقلل بدوره من المتطلبات على حجم العينة التي كانت ستستخدم في تحسين ظروف البروتين المبرد.

المعلمات الرئيسية التي سيتم تحسينها أثناء العملية هي أوقات النشاف وتخفيف العينة. يجب أن تكون أوقات النشاف طويلة بما يكفي لمراقبة تأثير "الظهور" عبر الشبكة بأكملها قبل الهبوط في التجمد. يمكن أن يؤدي النشاف الزائد إلى جفاف البلورات ، ومع ذلك ، يتم استخدام التحكم في الرطوبة داخل غرفة العينة لتقليل هذا التأثير. في حين يقترح أن الرطوبة النسبية من 90٪ المستخدمة، قد تستفيد بعض العينات في الاستفادة الأمثل من الرطوبة. قد تؤثر الرطوبة على كفاءة النشاف لورق النشاف الذي يمكن أن يصبح مشبعا بالماء ببطء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التحكم في الرطوبة داخل غرفة العينة لتحسين جودة الحيود من بلورات³⁰. من المستحسن إجراء تغييرات صغيرة (<5٪ في الرطوبة قبل التحقق من سلامة الحيود لضمان عدم تدهور جودة الحيود.

يمكن إجراء تحسين العينات غير الثمينة باستخدام مجهر خفيف بدلا من SEM. على الرغم من أنها مدمرة ، فمن المفيد لتقييم كثافة البلورات عبر الشبكة وتمكين اتخاذ القرار بشأن ما إذا كان ينبغي تخفيف العينة أو تركيزها لتفريق بلورات بشكل أفضل عبر الشبكة. هذه الخطوة هي الأكثر فائدة عندما يكون هناك عدد كبير من بلورات المتاحة وخاصة العينات عالية التركيز. يجب تجنب تجميع بلورات معا(الشكل 3)،كما في حين أنها ليست مشكلة كبيرة إذا كانت بلورتين مضيئة في نفس الوقت أثناء جمع البيانات^6،سيكون هناك على الأرجح حجم أكبر من السائل المحيطة كتلة، وبالتالي تقليل إشارة إلى الضوضاء (الشكل 5). في حين أنه من الممكن مراقبة تجاوزات كبيرة من السائل على الصعيد العالمي عبر الشبكة باستخدام المجهر الخفيف ، لا يمكن إجراء تقييم لحجم السائل المحيط بالبلورات الدقيقة ووجود الجليد البلوري إلا باستخدام المجهر الإلكتروني المزود بنظام نقل فراغ المبردة والمرحلة. في بعض الأحيان، بعد تطبيق بلورات على الشبكة وقبل أن يحدث النشاف، بلورات في حلول اللزوجة منخفضة قد يستقر على طول حافة واحدة من الشبكة. لقد وجدنا أن إضافة ما يصل إلى تركيز نهائي بنسبة 50٪ من جلايكول الإيثيلين يمكن أن يبطئ حركة البلورات من خلال القطيرات ، مما يضمن توزيعا أفضل للبلورات الدقيقة عبر الشبكة بالإضافة إلى توفير تحكم أكبر في النشاف عن طريق زيادة وقت النشاف(الشكل 3D).

يمكن أن تكون بعض حلول التبلور التي تحتوي على عوامل لزجة مثل PEGs عالية الوزن الجزيئي صعبة لللطخة ، مما يتطلب أوقات النشا طويلة بشكل متزايد (>10 s). في مثل هذه الحالات، يمكن أن يكون من المفيد تقليل حجم السائل المودع على الجزء الخلفي من الشبكة، فضلا عن حجم الكريستال التي تحتوي على حل إلى جانب دعم الفيلم من الشبكة. استراتيجيات مثل استخدام 2 طبقات من الورق النشاف أو الألياف الزجاجية قد تساعد أيضا النشاف في هذه الحالات الصعبة³¹.

في حين أن خط الأنابيب هذا مناسب لبلورات البروتين القابلة للذوبان ، فإن تلك التي تتشكل في وسائل لزجة للغاية مثل بروتينات الأغشية في LCP تمثل تحديا مختلفا لا يناسبه هذا البروتوكول. ومع ذلك، تظهر استراتيجيات لإعداد بلورات LCP على شبكات cryoTEM للميكروED والتي تشمل الحد من لزوجة العينات عن طريق إحداث تغيير مرحلي في LCP. يسمح هذا العينات ليتم تطبيقها على شبكات بطريقة مشابهة لتلك الموضحة في هذه المقالة. وأخيرا، يمكن طحن العينة مع شعاع أيون مركزة لإزالة المواد الزائدة غير الكريستال^32،33،34.

وعموما، فإن خط الأنابيب هذا يستغرق عموما 1-2 ساعة (بما في ذلك وقت إعداد المعدات) لمتابعة من العينة التي تصل إلى VMXm لتوفير الشبكات الأمثل مع عينات مشتتة جيدا، وvitrified، اعتمادا على توافر العينة، وتركيز بلورات و لزوجة الحل تبلور. وقد استخدمت هذه الأساليب بالفعل بنجاح لإعداد البلورات الدقيقة لتجارب الحيود بالأشعة السينية استكشاف الأضرار الإشعاعية على البلورات الدقيقة حيث كان الحد الأدنى من حجم السائل المحيطة العينة الأساسية^28،35. وتجدر الإشارة إلى أن البروتوكول يمكن تطبيقه على جميع عينات البلورات الدقيقة القابلة للذوبان، وليس فقط على عينات منتشرة جيدا التي تم تحسينها بالفعل. تجربة التبلور التي تنتج المواد microcrystalline تقليديا أن يكون هدفا للتحسين بهدف الحصول على بلورات أكبر، ومع ذلك، فإن هذه الطريقة إعداد العينة وقدرات VMXm قد تسمح بجمع البيانات الكافية من هذه العينات دون مزيد من التحسين. بدلا من ذلك، إذا كانت هذه العينات microcrystalline diffract سيئة، والبيانات التي تم جمعها من VMXm باستخدام هذه الطريقة إعداد العينة لا يزال يمكن أن تكون بمثابة دليل مفيد لمزيد من التحسين من ظروف التبلور. أدوات لإعداد الشبكات، بما في ذلك تفريغ توهج وتجميد يغرق متاحة الآن على نطاق واسع في معاهد البحوث مجهزة لتجارب cryoTEM وسوف تكون متاحة لكثير من المستخدمين تمكينهم من إعداد عينات قبل وقت الحزم في VMXm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument	Leica or ThermoFisher	Various
Benchtop light microscope with light source	Various	Various
Blade/Scalpel	Fisher Scientific	Various
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes	Quantifoil	N1-C16nCu20-50
CryoTEM grid storage boxes	Agar Scientific	AGG3727
ddH2O	n/a	n/a
Ethane gas supply	n/a	n/a
Ethylene Glycol	Acros Organics	146750010
Glass microscope slides	FisherBrand	12383118
Glass petri dish	FisherBrand	455732
Glow discharging device	Pelco	91000S
Laboratory wrapping film (Parafilm)	Bemis	HS234526B
Large and small, fine forceps	Agar Scientific	Various
Liquid nitrogen supply	n/a	n/a
Pipette tips	Various	Various
Pipetting devices	Various	Various
Sealing tape for crystallisation plates.	Molecular Dimensions	MD6-01
Small/medium liquid nitrogen dewars	Spearlab	Various
Sprung circlip clipping tool	Subangstrom	SCT08
Whatmann No.1 pre-cut filter paper	Leica	16706440