JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتطلب الطلب المتزايد على جمع البيانات على نطاق واسع في التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد إجراءات اكتساب الصور عالية الإنتاجية. ويرد هنا بروتوكول ينفذ التطورات الأخيرة لاستراتيجيات الاستحواذ المتقدمة التي تهدف إلى تعظيم كفاءة الوقت والإنتاجية لجمع البيانات الطبوغرافية.

Abstract

التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryoET) هو طريقة قوية لدراسة البنية ثلاثية الأبعاد للعينات البيولوجية في حالة قريبة من الأم. تتيح عملية cryoET الحديثة الحالية إلى جانب تحليل متوسط التخطيط الفرعي التحديد الهيكلي عالي الدقة للمجمعات الجزيئية الكلية الموجودة في نسخ متعددة داخل عمليات إعادة البناء الطبوغرافي. تتطلب التجارب الطبوغرافية عادة الحصول على كمية كبيرة من سلسلة الميل عن طريق المجاهر الإلكترونية المتطورة ذات تكاليف التشغيل التشغيلية الهامة. على الرغم من أن الإنتاجية والموثوقية لروتين الحصول الآلي على البيانات قد تحسنت باستمرار على مدى السنوات الأخيرة ، فإن عملية اختيار المناطق ذات الاهتمام التي سيتم فيها الحصول على سلسلة الميل لا يمكن أن تكون آلية بسهولة ولا تزال تعتمد على الإدخال اليدوي للمستخدم. لذلك، إعداد جلسة عمل جمع البيانات على نطاق واسع هو إجراء تستغرق وقتا طويلا التي يمكن أن تقلل إلى حد كبير من الوقت المجهر المتبقية المتاحة للحصول على سلسلة الميل. هنا، يصف البروتوكول التطبيقات التي تم تطويرها مؤخرا استنادا إلى حزمة SerialEM وبرنامج PyEM الذي يحسن بشكل كبير من كفاءة الوقت لفحص الشبكة وجمع بيانات سلسلة الميل على نطاق واسع. يوضح البروتوكول المقدم كيفية استخدام وظائف البرمجة النصية SerialEM لأتمتة تعيين الشبكة بالكامل، وتعيين مربع الشبكة، واكتساب سلسلة الميل. علاوة على ذلك، يصف البروتوكول كيفية استخدام PyEM لتحديد أهداف اكتساب إضافية في وضع الاتصال بعد بدء جمع البيانات التلقائي. ولتوضيح هذا البروتوكول، يتم وصف تطبيقه في سياق جمع البيانات المتطورة لسلسلة الميل Sars-Cov-2. خط الأنابيب المعروض مناسب بشكل خاص لتعظيم الكفاءة الزمنية لتجارب التصوير المقطعي التي تتطلب اختيارا دقيقا لأهداف الاستحواذ وفي الوقت نفسه كمية كبيرة من سلسلة الميل التي سيتم جمعها.

Introduction

تعتمد طرق المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) على تصوير العينات البيولوجية عن طريق المجهر الإلكتروني (TEM) بعد التزجيج السريع ، وهي عملية إعداد عينة تحافظ على الهياكل الجزيئية والخلوية للعينات في حالة قريبة من الأصلية ورطبة1،2. في التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryoET) يتم تحقيق نموذج ثلاثي الأبعاد للعينة التزجيج من خلال الحصول على عدد من الصور لنفس المنطقة ذات الاهتمام من اتجاهات مختلفة ، ما يسمى بسلسلة الميل ، تليها إعادة البناء الحسابي للمجلد الطبوغرافي3. وقد نضجت هذه التقنية التصوير المتقدمة في طريقة قوية للتحقيق الهيكلي للعمليات البيولوجية في سياق بيئاتها الخلوية الأصلية4،5،6.

بالإضافة إلى التحليل الهيكلي الفائق للعينة التزجيج ، يمكن الحصول على عمليات إعادة بناء عالية الدقة للمجمعات الجزيئية الكبيرة الموجودة في نسخ متعددة داخل المجلد الطبوغرافي عن طريق تطبيق مخطط فرعي بمتوسط5. ويستند هذا النهج إعادة الإعمار على المحاذاة التكرارية ومتوسط المجلدات الفرعية التي تحتوي على هيكل الاهتمام ويهدف إلى زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وحل إعادة الإعمار النهائي7،8. يعتمد متوسط الرسم الفرعي على جمع ومعالجة كمية كبيرة من البيانات التي تتطلب في كثير من الأحيان الحصول على مئات من سلسلة الميل عن طريق TEMs الراقية مع تكاليف تشغيل تشغيلية مرهقة.

حاليا إعداد مثل هذه الدورات cryoET الآلي هو عملية تستغرق وقتا طويلا التي تعتمد عادة على إدخال المستخدم اليدوي9،10،11. عادة، يتم تحديد الأهداف عن طريق الفحص البصري للشبكة المعينة ثم إعدادها لاحقا لجمع البيانات تلقائيا. غالبا ما تتأثر كفاءة المستخدم في تحديد نقاط الاستحواذ بطبيعة العينة ، وتصبح صعبة بشكل خاص عند تحليل الجزيئات الكلية المنقى بتركيز دون المستوى الأمثل أو في حالة الأحداث النادرة داخل البيئات الخلوية المزدحمة ، مما يعني استخدام النهج المترابطة12. وعلاوة على ذلك، تتطلب مهام سير العمل الحالية الحصول على الصور أثناء الإعداد في التكبيرات المختلفة التي سيتم استخدامها لاحقا لتوطين دقيق وتوسيط الهدف أثناء الاستحواذ الآلي11و13و14. تعتبر خطوات إعادة المحاذاة عالية الدقة هذه حاسمة للتطبيقات عالية الدقة، والتي تتطلب إجراء التصوير عند تكبير عالي وتتطلب خطوات مركزة دقيقة للاحتفاظ بمنطقة الاهتمام داخل مجال الرؤية الصغير الناتج. بالإجمال، يتم الالتزام بعدة ساعات من كل جلسة جمع بيانات لهذا الإجراء الذي يستغرق وقتا طويلا والذي لا تشارك خلاله TEM في الحصول على سلسلة الميل. لذلك، اعتمادا على مقدار سلسلة الميل المطلوبة، يمكن أن يكون لتحديد نقاط الاستحواذ وإعدادها تأثير كبير على وقت المجهر المتاح لجمع البيانات أثناء جلسة cryoET.

وصف هنا هو بروتوكول الأمثل على أساس حزمة البرامج SerialEM15 وأحدث إصدار برنامج PyEM16 لرسم خريطة الشبكات ، خريطة مربعات الشبكة ، وتحديد الأهداف ، وإعداد اقتناء البيانات الآلي لجمع سلسلة الميل على نطاق واسع. المفهوم الرئيسي لهذا النهج هو تزويد SerialEM بالصور التي تم إنشاؤها حسابيا من قبل PyEM لكل عنصر اقتناء ، يطلق عليه خرائط افتراضية ، لتوطين دقيق ومركز الهدف. لكسب وقت الامتلاك الفعلي، يتم اختيار الأهداف وكذلك إنشاء الخرائط الافتراضية خارج الخط باستخدام مثيل وهمية ثانية من SerialEM، وفصل عملية اختيار أهداف الاستحواذ من عمليات TEM. في حين لا تتناول كيفية زيادة جودة البيانات13،17 أو سرعة الحصول على سلسلة الميل18،19، يركز هذا البروتوكول في المقام الأول على استراتيجيات لتحسين كفاءة الوقت لإعداد جلسات cryoET الآلي على نطاق واسع. ولذلك، فإن تنفيذ البروتوكول المقدم مخصص للعلماء الذين يؤسسون سير عمل لجمع بيانات cryoET يرغبون في تعظيم عائد اكتساب البيانات الآلي عن طريق زيادة وقت المجهر المتاح لاكتساب سلسلة الميل.

Protocol

البروتوكول الموصوف هنا هو جزء من وثيقة أكثر شمولا تنتجها EMBL CryoEM Service Platform التي تتضمن تعليمات ولقطات شاشة شاملة خطوة بخطوة توضح الإجراء الكامل لجلسة cryoET النموذجية ، بما في ذلك تحميل العينات ، ورسم خرائط الشبكة ، وضبط المجهر ، وإعداد نقاط الاستحواذ ، وجمع البيانات الآلي. يمكن تنزيل البروتوكول الكامل على الرابط التالي: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download

1. المتطلبات الأساسية

  1. تثبيت SerialEM الإصدار 3.8 وإعداد للتحكم في المجهر وكاشف (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).
  2. تثبيت مثيل وهمية من SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
  3. تثبيت PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).

2. رسم خرائط الشبكة

  1. تحميل كاسيت مع الشبكات في محمل المجهر التلقائي.
  2. إعداد ظروف التصوير المناسبة لرسم خرائط الشبكة بأكملها. القيام بذلك في أدنى تكبير ممكن مع الأخذ في الاعتبار مجال الرؤية على كاشف المستخدمة (EFTEM SA 2250x). حفظ ظروف التصوير ك حالة تصوير SerialEM لجعل الأمور ملائمة للاستخدام لاحقا.
  3. إعداد المونتاج الكامل
    1. افتح القائمة المستكشف SerialEM.
    2. حدد المونتاج والشبكات.
    3. حدد إعداد المونتاج الكامل.
  4. بدء تشغيل البرنامج النصي Grid_Mapping. السماح للبرنامج النصي لانتظار التحميل التلقائي لتهدئة; قم بعمل جرد ثم قم بتعيين كل شبكة وجدها إجراء المخزون. أدخل رسالة بريد إلكتروني عبر قائمة Tilt Series للسماح للبرنامج النصي بإرسال بريد إلكتروني بسهولة عند الانتهاء.
  5. حفظ المستكشف.
  6. فحص جميع خرائط الشبكة من المستكشف SerialEM واختيار الشبكة التي لرسم خريطة أخرى في التكبير أعلى.
    ملاحظة: العديد من TEMs مجهزة نظام التحميل التلقائي سوف تظهر دوران الشبكة عند إعادة تحميلها. من الأفضل إعادة تعيين أي شبكة بعد إعادة تحميلها. عادة ما تعاني الأنظمة البديلة فقط من بعض التحولات ، والتي يمكن تصحيحها في SerialEM بإجراء Shift To Marker.

3. إعداد الجرعة المنخفضة SerialEM

  1. تعيين تكبير SerialEM جرعة منخفضة عرض ومعاينة وسائط (وهذا مطلوب للخطوة 6).
  2. الحصول على صورة عرض وحفظه كخريطة في المستكشف.
  3. الحصول على صورة معاينة، وحفظه كخريطة في المستكشف.
    1. تعيين كلا الوضعين إلى binning نفسه (binning 4 هو المقترح). يسمح هذا بحفظ الخريطتين في مكدس صورة واحد.
    2. في إطار المستكشف SerialEM تغيير تسمية خريطة عرض إلى عرض وتسمية خريطة المعاينة إلى معاينة.
    3. حفظ ملف الملاح وإغلاقه.
      ملاحظة: لا يوجد هدف مطلوب للصور الأولية للعرض والمعاينة، سوف تستخدم PyEM إعدادات التصوير الخاصة بها فقط.

4. رسم خرائط مربعة الشبكة

  1. قم بإعداد شروط التصوير لتعيين مربعات الشبكة. من المهم للغاية أن تكون قادرا على رؤية عينة الاهتمام وتوزيع الخرز ال fiducial. لضمان التباين الأمثل لخرائط مربع الشبكة، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. إدراج فتحة موضوعية.
    2. أدخل فتحة فلتر الطاقة إذا كان ذلك ممكنا.
    3. استخدام ديفوكوس من -100 ميكرومتر.
  2. شاشة لمربعات شبكة جيدة مناسبة لمزيد من التعيين. بعد الفحص البصري للمربعات من خريطة الشبكة، قم بأخذ صور اختبار للمربع مع ظروف التصوير لاستخدامها في خرائط مربعة للشبكة.
  3. عند تحديد مربع جيد، ضع علامة على مركزه في صورة خريطة الشبكة باستخدام ميزة إضافة نقاط في SerialEM Navigator.
  4. بمجرد إضافة كافة النقاط، في SerialEM Navigator اضغط Shift + A على النقطة الأولى، ثم اضغط Shift + A على النقطة الأخيرة.
    ملاحظة: يتم الآن وضع علامة على كافة النقاط المضافة بعلامة A، مما يعني أنها جميعا نقاط اقتناء.
  5. اضغط Shift + N (إنشاء ملف جديد في العنصر) على النقطة الأولى ثم مرة أخرى على النقطة الأخيرة. في مربع الحوار الذي يظهر، حدد الصور المونتاجية.
  6. عندما يظهر مربع الحوار المونتاج، قم بإعداد حجم مونتاج يغطي مربع شبكة واحدة. وهذا يعتمد على التكبير وحجم شبكة الشبكات المستخدمة وعادة ما يتطلب 2 × 2 إلى 4 × 4 المونتاج. اعطه اسما برقم (على سبيل المثال، squaremap_01.mrc) للسماح ل SerialEM برقم تلقائي ملائم لجميع الملفات لكل مربع شبكة.
  7. بدء تشغيل الشبكة-تعيين بفتح القائمة المستكشف SerialEM وانقر فوق الحصولعلى العناصر .
  8. في القائمة المنبثقة، حدد الخيارات التالية.
    1. حدد التركيزية الخام.
    2. حدد الحصول على صورة الخريطة.
    3. حدد إغلاق صمامات العمود في النهاية.
    4. حدد إرسال بريد إلكتروني في النهاية.

5. تحديد الأهداف

  1. فتح مثيل SerialEM وهمية. يمكن إعداد هذا على جهاز الكمبيوتر SerialEM الذي يتحكم في المجهر أو على كمبيوتر آخر (دعم) إذا كان كلا الكمبيوترين يشتركان في اتصال شبكة اتصال.
  2. بمجرد تعيين مربع الشبكة الأول استخدم الخيار "المستكشف SerialEM" دمج الخيار لمشاهدة المونتاج في مثيل SerialEM وهمية.
  3. انقر نقرا مزدوجا فوق نافذة المستكشف لفتح خريطة مربعة للشبكة.
  4. البحث في الخريطة واستخدام الخيار المستكشف SerialEM وهمية إضافة نقاط لإضافة نقاط الحصول على صورة على الهدف من الاهتمام.
  5. عند القيام به وبعد تعيين المربعات الجديدة، حفظ ملف المستكشف ودمج المستكشف مرة أخرى؛ متابعة حتى يتم تعيين كافة مربعات الشبكة.

6. إنشاء خرائط افتراضية

  1. مرة أخرى، دمج ملف المستكشف مع مثيل SerialEM وهمية.
  2. تشغيل البرنامج النصي خرائط الظاهري PyEM من قائمة SerialEM وهمية، أدوات وحدد خرائط مرساة الظاهري. قد يستغرق ذلك بعض الوقت اعتمادا على حجم وكمية خرائط مربع الشبكة و binning من عرض ومعاينة الخرائط.
    ملاحظة: PyEM يبدأ إطار أمر الذي يغلق تلقائيا عند القيام به، ثم يمكن فتح ملف المستكشف الجديد. لكل خريطة مونتاج التي تحتوي على نقاط محددة، يكتب PyEM خريطة مدمجة واحدة وجميع الخرائط الخاصة به للعرض والمعاينة. وأخيرا، فإنه يكتب ملف المستكشف جديد يسمى <navigatorfilename>_automaps.nav.

7. ضبط المجهر

  1. تحقق من ضبط المجهر. لضمان أداء المجهر المناسب، استخدم نفس إعداد حجم التكبير والحزمة للحصول على البيانات بالترتيب التالي.
    1. تشغيل SeriaLEM المحاذاة خالية من الغيبوبة من قبل CTF (زيملين تابلو).
    2. إدراج مركز فتحة الهدف.
    3. تشغيل SerialEM الاستجماتيزم الصحيح من قبل CTF (لصناعة السيارات في stigmate).
    4. تشغيل GIF Quick Tune (أي، التركيز على الشق فقط).
      ملاحظة: بما أن الخطوات 7.1.1 و7.1.3 و7.1.4 قد تتطلب معدل جرعة أكبر، يجب تغيير حجم البقعة فقط؛ لا ينبغي تغيير حجم الحزمة لأن هذا يؤدي إلى إمالة الحزمة، مما يجعل الضبط غير صحيح. الخطوات 7.1.1 و 7.1.2 و 7.1.3 شبه مؤتمتة في هذا النص المتاح للجمهور (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).

8. إعداد المستكشف

  1. في SerialEM، افتح ملف الملاح الجديد المسمى _automaps.nav.
    ملاحظة: V_yyyy هي خرائط عرض P_yyyy هي خرائط المعاينة. يتم تعيين مخططات المعاينة كنقاط اكتساب.
  2. في إطار SerialEM Navigator، قم بإلغاء تحديد كافة النقاط A، وحدد أول خريطة V_yyyy، وحدد طي،وانقر على A مرتين، ثم قم بإلغاء تحديد طي.
  3. حدد موضع V_yyyy الأول، واضغط على Shift + T،ثم حدد آخر موضع V_yyyy، واضغط على Shift + T مرة أخرى.
  4. اختر صور إطار مفرد في خصائص الملف لفتح مربع الحوار.
  5. في مربع الحوار خصائص الملف التالي، حدد المعلمات المطلوبة وفقا لاحتياجات التصوير وإعداد الأداة.
  6. عند المطالبة، قم بإعطاء اسم برقم (على سبيل المثال، TS_001.mrc) وانقر على حفظ.
    ملاحظة: SerialEM تلقائيا ترقيم أسماء الملفات لكافة سلسلة الميل.
  7. قم بإعداد وحدة تحكم سلسلة الميل لأول موضع TS. عند الانتهاء، انقر فوق موافق لتعيين هذه المعلمات لجميع سلسلة الميل بعد هذا البند اقتناء. يتم الآن تحديد جميع خرائط المعاينة على أنها TS (سلسلة الميل) مع اسم الملف المرقم TS_xxx.mrc.
    ملاحظة: يمكن للمرء تغيير المعلمات يدويا لاحقا باستخدام ميزة TSparams المستكشف; سيتم تطبيق التغييرات على كافة العناصر لأسفل في القائمة. لدى المستخدم خيار تشغيل برنامج نصي مخصص بدلا من سلسلة الميل.

9. تعيين التركيز / المسار المواقف

  1. تعيين مسافة التركيز/المسار لكل هدف إذا لزم الأمر (تأكد من تشغيل الجرعة المنخفضة من SerialEM).
  2. انقر نقرا مزدوجا فوق خريطة عرض لتحميله.
  3. حدد معاينة الخريطة في قائمة المستكشف.
  4. حدد تحرير التركيز في إطار المستكشف.
  5. في لوحة التحكم بالجرعات المنخفضة، قم بإلغاء تحديد تدوير المحور بين المناطق لوضع التجربة والتركيز على طول محور إمالة المرحلة.
  6. انقر على المنطقة المطلوبة في خريطة العرض المحملة لتعيين موضع التركيز/التجربة لسلسلة الميل هذه.
  7. تأكد من أن العنصر المستكشف لديه مجموعة TSP الآن; كرر الإجراء لكافة العناصر.
    ملاحظة: يتم نسخ موضع التركيز/المسار تلقائيا إلى الأسفل في المستكشف. لذلك، إذا كان موضع التركيز/المسار للعنصر السابق على الجانب الصحيح والمسافة الصحيحة، فلا حاجة لتغييره للعنصر الحالي.

10. إعداد برامج نصية إضافية

  1. اثنين من البرامج النصية التعامل مع نطاق التركيز: pretomo و duringtomo. يتم تشغيل البرنامج النصي pretomo قبل كل سلسلة إمالة والسيناريو أثناء كل إمالة.
  2. تحرير نطاق التركيز في pretomoالبرنامج النصي .
  3. في القائمة سلسلة الميل SerialEM تحقق تشغيل البرنامج النصي في TS وحدد رقم البرنامج النصي للبرنامج النصي أثناء عملية.

11. تشغيل

  1. تحقق من مستوى خزان النيتروجين.
  2. تحقق ما إذا كان يتم تحديد توربو Autoloader إيقاف.
  3. تحقق من المساحة الحرة لتخزين البيانات.
  4. في القائمة ملف SerialEM إلغاء تحديد الحفظ المستمر لملف السجل وإغلاق أي ملف سجل مفتوح حاليا. ستحصل كل سلسلة إمالة على ملف السجل الخاص بها.
  5. في القائمة المستكشف، انقر على الحصول على في العناصر.
  6. تشغيل البرنامج النصي PreTomo.
  7. حدد المهمة الأساسية اكتساب سلسلة الإمالة.
  8. حدد تشغيل البرنامج النصي بعد PostTomo.
  9. حدد إغلاق صمامات العمود في النهاية.
  10. حدد إرسال بريد إلكتروني في النهاية.
  11. انقر على GO.
    ملاحظة: SerialEM سوف ترسل رسالة بريد إلكتروني لكل سلسلة إما ناجحة أو خطأ; خطأ يمكن، ومع ذلك، يعني أيضا لم يتم الوصول إلى نطاق الميل الكامل.

النتائج

وقد استخدم هذا الإجراء للحصول على سلسلة الميل Sars-Cov-2 الموصوفة في Turonova وآخرون. تم إنتاج مجموعة البيانات بأكملها باستخدام ثلاث شبكات متميزة على مدى ثلاث جلسات مجهرية في EMBL هايدلبرغ. وستركز الدراسة الحالية على أول دورة 3 أيام (~ 72 ساعة) وتصفها مع الشبكة الأولى.

بعد أن تم تعيين الشبكة بأكملها في التكبير منخفضة (~ 10 دقيقة، انظر الخطوة 2)، تم اختيار 71 المربعات المناسبة على خريطة الشبكة، وتم الحصول على خرائط التكبير المتوسطة(خرائط مربعة)مع إعدادات (التكبير، والتعرض، و defocus) التي تسمح للتصور المباشر وتحديد عينة من الفائدة، والفيروسات التاجية في هذه الحالة (انظر الخطوة 4) (الشكل 1A). وكان وقت الاستحواذ ~ 3 دقيقة لكل مربع ، 3 ساعة 45 دقيقة في المجموع.

بمجرد إنشاء الخريطة المربعة الأولى ، تم فتح مثيل SerialEM وهمية (دون أي تحكم على الكاميرا أو المجهر) على جهاز كمبيوتر منفصل لتصور الخريطة المربعة وإضافة نقاط على أهداف مناسبة لاكتساب سلسلة الميل (انظر الخطوة 5) (الشكل 1B). تم استرداد الخرائط المربعة المكتسبة حديثا عن طريق دمج متصفح SerialEM الوهمي الحالي مع الملاح من مثيل SerialEM المكتسب. بعد ~2 ساعة من اقتناء مربع الشبكة واختيارها، يمكن تحديد 50 هدفا أوليا.

بعد انتهاء عمليات اقتناء الخريطة المربعة، تم إعداد جرعة منخفضة من SerialEM وتم التقاط صور العرض والمعاينة المرجعية وحفظها كخرائط (انظر الخطوة 3). ويمكن بعد ذلك استخدام الخرائط الأخيرة على الفور على مثيل SerialEM وهمية لتوليد، من الصور المقابلة خريطة مربعة، وعرض الظاهري (الشكل 1C) والمعاينة الظاهرية (الشكل 1D) خرائط من الأهداف المحددة 50 مع مجموعة البرامج PyEM، لوقت المعالجة من ~ 30 دقيقة (انظر الخطوة 6). تم استخدام هذا الوقت في معالجة الدورة SerialEM وهمية لأداء الاستعدادات النهائية للمجهر للحصول على : ضبط مرشح الطاقة ، كاميرا جديدة اكتساب صورة مرجعية ، الاستجماتيزم ، ومحاذاة خالية من غيبوبة للعدسة الهدف.

وبمجرد الانتهاء من ضبط المجهر وإعداد خرائط افتراضية من الأهداف الأولية الخمسين، تم إعداد ملاح SerialEM الفعلي الذي سيتم استخدامه للاستحواذ (انظر الخطوة 8)، وتم تعيين موضع التركيز والمسار (الخطوة 9)، ويمكن بدء اكتساب سلسلة الميل (انظر الخطوتين 10 و11). تم استخدام خرائط العرض الافتراضي (الشكل 1C)للتوسيط الأولي للهدف (الشكل 1E) متبوعا بتوسيط نهائي تم إجراؤه في تكبير اكتساب سلسلة الميل الفعلي (الشكل 1F) باستخدام خريطة المعاينة الافتراضية (الشكل 1D).

بدءا من رسم خرائط الشبكة في الساعة 9:30 صباحا ، بدأ الحصول على سلسلة الميل للأهداف الأولية ال 50 في حوالي الساعة 15:00. مع الإعدادات المستخدمة للحصول على الطبوغرافية (انظر المرجع للحصول على التفاصيل) ، استغرق الحصول على سلسلة الميل ~ 20 دقيقة ، مع أهداف كافية ثم لتشغيلها طوال الليل. أثناء تشغيل عملية الاستحواذ ، يمكن فحص بقية الخرائط المربعة وإضافة المزيد من الأهداف ، التي لا تزال خارج الخط عبر مثيل SerialEM الوهمي. تم اختيار 121 هدفا آخر من بين الخرائط المربعة المتبقية وإضافتها إلى متصفح SerialEM بعد إنشاء خرائط افتراضية لهذه الأهداف الجديدة ، وهو ما يكفي لتشغيلها حتى الانتهاء من جلسة 72 ساعة.

سمح هذا الإجراء (الملخص في الشكل 2)، في يوم عمل واحد ، بإعداد 171 هدفا لعمليات الاستحواذ الطبوغرافي الآلي لجلسة مجهرية 72 ساعة (3 أيام).

figure-results-3582
الشكل 1: مثال الخريطة المربعة مع الخرائط الافتراضية التمثيلية وعمليات الاستحواذ المقابلة بعد التوسيط. (A)خريطة مربعة تمثيلية لشبكة CryoEM Sars-Cov-2 المستخدمة في Turonova وآخرون. تم وضع علامة على أربع مناطق ذات أهمية بصليب أحمر. تكبير المجهر هو 2250x. (ب) اقتصاص من الخريطة المربعة تمييز المناطق التي تم استخدامها لتوليد عرض الظاهري (البرتقالي) والمعاينة الظاهرية (الأصفر) خرائط للهدف المحدد (الصليب الأحمر) (ج) خريطة عرض الظاهري. (D) خريطة المعاينة الظاهرية. (E) الحصول على العرض الفعلي بعد التوسيط باستخدام خريطة العرض الافتراضي كمرجع. تكبير المجهر هو 11500x. (F) الحصول على الميل 0° من سلسلة الميل بعد توسيط باستخدام خريطة المعاينة الظاهرية كمرجع. تكبير المجهر هو 64،000x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4783
الشكل 2: سير عمل جلسة CryoET باستخدام SerialEM مع أدوات PyEM. الرجاء النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الرقم.

Discussion

من تقنية متخصصة، وقد نضجت الآن cryoET إلى طريقة واسعة النطاق لإجراء الدراسات الهيكلية على المستوى الخلوي والجزيئي مع قرار لم يسبق له مثيل يمكن الوصول إليها21،22. وقد وضع الطلب المتزايد باستمرار على التصوير cryoEM ضغطا على الموارد المحدودة المتاحة للوصول إلى هذه التكنولوجيا. وعلى الرغم من افتتاح عدد من مرافق التبريد الوطنية وجهود المعاهد العلمية لزيادة قدرتها على دعم احتياجات المجتمع في جميع أنحاء العالم، فإن إمكانية الوصول إلى أدوات التبريد لا تزال محدودة، وبالتالي يجب أن يستخدم المستخدمون الوقت المتاح لجمع البيانات بكفاءة لزيادة غلة كل دورة تصوير مصغر إلى أقصى حد. الحاجة إلى الحصول على مئات من سلسلة الميل جنبا إلى جنب مع الوقت المحدود المتاح لجمع البيانات ودعا إلى إجراءات جديدة لاكتساب الصور لتحقيق إنتاجية أفضل دون المساس بجودة البيانات. وقد زادت التطورات الأخيرة في الأجهزة والتصوير سير العمل إلى حد كبير سرعة اقتناء سلسلة الميل18،19، مما أدى إلى تحول كبير في النسبة بين الوقت الذي يقضيه لاقامة نقطة الاستحواذ والوقت اللازم لاكتساب سلسلة الميل الفعلي. وإجمالا، أصبح إجراء إنشاء نقاط الاستحواذ أحد الاختناقات الرئيسية لسرعة إنتاجية جلسات cryoET التي يمكن تحقيقها.

البروتوكول الأمثل المعروض هنا مكننا من إعداد 171 موقعا ، في وضع خارج الخط ، للحصول على الطبوغرافي الآلي خلال اليوم الأول من جلسة cryoET بينما كان المجهر منخرطا بنشاط في عمليات أخرى (على سبيل المثال ، رسم الخرائط المربعة ، وضبط ، والحصول على سلسلة الميل الآلي) ، وبالتالي دون التأثير على وقت المجهر المتاح لجمع البيانات. بالإضافة إلى زيادة الإنتاجية إلى أقصى حد من جلسة cryoET ، يقلل هذا الخط بشكل كبير من مقدار الوقت الذي استثمره المستخدم في المرحلة التحضيرية لجلسة جمع البيانات الآلية. في البروتوكول الموصوف، يطلب من المستخدم استعراض مربعات الشبكة المعينة لتحديد المناطق المناسبة ذات الاهتمام وإضافتها إلى Serial EM Navigator كنقاط اقتناء. سيتم بعد ذلك معالجة كافة الأهداف تلقائيا على دفعات داخل SerialEM بواسطة أداة PyEM لإنتاج الخرائط الظاهرية16. وبالتالي فإن النهج الحسابي المقدم أسرع بكثير من الحصول على خرائط تثبيت حقيقية من خلال القضاء على فترات الانتظار المرتبطة بحركة المرحلة ، واكتساب الصور ، وتغيير ظروف التصوير بين العرض والمعاينة ، وإعادة تأكيد هذه الخطوات في نهاية المطاف مع التمركز عند التكبير العالي. بالإضافة إلى ذلك ، حيث أن كل صورة مكتسبة تؤدي إلى تراكم جرعة الإلكترون على الكائن ذي الاهتمام23، فإن استخدام الخرائط الافتراضية لإعادة تنظيم الأهداف بدقة يقلل من الأضرار الإشعاعية التي أدخلت في المرحلة التحضيرية لجلسة cryoET قبل اكتساب سلسلة الميل الفعلي. يستخدم البروتوكول الموضح هنا الخرائط الافتراضية المتوسطة والتكبير العالية (المعاينة والعرض على التوالي) لإعادة تنظيم الهدف قبل الحصول على سلسلة الميل. يمكن تعديل هذا الإجراء بسهولة لاستخدام صورة عرض التكبير الوسيط فقط عندما تكون دقة المحاذاة أقل أهمية ، على سبيل المثال ، في حالة الهياكل الكبيرة حيث تكون دقة الهدف النهائي أقل قلقا10 أو لعينات تحليل الجسيمات الفردية التي تنتشر بشكل سيئ على شبكة التبريد التي تتطلب اختيار المستخدم اليدوي لكل نقطة اكتساب24، 25. وأخيرا، فإن اتباع نهج يقوم على الاستخدام غير الإلكتروني لمثيل تسلسلي وهمي ييسر أيضا إعداد نقاط الاقتناء عن طريق الاتصال عن بعد عن طريق تقليل الحاجة إلى الوجود المادي للمستخدم على المجهر، مما يتيح مزيدا من المرونة من حيث التنظيم التشغيلي للمرفق.

وقد أدى التقدم الأخير في التكنولوجيا وأساليب cryoET إلى تحسين سرعة وموثوقية جلسات جمع البيانات الآلية بشكل كبير. ومع ذلك، يلزم إجراء مزيد من التطورات لمعالجة الخطوات المتبقية التي تحد من معدل هذه الطريقة. وعلى الأخص، فإن الخطوة الأولية لرسم الخرائط الشبكية والمربعة أصبحت الآن واحدة من الاختناقات الرئيسية لإعداد الدورة، مما يولد الحاجة إلى تحسينات في الأجهزة تهدف إلى زيادة سرعة حركات مرحلة المجهر واكتساب الصور بواسطة كاشفات الإلكترون المباشرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وضع نهج للتعلم الآلي لأتمتة عملية تحديد الأهداف بالكامل سيكون أمرا حاسما للقضاء على الحاجة إلى التفتيش البصري للمستخدمين لاختيار المناطق ذات الاهتمام، وهو إجراء يستغرق وقتا طويلا ويعتمد على خبرة المستخدمين.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نعترف بالدعم المقدم من وحدة البيولوجيا الهيكلية والحسابية ومرفق المجهر الإلكتروني الأساسي في المختبر الأوروبي للبيولوجيا الجزيئية في هايدلبرغ، ألمانيا ومن iNEXT-Discovery (رقم المشروع 871037). نحن ممتنون للغاية للدعم الممتاز من مؤلف حزمة برامج SerialEM ، البروفيسور ديفيد ماسترونارد. كما نشكر هيرمان فونغ على القراءة النقدية للمخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Transmission Electron MicroscopeOur protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind

References

  1. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
  4. Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
  6. Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
  7. Briggs, J. A. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  8. Wan, W., Briggs, J. A. G. . Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
  9. Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
  10. Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
  11. Resch, G. P. . Methods in Cell Biology. 152, 135-178 (2019).
  12. Bharat, T. A., Kukulski, W. . Correlative Imaging: Focusing on the Future. , 137-153 (2019).
  13. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  14. O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. . Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
  15. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  16. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
  17. Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
  18. Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
  19. Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
  20. Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
  21. O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
  22. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
  23. Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
  24. Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
  25. Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169 PyEM SerialEM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved