الحصاد والتصنيف: خطوة مهملة في أبحاث أساليب البيوفيلم

Summary

تفصل هذه الورقة الطرق التي توضح ثلاث تقنيات شائعة لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها على نوعين من الأسطح ، واختبار الصلابة لطريقة الحصاد والحد الأدنى من المعلومات التي يجب مراعاتها عند اختيار وتحسين تقنيات الحصاد والتصنيف لزيادة قابلية التكاثر.

Abstract

تتكون طرق البيوفيلم من أربع خطوات متميزة: زراعة البيوفيلم في نموذج ذي صلة ، ومعالجة البيوفيلم الناضج ، وحصاد البيوفيلم من السطح وتصنيف الكتل ، وتحليل العينة. من بين الخطوات الأربع ، يعد الحصاد والتصنيف الأقل دراسة ولكنه مع ذلك حاسم عند النظر في إمكانية التحيز في الاختبار. توضح هذه المقالة تقنيات الحصاد والتصنيف الشائعة الاستخدام للأغشية الحيوية المزروعة على ثلاثة أسطح مختلفة. وتشمل تقنيات حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية الثلاثة، المستقاة من مراجعة واسعة النطاق للأدبيات، الدوامة والصوتنة، والكشط والتجانس، والكشط والدوامة والصوتنة. يتم النظر في نوعين من الأسطح: الصلبة غير المسامية (زجاج البولي والبورسليكات) والمسامية (السيليكون). بالإضافة إلى ذلك ، نقدم توصيات للحد الأدنى من المعلومات التي يجب تضمينها عند الإبلاغ عن تقنية الحصاد المتبعة وطريقة مصاحبة للتحقق من التحيز.

Introduction

وقد تطور تعريف الأغشية الحيوية على مدى العقود القليلة الماضية ويشمل الارتباط الميكروبي مع مجموعة متنوعة من الأسطح البيولوجية و/أو غير البيولوجية، وإدراج المكونات غير ^{الخلوية1} التي تظهر نموا مختلفا وتعبيرا ^جينيا2 داخل مصفوفة. يوفر البيوفيلم الحماية من الضغوط البيئية مثل التجفيف وقد يجعل عمل المطهرات الكيميائية أقل فعالية مما يؤدي إلى بقاء الميكروبات. يمكن للناجين داخل الفيلم الحيوي أن يوفروا مصدرا للكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض التي تشكل مصدر قلق للصحة ^{العامة3}.

تتكون طرق الأغشية الحيوية من أربع خطوات ، النمو ، العلاج ، أخذ العينات (الحصاد والتصنيف) ، والتحليل. النمو ، الخطوة الأولى ، حيث يحدد المستخدم ظروف نمو الكائن الحي ، ودرجة الحرارة ، والوسائط ، وما إلى ذلك ، هو الأكثر مراعاة والإبلاغ عنه في أدبيات البيوفيلم4،^5،6،7. تقوم خطوة العلاج بتقييم مضادات الميكروبات (مثل المطهرات) لتحديد فعاليتها إما ضد الأغشية الحيوية الناضجة3،^8،9 أو يمكن دمج مضادات الميكروبات في السطح لتحديد قدرة المنتج على منع أو تقليل نمو الأغشية ^{الحيوية10}. تتضمن الخطوة الثالثة ، أخذ العينات ، خطوات لحصاد البيوفيلم من السطح الذي كان ينمو عليه وتصنيف الكتل التي تمت ^{إزالتها3،8،11}. قد تتضمن الخطوة الرابعة ، التحليل ، تعداد الخلايا القابلة للحياة ، والفحص المجهري ، وقياسات التألق ، والنتائج الجزيئية ، و / أو تقييم مكون ^{المصفوفة8,9}. يوفر تقييم البيانات معلومات حول نتائج التجربة. ومن بين الخطوات الأربعة، غالبا ما يكون أخذ العينات هو الخطوة الأكثر تجاهلا لأنه يفترض أن تقنية حصاد الأغشية الحيوية المختارة و/أو تصنيفها فعالة بنسبة 100٪، وغالبا ما تكون دون ^تحقق11.

تتطلب المعلقات العوالق للبكتيريا ، التي غالبا ما تعتبر متجانسة ، دوامة بسيطة قبل التحليل. ومع ذلك، فإن الأغشية الحيوية هي مجتمعات معقدة تتكون من الكائنات الحية الدقيقة (بدائية النواة و/أو حقيقية النواة)، والسكريات الخارجية، والبروتينات، والدهون، والحمض النووي خارج الخلية، والخلايا ^{المضيفة12}. هناك حاجة إلى خطوات تتجاوز طرق الاستزراع الميكروبيولوجي التقليدية للعوالق من أجل حصاد الأغشية الحيوية بشكل كاف من سطح ما ثم تقسيمها إلى تعليق متجانس للخلية الواحدة. أظهر استعراض واسع النطاق للأدبيات (معلومات غير مدرجة في هذا المنشور) أن اختيار تقنية الإزالة والتصنيف يعتمد على عدد من العوامل ، بما في ذلك الأنواع الموجودة في البيوفيلم ، والسطح الذي يرتبط به البيوفيلم (غير مسامي أو مسامي) ، وإمكانية الوصول إلى أسطح النمو (قسيمة قابلة للإزالة بسهولة أو تدمير مادي للجهاز الذي ينمو فيه البيوفيلم) ، هندسة السطح (المساحة والشكل) ، وكثافة الأغشية الحيوية على أسطح النمو ، والمعدات المختبرية المتاحة.

عندما يتم حصاد البيوفيلم من سطح ، يكون تعليق الخلية الناتج غير متجانس. وإذا أريد تعداد هذا التعليق غير المنتظم بدقة، فيجب تصنيفه إلى خلايا فردية. تفترض أعداد الصفائح القابلة للحياة أن وحدة تشكيل المستعمرة تنشأ من بكتيريا واحدة. إذا تم وضع مجاميع من البيوفيلم على وسط النمو ، فمن المستحيل التمييز بين الخلايا الفردية التي يمكن أن تؤدي إلى تقديرات غير دقيقة. على سبيل المثال ، أثناء اختبار فعالية المطهر ، إذا كان العلاج يزيل الأغشية الحيوية بشكل فعال للغاية من سطح مقارنة بالتحكم ، فقد يظهر تقليل السجل كبيرا بشكل مصطنع مقارنة بالتحكم. من ناحية أخرى، يبدو أن المطهر الكيميائي الذي يثبت الأغشية الحيوية على سطح مقارنة بعنصر التحكم لديه انخفاض أقل في ^السجل11. يمكن أن يؤدي هذا النوع من السيناريوهات إلى تفسير متحيز للبيانات التجريبية.

واستعدادا للنشر، خلص استعراض للأدبيات إلى أن النهج الشائعة لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها تشمل الكشط أو المسح أو الصوتنة أو الدوامة أو مزيج من هذه النهج. يعرف الكشط بأنه الإزالة الفيزيائية للفيلم الحيوي من الأسطح باستخدام عصا معقمة أو ملعقة أو أداة أخرى. يشير المسح إلى إزالة البيوفيلم من الأسطح باستخدام عصا قطنية مائلة أو غيرها من المواد الماصة الثابتة. يشير الصوتنة إلى تعطيل الأغشية الحيوية من الأسطح عبر الموجات فوق الصوتية الموزعة عبر الماء. يشير الدوامة إلى استخدام خلاط لتحقيق دوامة سائلة للعينة داخل أنبوب. يستخدم التجانس شفرات دوارة لقص كتل الأغشية الحيوية التي يتم حصادها في تعليق خلية واحدة. في هذه الورقة ، نقدم ثلاث طرق للحصاد والتصنيف لنوعين مختلفين من الأسطح ، صلبة / غير مسامية ومسامية.

يتم توفير قائمة بالحد الأدنى من المعلومات الموصى بها التي يجب على الباحثين تضمينها في أقسام الأساليب في المنشورات. نأمل أن يؤدي تضمين هذه المعلومات إلى تمكين الباحثين الآخرين من إعادة إنتاج عملهم. لا توجد طريقة مثالية للحصاد والتصنيف ، لذلك ، يتم أيضا تقديم توصيات حول كيفية التحقق من هذه التقنية.

يتم توضيح ثلاث طرق شائعة لحصاد وتصنيف الأغشية الحيوية من أسطح النمو الشائعة في هذه المقالة. ستمكن هذه المعلومات الباحثين من فهم الدقة والتحيز بشكل عام لطريقة اختبار الأغشية الحيوية بشكل أفضل. الطرق الموصوفة هي كما يلي: (1) يتم حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية Pseudomonas aeruginosa المزروعة على كوبونات البولي كربونات (سطح صلب غير مسامي) تحت قص عالي السوائل في مفاعل البيوفيلم CDC وتصنيفها بعد مزيج من خمس خطوات من الدوامة والصوتنة لتحقيق حصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها (2) A P. aeruginosa يتم حصاد الأغشية الحيوية المزروعة على كوبونات زجاجية البورسليكات (سطح صلب غير مسامي) في مفاعل التدفق بالتنقيط تحت قص منخفض السوائل وتصنيفها باستخدام الكشط والتجانس (3) يتم حصاد الأغشية الحيوية الإشريكية القولونية المزروعة في أنابيب السيليكون (سطح مسامي) وتصنيفها باستخدام الكشط ، تليها الصوتنة والدوامة.

Protocol

1. دوامة وصوتنة

1. تنمو ناضجة P. aeruginosa ATCC 15442 البيوفيلم نمت وفقا لمعيار ASTM E25622.
2. في نهاية فترة النمو 48 ساعة ، استعد لمعالجة البيوفيلم وكوبونات العينات وفقا لمعيار ASTM E28718
3. أدخل واقيات رذاذ معقمة معقمة في أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مل باستخدام ملقط معقم باللهب. كرر ذلك لجميع الأنابيب التي ستتلقى العلاج. لا تحتاج أنابيب كوبونات التحكم إلى واقي من الرذاذ.
4. قم بإزالة قضيب تم اختياره عشوائيا من مفاعل البيوفيلم CDC بشكل معقم. شطف كوبونات لإزالة الخلايا المرفقة بشكل فضفاض عن طريق غمس القضيب بلطف في 30 مل من الماء المخزن مؤقتا المعقم.
5. أمسك القضيب بالتوازي مع سطح المقعد ، فوق أنبوب مخروطي فارغ ومعقم بسعة 50 مل وباستخدام وجع ألين معقم باللهب ، قم بفك المسمار لإسقاط قسيمة مغلفة بالأغشية الحيوية في أنبوب. كرر ذلك للعدد المطلوب من القسائم. قم بإزالة واقيات الرذاذ وضعها في حاوية منفصلة للتعقيم.
6. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، قم ببطء بماصة 4 مل من المعالجة أو التحكم في الأنابيب بحيث يتدفق السائل إلى داخل جدار الأنبوب.
7. اضغط برفق على الجزء السفلي من الأنبوب بحيث يتم تشريد أي فقاعات هواء أسفل القسيمة. اسمح ب 30 - 60 ثانية بين كل إضافة.
8. في نهاية وقت التلامس المحدد ، قم بماصة 36 مل من المعادل في الأنابيب بنفس الترتيب الذي تم به تطبيق العلاج (أو التحكم).
   ملاحظة: الحجم النهائي للمعالجة المدمجة والمحايد مهم لتحديد كثافة سجل الأغشية الحيوية بدقة.
9. دوامة كل أنبوب على أعلى إعداد لمدة 30 ± 5 ثانية. تأكد من تحقيق دوامة كاملة.
   ملاحظة: يجب توخي الحذر عند دوامة القسائم الثقيلة مثل الفولاذ المقاوم للصدأ في قوارير زجاجية حيث يمكن أن يحدث كسر.
10. حدد العدد الأمثل للأنابيب لكل حمام ووضعها داخل رف أنبوب الاختبار قبل معالجة العينات الفعلية. في حالة معالجة عينات متعددة ، تأكد من أن درجة حرارة الماء في حمام الصوتنة هي 21 ± 2 ^درجة مئوية.
11. ضع الأنابيب في رف الأنبوب معلقا في سونيكتور منزوع الغاز بحيث يكون مستوى الماء في الحمام مساويا لمستوى السائل في الأنابيب. سونيكات عند 45 كيلو هرتز ، طاقة 100٪ ووظيفة عادية لمدة 30 ± 5 ثوان. كرر دورات الدوامة والصوتنة ثم تنتهي بدوامة نهائية (إجمالي 5 دورات).
    ملاحظة: هذه الأنابيب مع البيوفيلم المحصود والمفصل هي التخفيف ¹⁰⁰ أو 0.
12. عينة مخففة بشكل متسلسل في الماء العازل. لوحة على R2A أجار باستخدام طريقة الطلاء المناسبة. احتضان في 36 ± 2 ^درجة مئوية لمدة 24 ساعة. عد المستعمرات حسب الاقتضاء لطريقة الطلاء المستخدمة وتسجيل البيانات.

2. كشط وتجانس

1. تنمو البيوفيلم الناضج P. aeruginosa ATCC 15442 وفقا لمعيار ASTM E264713.
2. قم بإعداد محطة أخذ العينات لتشمل لوحة أخذ العينات ، والإيثانول بنسبة 95٪ في الكأس ، وموقد الكحول ، ومرقئ الدم ، وأداة إزالة القسيمة ، والأكواب مع مياه تخفيف معقمة وأنابيب تخفيف لشطف القسائم.
3. أوقف تشغيل المضخة. قم بإزالة غطاء القناة واستخدم أداة إزالة قسيمة معقمة ومرقئ لإزالة القسيمة ، مع الحرص على عدم إزعاج البيوفيلم.
4. شطف القسيمة عن طريق الغمر بلطف ، مع حركة سائلة ، في 45 مل من ماء التخفيف المعقم (الموجود في أنبوب طرد مركزي 50 مل). عكس الحركة على الفور لإزالة القسيمة.
5. ضع القسيمة في كوب يحتوي على 45 مل من ماء التخفيف المعقم. كشط سطح القسيمة المغطى بالبيوفيلم في اتجاه هبوطي لمدة 15 ثانية تقريبا ، باستخدام ملعقة معقمة أو مكشطة. شطف ملعقة أو مكشطة عن طريق تحريكها في دورق. كرر عملية الكشط والشطف 3-4 مرات ، مما يضمن التغطية الكاملة لسطح القسيمة.
6. شطف القسيمة عن طريق الاحتفاظ بها بزاوية 60 درجة فوق الكأس المعقمة وسحب 1 مل من ماء التخفيف المعقم على سطح القسيمة. كرر ذلك لما مجموعه 5 شطف. الحجم النهائي في الكأس هو 50 مل.
   ملاحظة: الحجم النهائي للمعالجة المدمجة والمحايد مهم لتحديد كثافة سجل الأغشية الحيوية بدقة.
7. استبدل كل غطاء قناة عند إزالة القسائم.
8. العمل في خزانة السلامة الأحيائية ، تجانس عينة الأغشية الحيوية المكشطة. قم بتوصيل مسبار مجانس معقم بالمجانس ، وضع طرف المسبار في السائل ، قم بتشغيل المجانس وتسلق ما يصل إلى 20500 دورة في الدقيقة.
9. تجانس العينة لمدة 30 ثانية. قم بإيقاف تشغيل RPMs وقم بإيقاف تشغيل المجانس.
10. قم بتعقيم المسبار بين عينات الأغشية الحيوية عن طريق تجانس 9 مل من التخفيف المعقم الفارغ عند 20500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية كما هو موضح أعلاه. تجانس أنبوب 9 مل من الإيثانول 70 ٪ لمدة 30 ثانية ، وفصل المسبار والسماح للوقوف في أنبوب الإيثانول لمدة 1 دقيقة. تجانس فراغين إضافيين للتخفيف.
    ملاحظة: يمكن استخدام مسبار مجانس يمكن التخلص منه لكل عينة.
11. قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل في الماء العازل. لوحة على R2A أجار باستخدام طريقة الطلاء المناسبة. احتضان الصفائح عند 36 ± 2 ^درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، وعد المستعمرات حسب الاقتضاء لطريقة الطلاء المستخدمة وتسجيل البيانات.

3. كشط ، دوامة وصوتنة

1. تنمو الإشريكية القولونية ATCC 53498 البيوفيلم ناضجة في أنابيب قسطرة ^{السيليكون10}.
2. تحضير مواد أخذ العينات: أنابيب الشطف ، أنبوب الطرد المركزي المعقم ، طبق بتري المعقم الفارغ ، مرقئ ومقص من الفولاذ المقاوم للصدأ معقم باللهب ، مؤقت ، ومسطرة.
3. مع إيقاف المضخة مؤقتا ، استخدم 70٪ من الإيثانول لتنظيف الجزء الخارجي من الأنابيب. قم بقياس 2 سم من النهاية ، وتجنب المنطقة المتصلة بالموصل ، ووضع علامة على الأنبوب لتحديد مواقع القطع.
4. باستخدام مقص معقم باللهب ، اقطع الأنبوب على علامة 2 سم وضع الجزء في طبق بتري معقم فارغ. امسح الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول وأعد توصيل الطرف البعيد بأنابيب النفايات.
5. شطف جزء الأنابيب لإزالة الخلايا العوالق. باستخدام ملقط معقم باللهب ، اغمر مقطع الأنابيب بلطف في 20 مل من ماء التخفيف المعقم ثم قم بإزالته على الفور. ضع الجزء في 10 مل من المحايد.
6. باستخدام ملقط معقم باللهب ، أمسك جزء الأنابيب وكشطه بعصا قضيب خشبية معقمة حتى يتم كشط جميع المناطق الداخلية للأنابيب. في بعض الأحيان شطف العصا في 10 مل من المعادل ووضع الجزء مرة أخرى في أنبوب العينة. جزء الأنابيب المكشطة هو التخفيف ¹⁰⁰ أو 0.
   ملاحظة: الحجم النهائي للمعالجة المدمجة والمحايد مهم لتحديد كثافة سجل الأغشية الحيوية بدقة.
7. دوامة كل أنبوب على أعلى إعداد لمدة 30 ± 5 ثانية. ضع الأنبوب في رف الأنبوب المعلق في سونيكتور بحيث يكون مستوى الماء في الحمام مساويا لمستوى السائل في الأنابيب. سونيكات عند 45 كيلو هرتز ، طاقة 100٪ ووظيفة عادية لمدة 30 ± 5 ثوان. كرر دورات الدوامة والصوتنة ثم تنتهي بدوامة نهائية.
   ملاحظة: هذا الأنبوب مع البيوفيلم المحصود والمفصل هو التخفيف ¹⁰⁰ .
8. قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل في الماء العازل. لوحة على تريبتيك الصويا أجار باستخدام طريقة الطلاء المناسبة.
9. احتضان الألواح عند 36 ± 2 ^درجة مئوية لمدة 24 ساعة. عد المستعمرات حسب الاقتضاء لطريقة الطلاء المستخدمة ، وتسجيل البيانات وحساب المتوسط الحسابي.

النتائج

التحقق من صحة / تأكيد طريقة الحصاد
فحصت العديد من الدراسات التي أجريت في مختبرنا قدرة الدوامة والصوتنة على حصاد الأغشية الحيوية المزروعة في مفاعل الأغشية الحيوية (ASTM E2562)² بشكل فعال باستخدام طريقة الأنبوب الواحد (ASTM E2871)⁸.

تم زراعة البيو?...

Discussion

الحد الأدنى من المعلومات لطرق الحصاد والتصنيف
لإنشاء بيانات بيوفيلم قابلة للتكرار عبر المجتمع العلمي ، من الضروري أن يدرج المؤلفون أكبر قدر ممكن من التفاصيل فيما يتعلق بكل خطوة من خطوات النمو والمعالجة وأخذ العينات والتحليل لطريقة البيوفيلم. وقد ساعد توحيد أساليب البيوفيلم ف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506