ديناميات تشكيل الصفائح الدموية من الفأر نخاع العظم الطازج Explants

Summary

هنا، ونحن بالتفصيل طريقة explant نخاع العظم، من إعداد العينة لتحليل الشريحة المجهرية، لتقييم قدرة megakaryocytes التي تمايزت في بيئتها الفسيولوجية لتشكيل الصفائح.

Abstract

المرحلة الأخيرة من megakaryopoiesis يؤدي إلى ملحقات السيتوبلازمية من megakaryocytes ناضجة، ما يسمى proplatelets. وقد تم تعلم الكثير عن تشكيل البربليتليت باستخدام في المختبر- megakaryocytes المتمايزة؛ ومع ذلك ، هناك أدلة متزايدة على أن نظم الثقافة التقليدية لا تلخص بأمانة عملية التمايز / النضج التي تأخذ أماكن داخل نخاع العظام. في هذه المخطوطة، نقدم طريقة تفسيرية وصفها في البداية في عام 1956 من قبل ثيري وسيس لتصور الخلايا الضخمة التي نضجت في بيئتها الأصلية، وبالتالي التحايل على القطع الأثرية المحتملة والتفسيرات الخاطئة. يتم جمع نخاع العظم الطازج عن طريق مسح عظم الفخذ من الفئران، وشرائح إلى أقسام عرضية 0.5 ملم، ووضعها في غرفة حضانة في 37 درجة مئوية تحتوي على عازل الفسيولوجية. تصبح الخلايا الضخمة مرئية تدريجيا في المحيط المكشوف ويتم ملاحظتها حتى 6 ساعات تحت مجهر مقلوب إلى جانب كاميرا فيديو. مع مرور الوقت ، تغير الخلايا الضخمة شكلها ، مع بعض الخلايا التي لها شكل كروي والبعض الآخر تطوير ملحقات سميكة أو تمديد العديد من الصفائح الرفيعة مع تفريع واسع النطاق. وتجرى تحقيقات نوعية وكمية على السواء. هذه الطريقة لديها ميزة كونها بسيطة، استنساخها، وبسرعة كما megakaryocytes عديدة موجودة، وكلاسيكيا نصفها شكل proplatelets في 6 ساعات مقارنة مع 4 أيام لmegakaryocytes الماوس المثقف. بالإضافة إلى دراسة الفئران المتحولة ، فإن التطبيق المثير للاهتمام لهذه الطريقة هو التقييم المباشر للعوامل الدوائية على عملية تمديد الصفائح الدموية ، دون التدخل في عملية التمايز التي قد تحدث في الثقافات.

Introduction

تم تطوير تقنية explant نخاع العظم لأول مرة من قبل ثيري واسيس في عام 1956 لوصف تشكيل ملحقات السيتوبلازمية megakaryocyte الفئران كحدث أولي في تشكيل الصفائح الدموية¹. باستخدام النقيض من المرحلة والتقنيات السينمائية ، وصف هؤلاء المؤلفون تحويل الخلايا الضخمة المستديرة الناضجة إلى خلايا خثارية "تشبه الحبار" مع ملحقات السيتوبلازمية التي تظهر حركات ديناميكية للاستطالة والانكماش. تصبح هذه الأسلحة أرق تدريجيا حتى تصبح شكل خيوط مع تورمات صغيرة على طول الذراعين وعلى النصائح. هذه الاستطالات megakaryocyte نموذجية، التي تم الحصول عليها في المختبر وفي وسائل الإعلام السائلة، لديها بعض أوجه التشابه مع الصفائح الدموية لوحظ في نخاع العظام الثابتة، حيث megakaryocytes تبرز امتدادات طويلة من خلال الجدران sinusoid في الدورة الدموية^2،3. اكتشاف والاستنساخ من TPO في عام 1994، سمح للتمييز بين megakaryocytes في الثقافة قادرة على تشكيل ملحقات proplatelet تشبه تلك الموصوفة في نخاع العظم explants^4،5،6. ومع ذلك ، فإن نضوج megakaryocyte أقل كفاءة بكثير في ظروف الثقافة ، ولا سيما شبكة الأغشية الداخلية الواسعة من خلايا العظم الضخمة الناضجة المتخلفة في الخلايا الضخمة المستزرعة ، مما يعيق الدراسات على آليات التكوين الحيوي للصفائح الدموية^7،8.

نحن بالتفصيل هنا نموذج explant نخاع العظم، استنادا إلى ثيري واسيس، لمتابعة في الوقت الحقيقي تشكيل proplatelet من الخلايا العملاقة الماوس، والتي نضجت تماما في بيئتها الأصلية، وبالتالي التحايل على القطع الأثرية في المختبر ممكن وسوء التفسير. يتم تقديم النتائج التي تم الحصول عليها في الفئران البالغة البرية لتوضيح قدرة الخلايا العملاقة على تمديد الصفائح ، ومورفولوجياها وتعقيد الصفائح. كما نقدم استراتيجية قياس سريع للتحقق من الجودة لضمان دقة البيانات ومتانتها خلال عملية تسجيل الخلايا الضخمة. البروتوكول المعروض هنا هو أحدث إصدار من الأسلوب المنشور كفصل كتاب سابقا⁹.

Protocol

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمعايير الأوروبية 2010/63/EU ولجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. إعداد الكواشف

1. إعداد الكواشف كما هو موضح في الجدول 1.
   1. للسهم I، حل كل مسحوق على حدة. تأكد من أن osmolarity من إعداد أعلى من 295 mOsm / L. يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية لمدة عام واحد.
   2. لإعداد العازلة التيرود، وجعل الحل كما هو موضح في الجدول 1،وضبط حجم إلى 100 مل مع الماء المقطر وإضافة 0.1 غرام D اللامائية (+) السكروز. ضبط إلى درجة الحموضة 7.3 باستخدام 1 N HCl حسب الحاجة و osmolarity إلى 295 mOsm/L. لمنع نمو البكتيريا، أضف البنسلين G بتركيز نهائي 10 U/mL وكبريتات الستريبتومايسين عند تركيز نهائي 0.29 ملغم/مل. تصفية الحل النهائي من خلال المسام 0.22 ميكرومتر.

2. إعداد الإعداد التجريبي

1. في يوم التجربة، قم بتسخين المخزن المؤقت للتيرود عند 37 درجة مئوية، ثم قم بتشغيل غرفة تسخين المجهر لرفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
2. إعداد جميع الأدوات اللازمة، مثل جهاز توقيت، غرف الحضانة، 5 مسيل للمحاقن، 21 G، ملقط، شفرة الحلاقة، ماصة باستور، الشرائح الزجاجية، و15 مل أنبوب الطرد المركزي (الشكل 1A).

3. عزل نخاع عظم الفأر

1. القتل الرحيم C57BL/6 الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا عن طريق الاختناق CO₂ وخلع عنق الرحم. وينبغي أن يتم ذلك بسرعة من قبل شخص مؤهل ومؤهل.
2. لتجنب التلوث الميكروبي، انقع جسم الفأر في الإيثانول بنسبة 70٪ (v/v) قبل إزالة عظم الفخذ. استخدام أدوات تطهيرها في الإيثانول 70٪ للتشريح. جمع عظم الفخذين وتنظيفها عن طريق إزالة أي الأنسجة الملتصقة. بعد الغمر السريع في الإيثانول، وضعها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على العازلة 2 مل ترود.
3. قطع epiphyses باستخدام شفرة حلاقة حادة وتدفق نخاع العظام باستخدام حقنة 5 مل مليئة 2 مل Tyrdode العازلة. لتحقيق ذلك، أدخل إبرة 21 G في فتح عظم الفخذ (على جانب الركبة) واضغط ببطء المكبس لاسترداد اسطوانة نخاع سليمة (الشكل 1B، C). حافظ على جلسة جمع النخاع قصيرة قدر الإمكان (أقل من 10 دقائق).

4. قسم نخاع العظم ووضعها في غرفة الحضانة

1. استخدام ماصة بلاستيكية 3 مل لنقل بعناية وبلطف نخاع العظام سليمة على شريحة زجاجية. من المهم أن يتم تغطية العينات مع العازلة لمنع تجفيف (الشكل 1D).
   ملاحظة: تجنب تدفق إعادة التدفق لتقليل المقصات التي يمكن أن ينفصم الأنسجة.
2. تحت مجسم (10x)، قطع نهايات النخاع التي قد تكون مضغوطة في وقت تدفق. ثم قطع المقاطع العرضية مع شفرة حلاقة حادة. يجب أن تكون المقاطع رقيقة بما يكفي للسماح بمراقبة مفصلة ولكن تأكد من عدم تلف الخلايا الضخمة بسبب الضغط (سمك عادة حوالي 0.5 مم) (الشكل 1E، F).
   ملاحظة: يتم إجراء المقاطع مع شفرة حلاقة حادة وتحت مكبر لضبط سمكها إلى حوالي 0.5 ملم. يتم تحديد فقط أقسام سمك موحد. هذا الإجراء ليس معقدا ولكن توحيده يتطلب بعض الخبرة.
3. باستخدام ماصة بلاستيكية، وجمع 10 أقسام في أنبوب 1 مل تحتوي على العازلة التيرود(الشكل 1G).
4. نقل بعناية أقسام إلى غرفة حضانة بقطر 13 ملم (الشكل 1H).
5. يستنشق المخزن المؤقت وضبط حجم إلى 30 ميكرولتر من العازلة التيرود تكملها مع 5 ٪ مصل الماوس.
   ملاحظة: في هذه المرحلة يمكن إضافة عوامل دوائية لتقييم تأثيرها على تكوين البربليتليه.
6. ضع المقاطع على مسافة. ختم غرفة ذاتية اللصق مع غطاء من البعد 22 × 55 ملم. المنحدر غطاء بينما التمسك لتجنب تشكيل فقاعات الهواء (الشكل 1I).
7. ضع الغرفة في غرفة التدفئة عند 37 درجة مئوية. من هذه اللحظة، يتم بدء الكرونومتر (T = 0 ساعة). تعمل التجربة لمدة 6 ساعة عند 37 درجة مئوية (T = 6 ساعة).

5. المراقبة في الوقت الحقيقي من explants النخاع

1. استخدام المجهر النقيض المرحلة مقلوب (عدسة 40x للتكبير) إلى جانب كاميرا فيديو لمراقبة explants نخاع العظم. دع الخلايا تحتضن لمدة 30 دقيقة قبل بدء الملاحظة. أثناء المراقبة ، من الضروري ضبط التركيز لأن الخلايا الضخمة تتحرك.
   ملاحظة: أوضاع مراقبة أخرى ممكنة (على سبيل المثال، DIC، الفلورسينس باستخدام الفئران التي تعبر خلاياها الضخمة عن علامة فلورية داخلية)، ولكن المجهر التبايني للمرحلة هو الأمثل لتصور ملحقات megakaryocyte الطويلة والرقيقة بوضوح، مما يسمح بالتحديد الكمي الدقيق. بعد 30 دقيقة ، تهاجر خلايا النخاع تدريجيا إلى محيط الإكسبلانت ، وتشكل طبقة أحادية. بعد 1 ساعة من الحضانة ، يمكن تحديد الخلايا الضخمة بحجمها الكبير ونوى متعددة الأضلاع(الشكل 1J، K). بعد 3 ساعة من الحضانة ، يزداد عدد الخلايا الضخمة وبعضها له امتدادات طويلة.
2. جعل أشرطة الفيديو لتسجيل التحول من الخلايا الضخمة.

6. القياس الكمي للخلايا الضخمة الممتدة من الصفيحات

1. رسم خريطة لترجمة كل قسم في غرفة الحضانة (الشكل 1K).
2. بعد ساعة واحدة، حدد الخلايا الضخمة المرئية (أي الخلايا العملاقة متعددة الأضلاع) على محيط كل قسم ورسم مواقعها على الرسم. كرر هذا الإجراء بعد 3 و 6 ساعة.
   ملاحظة: على أساس الرسم، يمكن تحديد موقع كل megakaryocyte بسهولة مع مرور الوقت وتطور مورفولوجيا تحليلها (على سبيل المثال، حجم، تشوه، تمديد اللوحة، الخ). وثمة احتمال آخر هو استخدام برنامج ملاحة محدد.

النتائج

النتائج النوعية. في بداية التجربة، يتم ضغط جميع الخلايا في قسم نخاع العظم. يستغرق 30 دقيقة للخلايا لتصبح مرئية بوضوح على هامش explants. ثم يمكن التعرف على الخلايا الضخمة من خلال حجمها الكبير ويمكن بعد ذلك دراسة تطورها مع مرور الوقت (الحجم والشكل والديناميكية وتمديد الصفائح الدموية وإط...

Discussion

هنا نحن نصف طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة في المختبر لتقييم كفاءة الخلايا الضخمة لتوسيع الصفائح التي نمت في نخاع العظام. نموذج نخاع العظم explant للفأر لديه أربع مزايا رئيسية. أولا، لا توجد مهارات تقنية متقدمة مطلوبة. ثانيا، الوقت اللازم للحصول على صفائح عملاقة تمتد كريات الدم قصيرة جدا، ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270