Megakaryocyte الثقافة في هيدروجيل 3D ميثيلسليلوز القائم على تحسين نضوج الخلايا ودراسة تأثير تصلب والحبس

Summary

ومن المسلم به الآن أن البيئة ثلاثية الأبعاد للخلايا يمكن أن تلعب دورا هاما في سلوكها، والنضج و / أو التمايز. يصف هذا البروتوكول نموذج ثقافة الخلايا ثلاثي الأبعاد المصمم لدراسة تأثير الاحتواء المادي والقيود الميكانيكية على الخلايا العملاقة.

Abstract

البيئة ثلاثية الأبعاد التي تؤدي إلى كل من الحبس والقيود الميكانيكية معترف بها بشكل متزايد كمحدد مهم لسلوك الخلية. وهكذا تم تطوير الثقافة ثلاثية الأبعاد للتعامل بشكل أفضل مع الوضع في الجسم الحي. تفرق الخلايا الميغاكارية عن الخلايا الجذعية والذرية الدموية (HSPCs) في نخاع العظام (BM). وBM هي واحدة من أنعم الأنسجة في الجسم، محصورة داخل العظام. العظام يجري توسيعها بشكل سيئ على مقياس الخلية، تتعرض الخلايا الضخمة في الوقت المناسب إلى تصلب ضعيف والحبس عالية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لاستعادة نسب الماوس السلبية (لين) HSPCs عن طريق الفرز المناعي المغناطيسي وتمايزها إلى خلايا عملاقة ناضجة في وسط ثلاثي الأبعاد يتكون من الميثيلسليلوز. Methylcellulose غير تفاعلي تجاه الخلايا الضخمة ويمكن تعديل صلابته مع نخاع العظم الطبيعي أو زيادته لمحاكاة نخاع ليفي مرضي. كما تم تفصيل عملية استعادة الخلايا الضخمة لإجراء المزيد من التحليلات الخلوية في البروتوكول. على الرغم من أن يتم منع تمديد البروبليت داخل الوسط 3D، ويرد وصفه أدناه كيفية إعادة إنفاق الخلايا الضخمة في المتوسط السائل وتحديد قدرتها على تمديد proplatelets. ميغاكاريوسيوسيتيز نمت في هيدروجيل 3D لديها قدرة أعلى على تشكيل الصفائح مقارنة بتلك التي تزرع في بيئة سائلة. تسمح هذه الثقافة ثلاثية الأبعاد 1) بتفريق السلف نحو الخلايا الضخمة التي تصل إلى حالة نضوج أعلى ، 2) لتلخيص الأنماط الظاهرية التي يمكن ملاحظتها في الجسم الحي ولكنها تمر دون أن يلاحظها أحد في الثقافات السائلة الكلاسيكية ، و3) لدراسة مسارات النقل الناجمة عن الإشارات الميكانيكية التي توفرها بيئة ثلاثية الأبعاد.

Introduction

الخلايا في الجسم تجربة محيط 3D معقدة وتخضع للتفاعل بين الإشارات الكيميائية والميكانوفيزيقية بما في ذلك تصلب من الأنسجة والحبس بسبب الخلايا المجاورة والمصفوفة المحيطة ^1،2،3. ولم يتم الاعتراف بأهمية الصلابة والحبس لسلوك الزنزانات إلا في العقود الأخيرة. وفي عام 2006، أبرز العمل الجوهري الذي قام به إنغلر وآخرون ^{4 أهمية} البيئة الميكانيكية لتمايز الخلايا. أظهر المؤلفون أن الاختلاف في تصلب ركائز الخلايا أدى إلى اتجاه الخلايا الجذعية نحو أنساب مختلفة للتمايز. ومنذ ذلك الحين ، أصبح تأثير الإشارات الميكانيكية على مصير الخلايا وسلوكها معترفا به ودرس بشكلمتزايد. على الرغم من كونها واحدة من أنعم الأنسجة من الكائن الحي، ونخاع العظام لديه منظمة الهيكلية 3D التي تقتصر داخل العظام. تصلب النخاع، على الرغم من صعوبة من الناحية الفنية لقياس على وجه التحديد، ويقدر أن تقع بين 15 و 300 السلطة الفلسطينية ^5،6. داخل ستروما، تقتصر الخلايا بإحكام على بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظمهم يهاجرون نحو الأوعية الجيوب الأنفية لدخول الدورة الدموية. وتخلق هذه الظروف قيودا ميكانيكية إضافية على الخلايا المجاورة، التي يتعين عليها التكيف مع هذه القوى. الإشارات الميكانيكية تمثل معلمة هامة التي تم استكشاف عواقبها على التمايز megakaryocyte وتشكيل البروبليت مؤخرا. على الرغم من أن megakaryocytes يمكن أن تفرق في المختبر في الثقافة السائلة التقليدية، فإنها لا تصل إلى درجة النضج لوحظ في الجسم الحي،ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود الإشارات الميكانيكية من البيئة 3D ⁷. زراعة السلف جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل يجلب الإشارات الميكانيكية 3D التي تفتقر إلى الوسط السائل.

وقد استخدمت الهيدروجيلات على نطاق واسع لعدة عقود في مجال أمراض الدم، ولا سيما لزراعة الخلايا في مستعمرة تشكيل المقايسات لتحديد السلف الدموية. ومع ذلك، نادرا ما استخدمت هذه الهيدروجيلات لاستكشاف التأثير البيولوجي للبيئة الميكانيكية ثلاثية الأبعاد على نضوج وتمايز الخلايا الدموية. على مدى السنوات القليلة الماضية طور مختبرنا نموذج ثقافة ثلاثية الأبعاد باستخدام هيدروجيل هيدروجيل قائم على الميثيل ^{سليلوز 8}. هذا الجل المادي غير النشط هو أداة مفيدة لمحاكاة القيود المادية للبيئة megakaryocyte الأصلي. وهي مشتقة من السليلوز عن طريق استبدال بقايا الهيدروكسيل (-OH) بمجموعات ميثوكسيسيد (-OCH_3). كل من درجة استبدال الميثيل وتركيز ميثيلسليلوز تحديد صلابة الهيدروجيل بمجرد أن الهلام. خلال مرحلة تطوير هذه التقنية ، ثبت أن معامل يونغ في نطاق 30 إلى 60 Pa هو صلابة الجل الأمثل لنمو الخلايا العملاقة ⁹.

يصف البروتوكول التالي طريقة لزراعة السلف العملاقة للفأرة في هيدروجيل ميثيلسليلوز ثلاثي الأبعاد. وقد ثبت سابقا أنه بالمقارنة مع الثقافة السائلة القياسية، هذه الثقافة الهيدروجيل يزيد من درجة تعدد الكريات البيض، ويحسن النضج والتنظيم داخل الخلايا، ويزيد من قدرة megakaryocytes لتمديد proplatelets مرة واحدة في إعادة إنفاقها في وسط السائل ⁹. تصف هذه المخطوطة بالتفصيل بروتوكول عزل خلايا نخاع العظم الماوس لين- وتضمينها في هيدروجيل ميثيلسليلوز للثقافة ثلاثية الأبعاد وكذلك تحديد قدرتها على إنتاج الصفائح الدموية واستعادة الخلايا لإجراء مزيد من التحليلات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وينبغي إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها. وقد نفذت جميع البروتوكولات المعروضة في الفيديو وفقا للقانون الأوروبي وتوصيات مجلس استعراض الاتحاد الفرنسي للرقابة. تم نشر النسخة الأولى من هذا البروتوكول في الأصل في عام 2018 في أساليب في البيولوجيا الجزيئية ⁸.

ملاحظة: الشكل 1 يقدم طريقة عرض تخطيطية للعملية بأكملها. وتشمل هذه العملية 1) تشريح العظام، واسترجاع النخاع، والعزل الميكانيكي لخلايا النخاع، 2) الفرز المغناطيسي للخلايا السلبية النسب (لين)،3) البذر في هيدروجيل السائل أو ميثيلسليلوز، و 4) إعادة تعليق الخلايا الضخمة نمت في هلام 3D لفحص تشكيل البربليتليت في الوسط السائل.

1. جمع العظام من الفئران الكبار

ملاحظة: في هذا القسم، من المهم تقليل التلوث الميكروبي.

1. إعداد أنبوب 15 مل لجمع العظام مع دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM) التي تحتوي على 1٪ من الحجم الإجمالي للبينسلين-ستربتوميسين-الجلوتامين (PSG) مزيج المضادات الحيوية (البنسلين 10000 U/mL، الستربتوميسين 100000 ميكروغرام/مل وL-الجلوتامين 29.2 ملغم/مل).
   ملاحظة: إذا كان لدى جميع الفئران المستخدمة نفس النمط الجيني ، فجمع جميع العظام في نفس الأنبوب الذي يحتوي على 1 مل من DMEM - PSG 1٪ لكل عدد من الفئران. المضادات الحيوية مهمة لمنع انتشار البكتيريا المحتملة خلال وقت أخذ عينات العظام.
2. ملء أنبوب 50 مل مع الإيثانول 70٪ لتطهير العظام وآخر لأجهزة الشطف أثناء الإجراء. استخدام أدوات تشريح معقمة.
3. تخدير الفئران باستخدام استنشاق الأيزوفلوران (4٪) والمضي قدما بسرعة إلى خلع عنق الرحم للقتل الرحيم الفئران. تزج بسرعة الجسم في الإيثانول 70٪ لتطهير وتجنب التلوث الميكروبي.
4. تشريح بسرعة من الساقين وعظم الفخذ.
5. باستخدام مشرط، وقطع بعيدا epiphyses من جانب الكاحل نهاية لعظم الساق ونهاية الجانب الورك لعظم الفخذ.
6. تزج العظام لثانية واحدة في الإيثانول 70٪ قبل غمرها في المتوسط DMEM التي تحتوي على 1٪ PSG.

2. فصاع النخاع وعزل الخلايا اللينة

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الجزء من البروتوكول تحت غطاء تدفق صفح. وبالنسبة لثقافة واحدة، فإن جميع الآبار جزء من التجربة نفسها ولا يمكن اعتبارها تكرارات بيولوجية مستقلة. يتم تجميع الخلايا من جميع الفئران معا لضمان تجانس جميع الآبار وتكون قادرة على مقارنتها ببعضها البعض مع القضاء على التباين المحتمل بين الأفراد. بالنسبة للكرات البيولوجية المستقلة ، يجب تكرار الثقافة.

1. ضع العظام في طبق بيتري وارفعها مرتين في المالحة المعقمة المكفرة بالفوسفات في دولبيكو (DPBS) لإزالة الملوثات المحتملة.
2. إعداد DMEM - 1٪ PSG في أنبوب 50 مل.
   ملاحظة: توفير 2 مل من DMEM - 1٪ PSG لكل الفئران المستخدمة في التجربة.
3. ملء حقنة 5 مل مجهزة إبرة قياس 21 مع DMEM - 1٪ PSG.
4. عقد العظام مع ملقط، وإدخال شطبة فقط من الإبرة في نهاية الجانب الركبة.
   ملاحظة: يجب أن يبقى داء الظهارة الجانبي للركبة سليما من التشريح ، تاركا تجويفا صغيرا في مركزه لإدخال الإبرة. سوف يحافظ داء البشرة المتبقي على العظم المرفق بالإبرة أثناء التنظيف. يجب الحرص على عدم إدخال أكثر من شطبة في العظام لأنها قد الاسكواش وتلف النخاع.
5. اضغط بسرعة المكبس حقنة لطرد النخاع في أنبوب 50 مل.
   ملاحظة: لتجنب البقع وتسهيل تدفق النخاع والتحرر وضع نهاية خالية من العظام على جدار أنبوب، مغمورة في DMEM - 1٪ PSG. في الممارسة العملية، حجم بين 500 ميكرولتر و 1 مل كافية عموما لطرد النخاع من العظام. عندما يتم طرد النخاع تماما، أصبح العظم أبيض. في حالة عدم طرد النخاع تماما من الديافيس كما تم الحكم عليه من قبل بعض الألوان الحمراء المتبقية ، فمن الممكن تكرار التدفق مع وسط جديد.
6. كرر الخطوات 2.4. و 2.5. لجميع العظام، وإعادة ملء حقنة 5 مل مع DMEM - 1٪ PSG إذا لزم الأمر.
7. استخدم نفس المحقنة 5 مل مع إبرة قياس 21 لنقل الحجم الإجمالي للوسط الذي يحتوي على نخاع مسح في أنابيب 10 مل مستديرة القاع.
   ملاحظة: ليس من الضروري تماما للتبديل إلى أنبوب 10 مل القاع الجولة لكنه يجعل من الأسهل المضي قدما إلى خطوات الانفصال التالية. لا تتردد في تغيير الحقنة و/ أو الإبرة إذا كان يشتبه في خطر التلوث.
8. انتقل إلى تفكك الخلايا عن طريق قرصنة وطرد الخلايا المتوسطة والنخاع على التوالي مرتين من خلال إبرة قياس 21، ثلاث مرات من خلال قياس 23 ومرة واحدة من خلال إبرة قياس 25.
   ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء لأنها قد تكون ضارة للخلايا.
9. نقل التعليق إلى أنابيب 15 مل.
10. قياس عدد الخلايا والتحقق من الجدوى باستخدام عداد الخلية الآلي أو غرفة الخلية للعد اليدوي في وجود تريبان الأزرق لاستبعاد الخلايا الميتة.
11. الطرد المركزي أنابيب 15 مل لمدة 7 دقائق في 300 x ز. باستخدام ماصة نقل 1 مل، ماصة بعناية والتخلص من supernatant.
12. عزل الخلايا الجذعية والسلف عن طريق الفرز المغناطيسي المناعي السلبي باستخدام مجموعة عزل الخلايا الدموية الماوس.
    ملاحظة: الهدف من هذا الفرز الخلية استرداد الخلايا التي تكون سالبة لكافة الأجسام المضادة التحديد (CD5، CD11b، CD19، CD45R/B220، Ly6G/C(Gr-1)، TER119، 7-4) وبالتالي للقضاء على الخلايا التي تشارك بالفعل في نسب التمايز غير واحد megakaryocytic.
13. بعد تعليمات عدة، resuspend بيليه الخلوية في المتوسط M أعدت حديثا (PBS مع 2٪ من الحجم النهائي للمصل البقري الجنين (FBS)، EDTA 1 mM) إلى تركيز 1 × 10⁸ خلايا / مل وتوزيع التعليق في جولة القاع 5 مل أنابيب البوليسترين إلى حجم أقصى من 2 مل.
14. إضافة إلى أنابيب البوليسترين: مصل الفئران العادي بتركيز 50 ميكرولتر / مل وكذلك مزيج الأجسام المضادة البيوتينيلات (CD5، CD11b، CD19، CD45R/B220، Ly6G/C (Gr-1)، TER119، 7-4) بتركيز 50 ميكرولتر من المزيج لكل مل والتجانس عن طريق النقر برفق الأنابيب.
    ملاحظة: هذه الأجسام المضادة سوف ترتبط بالخلايا المشاركة بالفعل في مسار التمايز باستثناء المسار الضخم.
15. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة.
16. إضافة الخرز المغناطيسي المغلفة streptavidin بتركيز 75 ميكرولتر / مل وتجانس عن طريق النقر بلطف الأنابيب.
17. احتضان مرة أخرى على الجليد لمدة 10 دقيقة.
18. إذا لزم الأمر، ضبط لحجم النهائي من 2.5 مل لكل أنبوب مع المتوسط M.
19. تجانس التعليق عن طريق النقر بلطف أنبوب فقط قبل وضعها، دون قبعاتهم، داخل المغناطيس والانتظار لمدة ثلاث دقائق.
    ملاحظة: سيتم الاحتفاظ الخلايا تشارك بالفعل في مسار التمايز والمغلفة بالخرز المغناطيسي على جدار الأنبوب داخل المغناطيس.
20. عكس المغناطيس وأنبوب لنقل محتوى أنبوب في أنبوب جديد جولة القاع 5 مل البوليسترين.
    ملاحظة: لا تأخذ الأنبوب من المغناطيس لنقل; ويتم ذلك عن طريق عكس المغناطيس مع أنبوب لا يزال في. استخدام حركة ثابتة ولا يهز الأنبوب.
21. تجاهل الأنبوب الأولي الذي يحتوي على خلايا غير مرغوب فيها ذات تسمية مغناطيسية ووضع الأنبوب الجديد ، دون غطاء ، في المغناطيس لمدة ثلاث دقائق أخرى.
22. كما هو الحال في الخطوة 2.20، نقل لين المعزولة- الخلايا إلى أنبوب 15 مل جديدة.
    ملاحظة: إذا تم استخدام عدة أنابيب البوليسترين 5 مل للخطوات السابقة، تجمع كافة الخلايا في نفس أنبوب 15 مل. الخلايا التي تم استردادها بعد فرز الخلايا هي الخلايا الجذعية الدموية والذرى. وجود thrombopoietin (TPO)، المنظم الفسيولوجي الرئيسي من megakaryopoiesis ^10،سيوجه تمايز الخلية نحو خط الخلية العملاقة.
23. قياس رقم الخلية Lin- وقابلية البقاء كما في الخطوة 2.10.
24. حساب الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى الطرد المركزي من أجل أن يكون 1 × 10⁶ خلايا قابلة للحياة × رقم البئر، رقم البئر هو عدد الآبار للبذور لكل حالة.
25. إعداد أنبوب واحد لكل حالة مع الحجم المناسب من تعليق الخلية والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 7 دقائق.
26. بالنسبة للثقافات السائلة، تجاهل الناموستة الخارقة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في وسط ثقافة كامل (DMEM، PSG 1٪ من الحجم النهائي، FBS 10٪ من الحجم النهائي، هيرودين 100 U/mL، TPO 50 نانوغرام / مل) لتحقيق التركيز النهائي من 2 × 10⁶ خلايا قابلة للحياة / مل (أي ما يعادل 1 × 10⁶ خلايا لكل 500 ميكرولتر جيدا). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. (= اليوم 0 للثقافة)
    ملاحظة: راجع الفقرة التالية لثقافات ميثيلسليلوز كمثال، لإعداد وسيطة ثقافة كاملة لإحدى الالآبار، استخدام 435 ميكرولتر من DMEM، 50 ميكرولتر من 100٪ FBS ل10٪ النهائي، 5 ميكرولتر من 100٪ PSG ل1٪ النهائي، 5 ميكرولتر من 10 000 U/mL ل100 U/mL النهائي و 5 ميكروغرام من 5 ميكروغرام / مل TPO ل50 نانوغرام / مل النهائي. وعادة ما تستخدم لوحات 4-جيدا أو 24 جيدا الثقافة قطرها جيدا هو مناسبة جيدة ل500 ميكرولتر اللازمة لكل بئر.

3. تضمين الخلية في هيدروجيل ميثيلسليلوز

ملاحظة: الرجاء ملاحظة أن البروتوكول التالي يصف الأسلوب للحصول على بئر واحد من ثقافة الخلية الهيدروجيل، والتكيف مع عدد من الآبار اللازمة.

1. ذوبان 1 مل aliquots من محلول الأسهم ميثيلسليلوز 3٪ في درجة حرارة الغرفة. إعداد واحد aliquot إضافية منفصلة من ميثيلسليلوز لطلاء حقنة.
   ملاحظة: بتركيز 3٪، يظل ميثيلسليلوز سائلا عند درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية).
2. معطف 1 مل لوير قفل حقنة مجهزة إبرة قياس 18 مع ميثيلسليلوز عن طريق رسم 1 مل من ميثيلسليلوز من aliquot اضافية. طرد تماما ميثيلسليلوز.
   ملاحظة: هذه الخطوة طلاء يضمن أن حجم ميثيلسليلوز التي تم جمعها في الخطوة 3.3 هو بالضبط.
3. مع نفس الحقنة وإبرة ولكن باستخدام aliquot methylcellulose جديدة، رسم الحجم المناسب من ميثيلسليلوز(الشكل 2A).
   ملاحظة: لتحقيق تركيز نهائي من 2٪ ميثيلسليلوز في حجم نهائي من 500 ميكرولتر لكل بئر، مطلوب 333 ميكرولتر من 3٪ ميثيلسليلوز.
4. إزالة الإبرة بحذر. باستخدام ملقط معقم، المسمار موصل قفل لوير على نهاية الحقنة (الشكل 2B-C).
5. إرفاق الثانية، غير المغلفة، 1 مل لوير قفل حقنة إلى موصل قفل لوير من أجل توصيل المحاقن اثنين معا(الشكل 2D).
   ملاحظة: ليست هناك حاجة لمعطف هذه الحقنة الثانية.
6. توزيع حجم الميثيلسليلوز بالتساوي بين المحاقن(الشكل 2E)ووضعها جانبا حتى الخطوة 3.11.
7. إعداد مركزة DMEM ثقافة المتوسطة وذلك للحصول على في حجم ميثيلسليلوز النهائي (الخطوة 3.11) تركيز مماثلة لواحدة من وسط الثقافة السائلة لكل مركب (PSG 1٪ من الحجم النهائي، FBS 10٪ من الحجم النهائي، هيرودين 100 U/mL، TPO 50 نانوغرام / مل).
   1. إعداد 167 ميكرولتر من متوسطة الثقافة المركزة لكل بئر نهائي من 1 × 10⁶ خلايا. يتم حساب هذا الحجم من المتوسطة وذلك للحصول على تركيز ميثيلسليلوز النهائي من 2٪. وسيكون الحجم الإجمالي في البئر 500 ميكرولتر (167 ميكرولتر من تعليق الخلية في وسط الثقافة المركزة + 333 ميكرولتر من الميثيلسليلوز) وسيكون لجميع المكونات تركيز مماثل للتركيز في الآبار السائلة.
   2. كمثال، لإعداد وسيط ثقافة كاملة لخير واحد، استخدام 102 ميكرولتر من DMEM، 50 ميكرولتر من 100٪ FBS ل10٪ النهائي، 5 ميكرولتر من 100٪ PSG ل1٪ النهائي، 5 ميكرولتر من 10 000 U/mL ل100 U/mL النهائي و 5 ميكروغرام من 5 ميكروغرام / مل TPO ل50 نانوغرام / مل النهائي. يعطي حجم 167 ميكرولتر المستخدمة لإعادة إنفاق الخلايا ومع إضافة 333 ميكرولتر من ميثيلسليلوز سيكون الحجم النهائي 500 ميكرولتر.
8. بعد الانتهاء من الخطوة الطرد المركزي 2.26، تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في وسط الثقافة المركزة بنسبة 1 × 10⁶ خلايا لكل 167 ميكرولتر.
9. استعادة المحاقن وفصل واحد منهم من الموصل.
10. ماصة 167 ميكرولتر من تعليق الخلية.
11. إضافة تعليق الخلية مباشرة في موصل حقنة (الشكل 2F)، مع التأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء.
    ملاحظة: أثناء إضافة تعليق الخلية، ارسم المكبس المحقن ببطء في وقت واحد لتحرير بعض المساحة لتعليق الخلية.
12. إعادة الاتصال بعناية اثنين من المحاقن(الشكل 2G)دون أن تفقد أي تعليق في الموضوع المسمار.
    ملاحظة: قبل إعادة الاتصال، ارسم المكبس من أجل ترك الموصل نصف فارغ واترك مساحة كافية للمحقنة الثانية للاتصال دون تجاوز التعليق.
13. تجانس ببطء المتوسط ميثيلسليلوز مع تعليق الخلية مع عشر حركات المكبس ذهابا وإيابا بين المحاقن اثنين(الشكل 2H).
14. ارسم الحجم الإجمالي في حقنة واحدة وافصل الحقنتين، تاركا الموصل على الحقنة الفارغة.
15. إفراغ محتوى الحقنة في بئر من لوحة 4-جيدا(الشكل 2I).
16. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO₂ (= اليوم 0 من الثقافة).
    ملاحظة: من الممكن تحضير بئرين ميثيلسليلوز مع زوج واحد من المحاقن. زيادة بمقدار اثنين من حجم ميثيلسليلوز وحجم تعليق الخلية أن يكون 2 x10⁶ الخلايا. بعد الانتهاء من الخطوة 3.13. توزيع حجم بالتساوي بين المحاقن اثنين أن يكون 500 ميكرولتر في كل واحد منهم. قطع لهم وتفريغ واحد دون موصل في بئر الثقافة. أعد توصيل المحاقن لنقل وحدة التخزين من تلك التي أبقت الموصل إلى الآخر. قطع المحاقن، واحد مع 500 ميكرولتر لا ينبغي أن يكون الموصل المرفقة، والبذور الخلايا في بئر الثقافة الثانية. يتم شراء ميثيلسليلوز 3٪ كحل الأسهم في المتوسط دولبيكو المعدلة في إيسكوف (IMDM) في حين يتم تعليق الخلايا المركزة في DMEM. وقد أجريت اختبارات مقارنة في البداية للتأكد من أن هذه الوسيلة المختلطة لم يكن لها أي تأثير على نتيجة التجربة، وخاصة بالمقارنة مع الثقافة السائلة في 100٪ DMEM.

4. إعادة زراعة الخلية لتحليل بروبليتليت

ملاحظة: تحليل القدرة على تشكيل proplatelets يجب أن يتم في ظل ظروف مماثلة بين السائل والميثيلسليلوز نمت megakaryocytes. القيود المادية التي تمارسها هيدروجيل ميثيليلولوس تمنع تمديد الصفائح الدموية. لذلك، يتم إعادة إنفاق الخلايا المزروعة بالميثيلسليلوز في وسط سائل طازج في اليوم الثالث من الثقافة للسماح لها بتوسيع الصفائح. ميثيلسليلوز هيدروجيل هو هيدروجيل المادية التي يتم تخفيفها بسهولة على إضافة السائل المتوسط. الأهم من ذلك، لتجنب القطع الأثرية من إعادة الإنفاق والطرد المركزي، والخلايا في حالة وسيطة السائل السيطرة يجب أن تعامل في وقت واحد بنفس الطريقة التي الخلايا المزروعة ميثيلسليلوز. راجع التمثيل التخطيطي للتجربة (الشكل 1).

1. إعداد 10 مل من DMEM - 1٪ PSG مسخن في 37 درجة مئوية في أنبوب 15 مل لكل بئر لإعادة الإنفاق.
2. إعادة إنفاق الخلايا بحذر من كل بئر في 10 مل من DMEM - 1٪ PSG.
   ملاحظة: القيام بلطف عدة حركات صعودا وهبوطا لتمييع ميثيلسليلوز تماما. للنواة السائلة تأكد من جمع جميع الخلايا المودعة في الجزء السفلي من البئر.
3. الطرد المركزي أنابيب 5 دقيقة في 300 × ز.
4. وفي الوقت نفسه إعداد المتوسطة ثقافة كاملة (DMEM، باريس سان جيرمان 1٪ من الحجم النهائي، FBS 10٪ من الحجم النهائي، هيرودين 100 U/mL، TPO 50 نانوغرام / مل).
   ملاحظة: في هذه الخطوة يتم استرداد كل بئر إلى أن تضعف بمقدار النصف، وبالتالي إعداد 1 مل من المتوسطة ثقافة كاملة لكل بئر.
5. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من الثقافة المتوسطة لكل أنبوب.
6. Reseed 500 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر في لوحة 4 أو 24 جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO₂.
   ملاحظة: من بئر أولي واحد، احصل على بئرين للتصور البروبليت في التكرار. يرجى ملاحظة أنه بما أن هذه التكرارات تنشأ من نفس العينة، فلا يمكن اعتبارها نسخا متماثلة مستقلة.
7. بعد 24 ساعة من إعادة الزرع ، في اليوم 4 من الثقافة ، والحصول على عشوائيا 10 صور لكل بئر باستخدام المجهر حقل مشرق والهدف 20×.
   ملاحظة: تميل الخلايا إلى التجمع في وسط البئر، تأكد من عدم وجود خلايا كثيرة جدا في الميدان لأنها قد تجعل التصور proplatelet وتكميم صعبة. تأكد من التقاط ما لا يقل عن 5 ميغاكاريوسيت لكل حقل.
8. عد العدد الإجمالي للخلايا الضخمة وmegakaryocytes تمديد الصفائح في كل صورة وحساب نسبة الخلايا العملاقة تمديد proplatelets.
   ملاحظة: لا يكون القياس الكمي آليا؛ إجراء عد الخلايا يدويا. يمكن تسهيل العد باستخدام المكون الإضافي لعد الخلية من ImageJ للنقر على الخلايا من أجل وضع علامة عليها عند عدها. 10 حقول تم الحصول عليها لكل بئر والآبار المكررة تمثل ما يقرب من 150-300 ميغاكاروسيت لكل حالة.

5. تثبيت الخلية واسترجاعها للتحليلات المستقبلية

تنبيه: يستخدم هذا البروتوكول مثبتات يجب معالجتها تحت غطاء الدخان، وارتداء معدات الحماية.

ملاحظة: الهدف هو الحفاظ على قيود الجل المطبقة على الخلايا سليمة حتى يتم إصلاحها بالكامل. لذلك ، وبغض النظر عن المثبت المستخدم ، يجب إضافته في البئر فوق الميثيلسليلوز ، دون إزعاج الجل. يتم تطبيق نفس البروتوكول على الثقافات السائلة.

1. إضافة حجم من محلول مثبت يساوي حجم المصنف (500 ميكرولتر في هذا البروتوكول)، على رأس ميثيلسليلوز دون تعطيل هلام. انتظر الوقت المناسب وفقا للمثبت المستخدم (10 دقائق على الأقل).
   ملاحظة: يجب أن يكون الانتشار المثبت في جميع أنحاء الجل سريعا جدا كما كشف عنه التغير السريع في لون الجل (من الوردي إلى الظل الأصفر والبرتقالي). وعادة ما يستخدم البارافورمالديهيد (8٪ في DPBS، 500 ميكرولتر لكل بئر) في التكبيل المناعي، في حين يستخدم الجلوتارالدهيد (5٪ في حاجز cacodylate، 500 ميكرولتر لكل بئر) لتحليل المجهر الإلكتروني.
2. باستخدام ماصة P1000 بلطف القيام بالعديد من pipettings صعودا وهبوطا مع المثبتة وهلام وذلك لتخفيف متجانسة ميثيلسليلوز.
3. باستخدام نفس ماصة وطرف، نقل كل حجم من البئر إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل من DPBS والتجانس.
4. الطرد المركزي الخليط في 300 × غرام لمدة 7 دقائق.
   ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى خطوة غسل ثانية للقضاء على جميع ميثيلسليلوز
5. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه megakaryocyte في الوسط المناسب وفقا للتحليل المطلوب (immunolabeling، تدفق قياس الخلايا^9،المجهر الإلكتروني ...) (للفحص المجهري الإلكتروني انظر أيضا طريقة الورق "استكشاف الموقع للخطوات الرئيسية لل megakaryopoiesis باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال" في هذه المسألة JoVE).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نشرت البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول في الأصل في الدم في عام 2016⁹.

وفقا للبروتوكول، تم بذر الخلايا إما في السائل أو ميثيلسليلوز هيدروجيل المتوسطة. وقد رسوبي جميع الخلايا في الوسط السائل في الجزء السفلي من البئر، في اتصال مع سطح البلاستيك قا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في العقد الماضي، أثار علم الأحياء الميكانيكية المزيد والمزيد من الاهتمام في العديد من مجالات علم الأحياء. ومن المسلم به الآن أن البيئة الميكانيكية المحيطة بالخلايا تلعب دورا في سلوكها ، مع التأكيد على أهمية دراسة كيفية إحساس الخلايا الضخمة والاستجابة للإشارات الميكانيكية خارج الخلية. م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needles	Sigma-Aldrich	1001735825
21-gauge needles	BD Microlance	301155
23-gauge needles	Terumo	AN*2332R1
25-gauge neeldes	BD Microlance	300400
4-well culture dishes	Thermo Scientific	144444
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin centrifuge	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit	Stem Cell Technologies	19856A	biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
Polylysin coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum	Stem Cell Technologies	13551
Recombinant hirudin	Transgène	rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes	Falcon	352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes