بسيطة في المنزل فائقة الأداء تصنيع العمود الشعرية مع نهج FlashPack

Sergey I. Kovalchuk; Rustam Ziganshin; Irina Shelukhina

doi:10.3791/62522

Summary

هنا نقدم بروتوكولا لإجراء التعبئة العمود الشعرية FlashPack الأمثل. تطبيق بروتوكول الأمثل لإعداد قنبلة ضغط 100 بار مشترك يسمح التعبئة أسرع 10 مرات وتصنيع أعمدة الشعرية طويلة فائقة الأداء.

Abstract

يعتبر التصوير الكروماتوغرافي السائل عالي الأداء (UHPLC) حاليا طريقة مفضلة لخطوة فصل العينة في البروتيوميات المستندة إلى LC-MS. ومع ذلك، الأعمدة الشعرية هي أقل قوة بكثير بالمقارنة مع الأنواع المضادة تدفق أعلى. بسبب التلوث السهل والحجب ، فإنهم يحتاجون في كثير من الأحيان إلى الاستبدال. وهذا يجعلها جزءا مكلفا بشكل ملحوظ من إجمالي تكلفة تحليل LC-MS. التعبئة الداخلية للأعمدة الشعرية UHPLC يوفر الكثير من المال ويسمح بالتخصيص. ومع ذلك ، فإن إجراء التعبئة القياسي في قنبلة الضغط 100 بار يعمل بشكل جيد فقط لأعمدة HPLC ولكنه بطيء للغاية بالنسبة لمتمتز UHPLC. هنا نقدم وصفا لبروتوكول FlashPack الأمثل المطبق على نفس الإعداد قنبلة الضغط 100 بار. وتستند هذه الطريقة على التعبئة من الطين تركيز المواد الماصة عالية جدا ويتم تطويرها لتصنيع في المنزل من الأعمدة الشعرية UHPLC من طول غير محدود في وقت معقول.

Introduction

ويستند البروتيوميات الحديثة على قياس الطيف الكتلي السائل المقترن بالكروماتوغرافيا مع الكروماتوغرافيا فائقة الأداء نانو تدفق (50-150 ميكرومتر قطر العمود الداخلي (ID)) فصل توفير أفضل سرعة التحليل والحساسية¹. في حين تتوفر العديد من الأعمدة الشعرية التجارية UHPLC ، فإن سعرها يشكل جزءا كبيرا من تكلفة المواد الاستهلاكية ، خاصة عندما يتم تشغيل مشاريع متعددة ومتنوعة في المختبر ويعد تلوث الأعمدة الخاصة بالمشروع مشكلة متكررة. إلى جانب ذلك ، تسمح تعبئة الأعمدة الداخلية باستخدام المواد الماصة المخصصة للتجربة (مثل ، polyCAT-A sorbent²⁾وخصائص العمود غير المتاحة للشراء كعمود جاهز.

للتعامل مع ذلك ، العديد من المختبرات حزمة أعمدة شعرية في المنزل. ومع ذلك ، فإن إجراء التعبئة الشائعة مع قنبلة ضغط شريط 100^(خلية حقن الضغط) 3 غير مناسب لتعبئة عمود UHPLC بسبب الضغط الخلفي العالي لمتمتزات UHPLC الفرعية 2 ميكرومتر مما يؤدي إلى انخفاض كبير في معدل التعبئة بالمقارنة مع المواد الماصة HPLC أكبر حجما. في حين أن أعمدة UHPLC القصيرة لا تزال معبأة ببطء شديد ، فإن تصنيع أعمدة UHPLC الطويلة مستحيل فعليا⁴.

تتم التعبئة عمود الشعرية القياسية في ضغوط منخفضة نسبيا تصل إلى 100 أشرطة، ومع تركيز الطين ماصة منخفضة جدا. ومن ثم، هناك اتجاهان محتملان لتسريع العملية. فمن الممكن لزيادة ضغط التعبئة⁵. ومع ذلك، يتطلب ذلك معدات خاصة، وعمليا، تركيب طريقة جديدة في المختبر. طريقة أخرى هي زيادة تركيز الطين الماصة⁶. ويرد وصف ارتفاع التعبئة تركيز الطين ماصة في تركيبة مع الضغط التعبئة عالية جدا في منشور سابق⁷. ومع ذلك ، في ضغط 100 شريط ، والذي يستخدم في معظم قنابل التعبئة الموجودة ، يؤدي تركيز المواد الماصة الأعلى إما إلى إبطاء معدل التعبئة أو التوقف التام عن التعبئة. وقد ثبت مؤخرا أن التأثير يرجع إلى تجمع ماصة عند مدخل العمود، واقترح خدعة بسيطة من زعزعة استقرار قبة ماصة عن طريق طرق مدخل العمود مع شريط المغناطيس داخل قارورة ماصة⁴. تستخدم الطريقة الناتجة ، المسماة FlashPack ، نفس إعداد تعبئة قنبلة الضغط 100 بار. وفي الوقت نفسه، تسمح التغييرات الطفيفة ولكن الحرجة في إجراء التعبئة بالتعبئة من تركيز ملوث عالي جدا وإنتاج أعمدة UHPLC طويلة جدا (50 إلى 70 سم، وأطول) في أقل من ساعة، في حين يمكن إنتاج عمود قصير في دقائق مع جودة الفصل مساوية للأعمدة التجارية لنفس المعلمات⁴. تم استخدام نهج FlashPack بنجاح في مشاريع بروتيوميات متعددة لإعداد كل من المرحلة العكسية (RP)⁸^و⁹^و¹⁰^و¹¹و¹²و¹³و¹⁴ والتفاعل المائي (HILIC)² أعمدة شعرية.

هنا نحن نصف بالتفصيل ، والتعديلات اللازمة للتكيف مع نهج FlashPack لمعايير 100 بار ضغط قنبلة التعبئة الإجراء.

Protocol

بروتوكول التعبئة يتكون من خمس خطوات(الشكل 1):1) إعداد محطة التعبئة، 2) إعداد الشعرية، 3) إعداد الطين الماصة، 4) التعبئة الشعرية في قنبلة الضغط، و 5) عمود التعبئة المتابعة في نظام HPLC، وقطع ما يصل إلى حجم وتركيب اتصال UHPLC. يتطلب تحسين FlashPack إجراء تعديلات في القسمين 3 و4 مقارنة بالبروتوكول المشترك.

1. التعبئة محطة التجميع

إعداد خزان غاز مملوء إما بالنيتروجين أو الهيليوم أو الأرجون المفروش بمنظم غاز مرحلة واحدة مع ضغط المنفذ > 50 بارا. الحد الأقصى للضغط محدود بسبب توافق قنبلة الضغط.
قم بتوصيل المنظم بصمام تنفيس قنبلة الضغط.
إذا لم تكن قنبلة الضغط مجهزة بستيرر مغناطيسي متكامل، ضع القنبلة على ستيرر مغناطيسي.
قم بتوصيل أنابيب بلاستيكية ضيقة من هيئة هوية (على سبيل المثال، 0.13 مم) بمنفذ تنفيس قنبلة الضغط ووضعها في وعاء مع الماء.

2. إعداد الشعيرات الدموية

إعداد الشعرية fritted مع فريت الزجاج المتكاملة التي شكلت من كاسيل وفورماميد¹⁵ أو الشعرية باعث سحبت أعدتها سحب الليزر¹⁶. يتكون الشعرية 10-15 سم أطول من طول العمود المقصود.
ملاحظة: راجع الجدول 1 لمناقشة المشكلات المحتملة المقترنة بأحجام شعرية وأنواع frit مختلفة. ويتضمن الجدول 2 مثالا على برنامج سحب ليزر P2000 لصنع الشعيرات الدموية التي تنبعث منها الانبعاثات.
حماية نهاية باعث سحبت مع قطع هلام تحميل ماصة تلميح.
1. قطع طرف بحيث تناسبها بإحكام حول الشعرية OD 360 ميكرومتر (يمكن نقلها على طول الشعيرات الدموية ولكن يتطلب بعض الجهد للقيام بذلك).
2. الشريحة تلميح ماصة قطع على الشعرية من اتجاه الواجهة الأمامية الشعرية ونقله إلى نهاية باعث.
3. قم بإعادة تحريك طرف الحماية عندما يكون العمود رشا. حرك الطرف إلى الأمام للحصول على نهاية الباعث داخل الطرف عندما لا يتم رش العمود (حتى عندما يكون العمود تحت التدفق ، ولكن لا يزال لا يرش).

3. إعداد الطين الماصة

إعداد قارورة المواد الماصة الأسهم: مكان ~ 50 ملغ من المواد الماصة الجافة في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. هنا، Reprosil Pur C18 يستخدم كمثال.
إضافة 1 مل من الميثانول إلى أنبوب ماصة.
لمزجها تماما، دوامة أنبوب لمدة 10 ق باستخدام خلاط دوامة.
Sonicate في حمام سونيكيشن لمدة 10 ق.
دع المواد الماصة تنقع جيدا لمدة 20-30 دقيقة. ثم دوامة و sonicate مرة أخرى.
إعداد قارورة ماصة العمل. استخدام قارورة القاع مخروطية التي تناسبها في القنبلة.
ملاحظة: يمكن أن يكون إما أنبوب طرد مركزي آخر سعة 1.5 مل أو أي قارورة أخرى اعتمادا على تصميم قنبلة الضغط الخاصة. لهذه التجربة، يتم استخدام أنبوب غطاء المسمار السفلي مخروطي قطع إلى ارتفاع قنبلة الضغط.
إعادة خزنة المواد الماصة في قارورة المواد الماصة المخزون ونقل 500 ميكرولتر إلى قارورة ماصة العمل مع شريط مغناطيسي من 2 × 3 مم الحجم.
إضافة الميثانول تصل إلى ~ 1 مل إلى قارورة العمل.
دع قارورة العمل تقف على الطاولة لمدة 10 دقائق حتى يستقر الممتز بالجاذبية.
إذا، بعد تسوية، طبقة ماصة أقل من 4 ملم، إضافة المزيد من الطين المواد الماصة الأسهم وانتظر ماصة لتسوية لمدة 10 دقيقة أخرى.
ملاحظة: قارورة العمل المعدة معدة لإعداد أعمدة متعددة على مدى أشهر. إذا بقيت القارورة الماصة العاملة دون تحريك لأكثر من 2 ساعة ، فيجب أن تكون دوامة لمدة 10 ق ، سونيكاتيد لمدة 10 ق واستقرت بواسطة الجاذبية. بشكل روتيني ، يتم إعادة إنفاق المواد الماصة في الصباح قبل التعبئة. ثم، فإنه من الجيد للتعبئة ليوم كامل إذا لم يكن هناك توقف طويل بين التعبئة عمود تسلسلي. إذا كان الممتز في قارورة العمل يجف، إضافة الميثانول، وتشغيل الإجراء إعداد كامل ماصة كما لقارورة المواد الماصة الأسهم (الخطوات 3.2-3.5).

4. التعبئة الشعيرات الدموية في قنبلة الضغط

تنبيه: ارتد نظارات واقية دائما عند العمل مع قنبلة الضغط. لا ترتدي قفازات. هذه تقلل بشدة من الشعور باللمس المطلوبة للتعامل السليم مع الشعيرات الدموية قطرها صغيرة وتؤدي إلى أخطاء.

ضع القارورة الماصة في قنبلة الضغط وأصلح جميع المكسرات بإحكام.
ابدأ الدورة من 60 إلى 100 دورة في الدقيقة.
أدخل الشعرية المنبعثة أو المنسحبة في القنبلة: ادفعها إلى أسفل القارورة ، ثم ارفعها 2-3 مم وأصلح الجوز.
ملاحظة: تطبيق الحد الأدنى من القوة المطلوبة لإصلاح الشعرية لتجنب تلف الشعرية والنمس. الأفضل هو تشديد اليد. إذا تم استخدام مفتاح سداسي ال اكس، وتطبيق الحد الأدنى من الجهد الكافي لتشديد.
تحقق ما إذا كان الشعرية ثابتة بشكل صحيح- يجب أن يكون من المستحيل تحريك الشعرية عن طريق سحبها باليد.
ببطء شديد فتح صمام قنبلة الضغط مع الحفاظ على نهاية مفتوحة من الشعرية وأشار بعيدا عن وجهك.
شاهد الخطوات الأولية لعملية التعبئة.
ملاحظة: فور الضغط، يملأ الممتز الشعرية ويصبح غير شفاف طوال المدة. بمجرد أن يبدأ الممتز في حزمة داخل نهاية بعيدة، ويزيد من الضغط الخلفي، ويتباطأ تدفق والطين حتى ماصة داخل الإصلاحات الشعرية في العديد من الحزم ماصة مفصولة الفجوات الخالية من المواد الماصة. المواد الماصة معبأة بالفعل مرئية كمنطقة ذات ألوان كثيفة تنمو باستمرار.
الحفاظ على المناطق الماصة شغلها لتكون على الأقل 70٪ من طول الشعرية مع فجوات حرة ماصة صغيرة طوال مدة عملية التعبئة.
هناك العديد من القضايا المشتركة لمشاهدة أثناء عملية التعبئة، التي تتطلب على متن الطائرة الإعداد التكيف للحفاظ على كفاءة تسليم المواد الماصة في الشعرية.
ملاحظة: ترد في الجدول 3تفاصيل أكثر عن تعديل كفاءة تسليم المواد الماصة.
1. العدد 1: عندما يتوقف الممتز الجديد عن دخول الشعرية بينما يستمر الممتز الموجود بالفعل في الداخل في التحرك، اتبع الخطوات أدناه.
  ملاحظة: هذه هي المشكلة الأكثر شيوعا. في معظم الحالات يتم حظر المدخل الشعري بواسطة مجموعات ماصة ذاتية التجميع. تطبيق الخطوات التالية واحدا تلو الآخر حتى يتم استعادة تدفق المواد الماصة ثم تخطي باقي الخطوات المتعلقة المشكلة.
  1. زيادة سرعة الدوران إلى 500 دورة في الدقيقة وتقليلها فورا إلى 60-100 دورة في الدقيقة. عادة، فإنه يعيد تدفق المواد الماصة. تحقق من سرعة الدوران لتكون على الأقل 60 دورة في الدقيقة لبقية عملية التعبئة.
  2. إذا لم يساعد، تنفيس لفترة وجيزة قنبلة التعبئة والضغط على الفور مرة أخرى.
  3. إذا لم يساعد أو يحدث الحجب مرة أخرى ، فإعادة وضع الشعرية داخل الطبقة الماصة. يمكن أن يكون غياب المواد الماصة بسبب الطرف المفتوح الشعري كونه إما مرتفعا جدا فوق شريط المغناطيس ، لذلك لا تلمسه نهاية العمود ، أو الشعيرات الدموية العالقة في قاع القارورة. أولا، تنفيس القنبلة تماما، وتخفيف الجوز، ودفع الشعرية إلى أسفل، ومن ثم سحبه 2 مم إلى الوراء. إصلاح الجوز.
  4. إذا استمر الحجب ، وتنفيس عن النظام ، أخرج القارورة الماصة والدوامات وصوتيت مرة أخرى. تحقق من الواجهة الأمامية الشعرية للضرر تحت المجهر وقطع ~ 5 ملم من الواجهة الأمامية إذا لزم الأمر.
2. العدد 2: عندما يملأ الممتز جزءا صغيرا فقط من الشعرية مع مناطق فارغة طويلة، اتبع الخطوات أدناه.
  1. تحقق من سرعة الدوران. إذا كان الدوران بطيئا جدا ، فإن كسر القبة ليس فعالا بما فيه الكفاية. زيادة سرعة الدوران إلى ~150 دورة في الدقيقة.
  2. إذا كان الدوران سريعا جدا ، يتم إعادة إنفاق الممتز في حجم القارورة الأكبر وتركيز المواد الماصة المحلية حول مدخل العمود منخفض. إبطاء سرعة الدوران إلى 60-100 دورة في الدقيقة.
  3. تحقق من مستوى المواد الماصة. ويلاحظ نفس المشكلة مع القليل من المواد الماصة داخل الشعرية عندما لا يكون هناك ما يكفي من المواد الماصة في القارورة. عندما يعتاد الممتز، املأ القارورة بالممتز الجديد للحفاظ على ارتفاع الطبقة الممتزة بما لا يقل عن 4 مم بعد التسوية الناجمة عن الجاذبية.
استمر في تعبئة العمود حتى يتم تحقيق طول العمود المستهدف بالإضافة إلى 5-7 سم.
وقف التناوب والاكتئاب ببطء شديد القنبلة.
1. فتح صمام القنبلة قليلا وانتظر انفجار فقاعة داخل زجاجة المياه لتهدأ. ثم، افتح الصمام على نطاق أوسع قليلا وانتظر مرة أخرى حتى تنفجر الفقاعة لتتباطأ.
2. حرر الضغط بزيادات حتى لا يخرج أي غاز من الصمام.
  ملاحظة: لا تفتح الصمام على طول الطريق في وقت واحد - سيؤدي إلى محتدما داخل الشعرية والممتز العودة إلى القارورة. إذا حدث ذلك، اضغط على القنبلة مرة أخرى وانتظر العمود للحصول على معبأة مرة أخرى.
عندما يتوقف الغاز عن الخروج من صمام التهوية، أخرج الشعرية المعبأة من قنبلة الضغط.
ملاحظة: لا تدع العمود تجف. إذا لم تكن متصلا بنظام HPLC على الفور لمزيد من التعبئة، ضع الشعيرات الدموية المعبأة في التخزين عن طريق غمرها بالكامل في محلول EtOH بنسبة 10٪. يمكن استخدام حاوية تخزين المواد الغذائية البولي بروبلين ضيق السائل لتخزين الشعرية. يتم تخزين أعمدة HPLC غير المتصلة بنفس الطريقة.
إذا لم يتم التخطيط لمزيد من التعبئة، أخرج القارورة الماصة من القنبلة واغلقها بإحكام. احتفظ به لمزيد من التعبئة العمود.

5. التعبئة في العمود HPLC

قم بتوصيل الشعيرات الدموية المعبأة بنظام HPLC عبر اتصال HPLC.
بدء تدفق في 95٪ المذيبات B (80 أو 100٪ أسيتونيتريل, 0.1٪ حمض الفورميك (FA)) تستهدف 250-300 شريط الضغط. للحصول على 40 سم من الشعرية المعبأة، استخدم معدل التدفق من 200-300 nL/min.
ملاحظة: معدل تدفق التعبئة هو 200 nL/min لعمود 40-50 سم مع معرف 100 ميكرومتر معبأة مع 2 ميكرومتر ماصة. يتم سرد بعض أحجام الأعمدة الأخرى في الجدول 4. يتم تقدير معدلات التدفق لأطوال الأعمدة وال معرفات أخرى من التناسب المباشر بين الضغط الخلفي وطول العمود والمقطع العرضي. يتم ضبط معدل التدفق الدقيق إلى الطول الفعلي المعبأ، والذي يكون بشكل افتراضي أطول من طول العمود المستهدف. لاحظ أيضا أن ضغط شريط 300 يستهدف حد الضغط الفعلي للاتصال HPLC. بالنسبة لاتصالات الضغط الأعلى، يجب استخدام معدلات تدفق أعلى تصل إلى حد ضغط الاتصال للتعبئة بشكل أسرع.
مشاهدة لمتمتة فضفاضة داخل الشعرية الحصول على معبأة والحصول على إضافة إلى طول معبأة مجموع.
دون وقف تدفق، تراجع الجسم العمود مرتين في حمام سونيكيشن.
ملاحظة: لا تزج نهايات العمود والاتصالات الشعرية فقط جزء من نص العمود. تساعد خطوة Sonication على تحسين قابلية إعادة إنتاج العمود ، خاصة بالنسبة للأعمدة الطويلة للغاية >50 سم (بيانات غير منشورة) ؛ ومع ذلك ، فإنه يضيف فرصة عشوائية لكسر فريت ماصة التجميع الذاتي داخل نهاية باعث الشعيرات الدموية المنبعثة ومنع العمود تماما. في حين يمكن تطبيق سونيكيشن عالميا على أي أعمدة الزجاج fritted، نقترح sonicating سحبت أعمدة الباعث فقط لطول العمود > 50 سم.
عندما يتوقف السرير الماصة تقلص، تراجع الجسم العمود في حمام سونيكيشن مرتين أكثر دون وقف تدفق.
تشغيل العمود لمدة 10 دقائق إضافية في 300 أشرطة.
أوقف التدفق وانتظر حتى ينخفض الضغط إلى أقل من ثلاثة أشرطة، وافصل العمود.
فحص العمود بصريا لعدم وجود ثغرات وتلونات. إذا تم العثور على أي، سونيكيشن تحت تدفق يمكن تكرارها. بالنسبة للتجارب الهامة، فكر في إنشاء عمود جديد.
قص العمود إلى الطول المطلوب.
ملاحظة: قطع بشكل صحيح هو شرط أساسي لكفاءة العمود. جعل درجة في طلاء البوليميد مع الكاتب، وكسر جزئيا الشعرية وسحب قطعتين بعيدا.
البولندية الواجهة الأمامية العمود على رقاقة السيراميك أو مع فيلم اللف.
أعد توصيل العمود بنظام LC باستخدام اتصال UHPLC.
بدء معدل تدفق العمل عند 2٪ B اعتمادا على معرف العمود وفقا للجدول 4. انتظر الضغط لعدم توازن والتحقق من backpressure العمود.
ملاحظة: معدل تدفق العمل يتم ضبط وفقا لمعلمات العمود. على سبيل المثال، يتم تشغيل عمود معرف بطول 30 سم بطول 100 ميكرومتر عند 500 nL/min.
تأكد من أن backpressure ضمن 5٪ من القيمة المتوقعة (راجع الجدول 5) ، وهذا يؤكد أن العمود معبأة بشكل صحيح و جاهز للاستخدام.
ملاحظة: الضغط الخلفي للعمود هو الضغط الإجمالي في قناة التدرج لنظام HPLC مع العمود المتصل ناقص الضغط الخلفي للشعيرات الدموية قبل العمود. وفي الوقت نفسه، فإن القيم في الجدول 5 هي قيم تعسفية (تعطي مقياسا تعسفيا لما يمكن توقعه). التشابه داخل المختبر من الضغط الخلفي من عمود إلى عمود هو مؤشر أكثر أهمية على أن كل شيء يعمل بشكل صحيح. يعتمد الضغط الخلفي المطلق الفعلي على العديد من المعلمات ، مثل حجم وخصائص المواد الماصة ، وهوية الشعرية ، والشركة المصنعة والدفعة ، وشكل نهاية الانبعاثات التي تم سحبها أو كثافة وطول الفريت الزجاجي ، وخصائص المذيبات ودرجة الحرارة المحيطة في الغرفة ، وما إلى ذلك. إذا كان الضغط الخلفي مرتفعا جدا، راجع الجدول 1 للاطلاع على المشكلات المحتملة.

النتائج

ويستند نهج FlashPack على إعداد التعبئة القياسية ويتبع خط أنابيب التعبئة نفسه. يتم التعبئة في الشعيرات الدموية القياسية fritted أو سحبها الباعث. يكمن التحسين الرئيسي في تركيز الطين الماصة: الطريقة القياسية غير متوافقة مع تعليق ماصة عالي التركيز يستخدم في FlashPack. والنتيجة هي طريقة إنتاج سريعة لأعمدة UHPLC طويلة، على سبيل المثال، عمود معبأة لطول 50 سم مع 1.9 ميكرومتر ماصة في أقل من 1 ساعة(الشكل 2).

ولإثبات تطبيق نهج FlashPack، تم إعداد عمود شعري 30 سم 100 ميكرومتر معرف(الجدول 6). التعبئة من ReprosilPur C18 1.9 ميكرومتر ماصة تم القيام به في 60 القضبان في 50 سم طويلة 100 μm معرف سحب الشعيرات الدموية باعث, أعدت من قبل سحب الليزر P2000. كانت معبأة الشعرية إلى ~ 40 سم في 40 دقيقة مع بعض أكثر فضفاضة المواد الماصة اليسار داخل الشعرية. تم توصيل الشعيرات الدموية معبأة إلى نظام HPLC وتشغيلها في 300 nL/min مع المذيبات B (80٪ أسيتونيتريل، 0.1٪ FA). بعد جولتين من سونيكيشن 5 ق، وكان طول معبأة النهائي 43 سم. تم قطع العمود وقطعه إلى 30 سم وتوصيله بنظام HPLC باستخدام اتصال UHPLC. نحن نستخدم بشكل روتيني 360 ميكرومتر بلا أكمام PEEK الجوز فيرول و 360 ميكرومتر الفولاذ المقاوم للصدأ الاتحاد. هذا المزيج يحمل ما لا يقل عن 700 القضبان إذا شددت بقوة. العمود المصنعة لديها backpressure من 520 أشرطة في 2٪ المذيبات B في 500 nL/min، وهو ما يتفق مع نطاق القيمة المتوقعة (الجدول 5).

كدليل على كفاءة العمود ، استخدمنا العمود المصنع 30 سم لفصل 50 fmol من هضم جربي من بروتين السيتوكروم C في تدرج 15 دقيقة من 2٪ إلى 50٪ B. أظهرت الكروماتوغرافيات الأيونية المستخرجة أن القمم متناظرة للغاية مع الحد الأدنى من المخلفات. متوسط FWHM كان حوالي 3 ق(الشكل 3).

الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على ضغط خلفية عالي العمل للعمود. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: برنامج P2000/F ليزر سحب. برنامج P2000/F ليزر سحب لإعداد الشعيرات الدموية باعث سحبها من 360 ميكرومتر OD 100 μm معرف تنصهر الشعيرات الدموية المغلفة البوليميد السيليكا دون طلاء داخلي في درجات حرارة الغرفة 23-25 درجة مئوية.

الجدول 3: قضايا التعبئة الخاصة ب FlashPack ونقاط التفتيش للتحكم أثناء عملية التعبئة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 4: معدلات التعبئة وتدفق العمل المثالية لمعاري الأعمدة المختلفة وطولها. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 5: الضغط الخلفي المتوقع لعمود معبأة مع 2 μمتر المواد الماصة كروية وتشغيل بمعدل تدفق العمل (وفقا للعمود معرف) في نظام المذيبات RP في RT. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 6: التعبئة المثالية لعمود UHPLC 30 سم. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

figure-results-3617
الشكل 1: مخطط التعبئة عمود الشعيرات الدموية. المراحل 1-3 هي تحضيرية، تليها تعبئة قنبلة الضغط وتنتهي بتعبئة HPLC. يتم تعديل المرحلتين 3 و4 لبروتوكول FlashPack فائق الكفاءة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4120
الشكل 2:معدل التعبئة لfritted الشعرية 100 μm معرف مع ReprosilPur C18 AQ 1.9 ميكرومتر في 100 أشرطة في الميثانول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4564
الشكل 3:الكروماتومات الأيونية المستخرجة من الببتيدات التريبتية للسيتوكروم C. استخراج الكروماتgrams أيون من الببتيدات tryptic من السيتوكروم C بعد فصل 50 fmol في 30 سم طويلة 100 مم معرف سحبت عمود الشعيرات الدموية باعث معبأة مع ReprosilPur C18 AQ 1.9 ميكرومتر في تدرج من العازلة B (80٪ أسيتونيتريل, 0.1٪ FA) وفي العازلة A (2٪ أسيتونيتريل، 0.1٪ FA) من 2٪ إلى 40٪ B في 15 دقيقة في 500 nL/min في RT. تم إجراء الكشف باستخدام مطياف الكتلة. وتظهر الكثافات المطلقة ونطاقات m/z المستخرجة لكل ببتيد على يمين الأطياف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

التعبئة في المنزل عمود شعري تحظى بشعبية كبيرة في المختبرات الكبيرة التي تعمل على مشاريع مستقلة متعددة. ومع ذلك، فإن طريقة التعبئة الشائعة من تعليق ماصة منخفض التركيز لها قيود كبيرة في السرعة وغير قادرة على إنتاج أعمدة UHPLC طويلة.

FlashPack هو تعديل لإجراءات التعبئة القياسية مما يجعل التعبئة من تركيز ماصة عالية جدا ممكن. الأساس النظري للطريقة يكمن في زعزعة استقرار القبة الماصة المستمرة عند مدخل العمود طوال مدة التعبئة. ويتحقق هذا الأخير من الناحية الفنية عن طريق مدخل العمود يجري ضرب باستمرار مع شريط المغناطيس. تم تطوير طريقة زعزعة استقرار القبة عمدا لجعل إعداد التعبئة مشابها تماما لعملية التعبئة الشائعة ، ولكن خدعة FlashPack تكمن في تفاصيل إعداد الطين الماصة ، وتحديد المواقع الشعرية ، واستخدام شريط المغناطيس أثناء عملية التعبئة.

يتم إعداد الطين الممتز كطبقة ماصة للرواسب في حجم مذيب كبير. ومن المثير للاهتمام أن التعبئة القائمة على قنبلة الضغط لا تتطلب نفس شروط التعبئة لعمود إلى عمود. في FlashPack ، لا نعرف تركيز الطين الممتز الدقيق حول مدخل العمود. من المستحيل قياس ومراقبة بالضبط، كما أنه يتغير أيضا أثناء عملية التعبئة. ومع ذلك، فإن الأعمدة النهائية لا تزال قابلة للاستنساخ جدا⁴ بغض النظر عن كيفية تحقيق التعبئة.

الأساس للتعبئة السريعة يكمن في كفاءة زعزعة استقرار قبة ماصة. لهذا السبب، من المهم السيطرة على المواد الماصة دخول الشعرية والحفاظ على ظروف زعزعة الاستقرار القبة الأمثل طوال مدة التعبئة بأكملها. هناك العديد من القضايا المحتملة التي قد تمنع تسليم المواد الماصة كفاءة. بعض الأمثلة على هذه هي إعادة تعليق طبقة ماصة عن طريق دوران شريط مغناطيسي سريع، وعدم كفاءة زعزعة استقرار القبة بسبب إما الشعيرات الدموية النسبية خاطئ لتحديد المواقع شريط المغناطيس أو دوران شريط المغناطيس بطيئة جدا. وتناقش المسائل ذاتها وكيفية معالجتها بالتفصيل في قسم البروتوكول.

بعد حزم العمود، معلمة العمود الرئيسي للتحقق هو backpressure العمود. توفر قيم الضغط المدرجة في الجدول 5 نقطة مرجعية لما هو متوقع لأحد أحجام حبة 2 ميكرومتر الفرعية الشائعة sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1.9 ميكرومتر). في الوقت نفسه ، يمكن إضافة ضغط خلفي إضافي بواسطة frit أو باعث سحب ضيق للغاية ويجب على المرء مراقبة ذلك باستمرار. إذا تم التعبئة في باعث سحبها، ونحن لا تزال تقترح قياس backpressure العمود المتوقع لممتز معين في الاستخدام عن طريق التعبئة الشعيرات الدموية fritted أولا، ومن ثم لمعرفة ما إذا كان فريت الذاتي تجميع يضيف الكثير. بالنسبة لأية مشكلات ذات ضغط عال، استخدم الإرشادات الواردة في الجدول 1 لتحديد المشكلة.

في تجربتنا ، عمود معبأة دون تلون ، والثغرات ، ومع backpressure السليم يعمل في 100 ٪ من الحالات ويعطي نوعية الفصل قريبة من ما يمكن توقعه من طول العمود وخصائص ماصة. لا يضمن العمود الذي يحتوي على تلونات العمل بشكل صحيح ولكن لا يزال بإمكانه إعطاء نتائج مرضية.

معظم الوقت، إذا كان هناك أي مشاكل مع نوعية الفصل، فإنها لا تأتي من العمود نفسه، ولكن بدلا من أجزاء أخرى من نظام الفصل، وهي المضخات، المذيبات، أو الاتصالات. خاصة الضارة المحتملة هي أي اتصالات ما بعد العمود. يؤدي الاتصال السيئ بحجم ميت بين الباعث والعمود المفرخ إلى توسيع الذروة الرئيسية وتعقبها بسبب معدلات التدفق المنخفضة جدا في الكروماتوغرافيا الشعرية.

واحدة أكثر أهمية مسألة محددة لنهج FlashPack هو أنه يستخدم الكثير من المواد الماصة باهظة الثمن في قارورة الطين الممتزة العمل. يرجى تذكر أن الطين الماصة في FlashPack مخصص للاستخدام المتعدد. رعاية المواد الماصة. تجنب تحريك شريط المغناطيس غير الضروري للحد من طحن ماصة تذكر لوقف التناوب بمجرد الانتهاء من التعبئة. ولا تترك القارورة الماصة المفتوحة في قنبلة الضغط لتجنب التجفيف الماصة. على الرغم من أن المواد الماصة لا يزال يمكن استخدامها بعد ذلك، فإنه يأخذ بعض الوقت لإعادة تشكيل الطين ماصة.

الطريقة تعمل بشكل جيد على قدم المساواة لكل من الشعيرات الدموية fritted والشعيرات الدموية التي تنبعث منها. يزيد مبدأ FlashPack معدل التعبئة للم معرفات الشعرية من 20 إلى 250 ميكرومتر (لم يتم اختبار أصغر وأكبر). كما أنها تنطبق على جميع المواد الماصة، سواء بشكل كامل أو سطحي مسامية، يمكننا اختبار (مما يعكس أن تشكيل قبة ماصة في تركيز الطين الممتز عالية لا يقتصر على وجه التحديد على المواد الماصة RP). الى جانب ذلك، المعلمات المذيبات تؤثر بوضوح التعبئة وفقا لخصائصها الفيزيائية والكيميائية. على سبيل المثال، الأسيتون اللزج أقل يعطي معدل التعبئة أعلى من الميثانول في نفس ضغط التعبئة. ومع ذلك، فإنه هو أيضا أقل قطبية من الميثانول ويقلل من الجسيمات الماصة التمسك بعضها البعض. التأثير في حد ذاته يمنع تكوين قبة ماصة في بداية التعبئة عندما يكون معدل التدفق لا يزال مرتفعا. ومع ذلك ، فإن الحد من تفاعل الجسيمات الماصة يؤدي أيضا إلى تكوين فريت ذاتي التجميع أقل موثوقية وحظر أكثر تكرارا أثناء التعبئة. لذا ، في حين أن الأسيتون أفضل لتعبئة الشعيرات الدموية المفروقة ، إلا أنها أقل ملاءمة للشعيرات الدموية التي يتم سحبها ، مع الميثانول كمذيب ملاط أبطأ ولكنه مناسب لكلا النوعين من النهاية. التعبئة من الهيكسان أو ثنائي كلورو الميثان (DCM) هي الحالات القصوى للتحول إلى الأسيتون من الميثانول: فهي أقل قطبية ، لذلك تمنع تشكيل القبة الماصة تماما ، ومع ذلك فهي لا تصلح لتعبئة الانبعاثات المنسحبة على الإطلاق. الى جانب ذلك ، لوحظ أن القطبية DCM منخفضة للغاية يؤدي إلى جزيئات ماصة التمسك الجدار الشعرية الداخلية وجعل طبقة سميكة على ذلك. سمك طبقة ينمو تدريجيا وكتل محلية عشوائية شكل مما أدى إلى العمود معبأة في عدة أجزاء مفصولة مناطق دون ماصة. وقد لوحظ هذا التأثير لC18 الببتيد إيريس ماصة.

وثمة مسألة أخرى لوحظت وهي أن مادة YMC Triart C18 الماصة لا تعلق في الميثانول بشكل صحيح، بل تشكل نوعا من الرقائق. ومع ذلك ، فإن ذلك لا يمنعها من الحصول على معبأة مع FlashPack وإعطاء كفاءة فصل لائق جدا (بيانات غير منشورة). وهكذا، في حين لا يجري الأمثل لبعض الحالات، كان الميثانول المذيبات الأكثر عالمية للعمل لجميع المواد الماصة والأعمدة اختبارها. من الضروري أن نذكر أننا لم نحلل بعد كيف تؤثر مذيبات الطين المختلفة على كفاءة فصل العمود. وفي الوقت نفسه، فإن كفاءة الأعمدة المعبأة من الميثانول تساوي تماما الأعمدة التجارية لنفس المواد الماصة^4.

FlashPack ليست الطريقة الوحيدة القائمة لتحسين معدل التعبئة من أعمدة UHPLC. التعبئة السريعة من تركيز الطين عالية ماصة ممكن أيضا مع استخدام الضغط العالي جدا التعبئة^7. ميزة FlashPack هي أنها أبسط بكثير لأنها لا تتطلب مضخات ضغط عالية للغاية خاصة وقنابل ضغط لتوصيل المواد الماصة والاتصالات الشعرية. في الوقت نفسه ، ثبت أن الأعمدة المعبأة في ضغوط شديدة يمكن أن يكون لها كفاءة فصل أعلى من الأعمدة المعبأة تحت الضغط^17. وعلى الرغم من أن FlashPack تنتج أعمدة مطابقة لتلك التجارية المستخدمة في المقارنة⁴، والتي لا نعرف طريقة التعبئة ، إلا أنها لم تختبر بعد كيف تقف أعمدة FlashPack ضد الأعمدة المعبأة ذات الضغط العالي للغاية.

باختصار ، يمكن تكييف طريقة FlashPack الموصوفة بسهولة مع بروتوكول التعبئة الموجود في المختبر مع بعض التعديلات التي أجريت على البروتوكول ، في حين يبقى الإعداد كما هو تماما. فإنه يسرع حزم العمود الشعرية HPLC إلى دقائق الوقت ويسمح إنتاج أعمدة الشعرية UHP طويلة، وهو أمر مستحيل بوضوح مع إجراء التعبئة القياسية. الاقتصاد العام في الوقت والمال للمختبر من خلال تطبيق نهج FlashPack يمكن عدها في عشرات الآلاف من اليورو سنويا. بالإضافة إلى ذلك، القدرة على إنتاج أعمدة الشعيرات الدموية UHP محليا يفتح إمكانيات التخصيص تجربة مستحيلة مع المنتجات التجارية المتاحة.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

وقد تم دعم العمل من خلال منحة RSF 20-14-00121. يشكر المؤلفون ب. ف. شلياها (مركز سلون كيترينج التذكاري للسرطان) على المناقشات المثمرة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid	Merck	1.59002
centrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf
Ceramic Scoring Wafer	Restek	20116	any ceramic wafer is suitable for capillary polishing
Diamond-chip bladed scribe	NewObjective	Diamond-chip bladed scribe	recommended for capillary cutting
fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD	CM Scientific	TSP100375
GELoader tips	Eppendorf	30001222
HPLC system	ThermoScientific	Ultimate3000 RSLCnano
laser puller	Sutter	P2000/F
magnet bar 2x5 mm	Merck	Z283819
MeOH	Merck	1.06018
microspatula	Merck	Z193216
PEEK ferrule 360 mm	VICI	JR-C360NFPK	use to connect the column to UPLC union
pipette tip, 1000 uL	Merck	Z740095
pipette, 1000 uL	Gilson	Pipetman L P1000L
pressure bomb	NextAdvance	PC-77 MAG
regulator	GCE	Jetcontrol 600 200/103
Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm	Dr. Maisch	r13.aq.0001
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL	Merck	AXYST050SS
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL	Merck	AXYST150SS
Screw caps with O-rings	Merck	AXYSCOC
sonication bath	Elma	Elmasonic S30 H
union HPLC	VICI	JR-C360RU1PK6	HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
union UPLC	VICI	JR-C360RU1FS6	UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
vortex	BioSan	V-1plus
Water with 0.1% (v/v) Formic acid	Merck	1.59013

References

Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
. Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021)
Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: