JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم وصف بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة هنا لدراسة الإشارات الميكانيكية في المختبر باستخدام خلايا القمم العصبية O9-1 متعددة القدرات وهيدروجيلات البولي أكريلاميد ذات صلابة متفاوتة.

Abstract

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي خلايا متعددة القدرات الجنينية الفقارية التي يمكن أن تهاجر وتفرق إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا التي تؤدي إلى مختلف الأعضاء والأنسجة. تصلب الأنسجة تنتج القوة الميكانيكية, جديلة المادية التي تلعب دورا حاسما في التمايز NCC; ومع ذلك، لا تزال الآلية غير واضحة. توفر الطريقة الموصوفة هنا معلومات مفصلة للجيل الأمثل من الهيدروجيلات البولي أكريلاميد ذات صلابة متفاوتة ، والقياس الدقيق لمثل هذه التصلب ، وتقييم تأثير الإشارات الميكانيكية في خلايا O9-1 ، وهو خط NCC يحاكي في أجهزة NCCs الحية.

تم قياس تصلب الهيدروجيل باستخدام المجهر القوة الذرية (AFM) وأشار إلى مستويات صلابة مختلفة وفقا لذلك. وأظهرت مركبات الكربون الهيدروفلورية من نوع O9-1 المستزرعة على الهيدروجيلات ذات التصلب المتفاوت مورفولوجيا الخلايا المختلفة والتعبير الجيني عن ألياف الإجهاد، مما يشير إلى آثار بيولوجية متفاوتة ناجمة عن تغيرات الإشارة الميكانيكية. وعلاوة على ذلك، أثبت هذا أن تغيير صلابة الهيدروجيل أدى إلى نظام فعال في المختبر للتلاعب بالإشارة الميكانيكية عن طريق تغيير صلابة الجل وتحليل التنظيم الجزيئي والجيني في NCCs. O9-1 NCCs يمكن أن تفرق إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا تحت تأثير وسائل الإعلام التمايز المقابلة، وأنه من المناسب للتلاعب الإشارات الكيميائية في المختبر. لذلك ، فإن هذا النظام في المختبر هو أداة قوية لدراسة دور الإشارات الميكانيكية في NCCs وتفاعلها مع الإشارات الكيميائية ، مما سيساعد الباحثين على فهم أفضل للآليات الجزيئية والجينية لتطوير القمة العصبية والأمراض.

Introduction

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة من الخلايا الجذعية أثناء تكوين الأجنة الفقارية مع قدرة ملحوظة على الهجرة والمساهمة في تطوير مختلف الأعضاء والأنسجة. يمكن أن تفرق NCCs إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية الحسية والغضاريف والعظام والخلايا الصباغية وخلايا العضلات الملساء ، اعتمادا على موقع المنشأ المحوري والتوجيه البيئي المحلي ل NCC1،2. مع القدرة على التفريق إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا، يمكن أن تؤدي التشوهات الوراثية التي تسبب خلل التنظيم في أي مرحلة من مراحل التنمية العصبية (NC) إلى العديد من الأمراض الخلقية2. على سبيل المثال، تؤدي الاضطرابات أثناء تكوين الأمراض غير السارية وهجرتها وتطورها إلى اضطرابات تنموية تعرف مجتمعة باسم اعتلالات الأعصاب1و3. تتراوح هذه الأمراض من العيوب القحفية بسبب الفشل في تكوين NCC ، مثل متلازمة Treacher Collins ، إلى تطور أنواع السرطان المختلفة بسبب قدرة NCC على الهجرة النقيلية ، كما رأينا في سرطان الجلد3و4و5و6. على مدى العقود القليلة الماضية، حقق الباحثون اكتشافات ملحوظة حول أدوار وآليات NCCs في التنمية والأمراض، مع تركيز غالبية النتائج على الإشارات الكيميائية7،8. في الآونة الأخيرة، وقد أشير إشارات الميكانيكية للعب دور حاسم ولكن غير مفهومة بشكل جيد في تطوير NCC9،10.

وتلعب الإشارات البيئية للبلدان غير الوطنية دورا حاسما أثناء تطورها، بما في ذلك تنظيم تمايز الخلايا غير المكلورة عبر المحيطات إلى أنواع مختلفة من الخلايا. تؤثر الإشارات البيئية، مثل الإشارات المادية، على السلوكيات المحورية والاستجابات الخلوية، مثل التنويع الوظيفي. Mechanotransduction يسمح للخلايا لاستشعار والاستجابة لتلك الإشارات للحفاظ على العمليات البيولوجية المختلفة2. تحيط NCCs بالخلايا المجاورة والركائز المختلفة ، مثل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والتي يمكن أن تؤدي إلى محفزات ميكانيكية للحفاظ على التوازن والتكيف مع التغييرات من خلال تحديد المصير والانتشار وموت الخلايا المبرمج11. يبدأ التحويث الميكانيكي في غشاء البلازما حيث يحدث المكون الحسي للمحفزات الميكانيكية خارج الخلية ، مما يؤدي إلى التنظيم داخل الخلية12. Integrins، الالتصاقات البؤرية، وتقاطعات غشاء البلازما تتابع الإشارات الميكانيكية، مثل قوى القص، والإجهاد، وتصلب الركائز المحيطة بها، إلى إشارات كيميائية لإنتاج الاستجابات الخلوية12. يتم نقل الإشارات الكيميائية من غشاء البلازما إلى التنظيم الخلوي النهائي عبر مسارات إشارات مختلفة لوضع اللمسات الأخيرة على العمليات الحيوية للكائن الحي ، مثل التمايز.

وقد اقترحت العديد من الدراسات أن الإشارات الميكانيكية من صلابة الركيزة يلعب دورا في تمايز الخلية13،14. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) نمت على ركائز لينة مع تصلب مماثلة لتلك التي من أنسجة الدماغ (في نطاق 0.1-1.0 كيلو باسكال) أدى إلى تمايز الخلايا العصبية15،16. ومع ذلك، أكثر MSCs تفرق في الخلايا الشبيهة بالخلايا العضلية عندما نمت على ركائز 8-17 كيلو باسكال تحاكي تصلب العضلات، في حين لوحظ التمايز مثل العظام عندما تم استزراع MSCs على ركائز قاسية (25-40 كيلو باسكال)15،16. وتبرز أهمية الميكانوترانسدوكشن من خلال المخالفات والتشوهات في مسار الإشارات الميكانيكية التي يحتمل أن تؤدي إلى عيوب وأمراض النمو الحادة، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية وهشاشة العظام17و18و19. في السرطانات ، يكون نسيج الثدي الطبيعي ناعما ، ويزيد خطر الإصابة بسرطان الثدي في أنسجة الثدي الصلبة والكثيفة ، وهي بيئة أقرب إلى أورام الثدي15. مع هذه المعرفة ، يمكن دراسة آثار الإشارات الميكانيكية على تطوير NCC من خلال التلاعب البسيط بصلابة الركيزة من خلال نظام في المختبر ، مما يوفر المزيد من المزايا والإمكانيات في فهم أساسيات تطور الأمراض المرتبطة بال NC والمسببات.

لدراسة تأثير الإشارات الميكانيكية في المركبات غير السارية، أنشأنا نظاما فعالا في المختبر للمركبات غير السارية على أساس تحسين الأساليب المنشورة سابقا وتقييم استجابات ال NCCs للإشارات الميكانيكية المختلفة20و21. 10- وقدم بروتوكول مفصل لإعداد وتقييم تيبس الهيدروجيل متفاوتة لتأثير الإشارات الميكانيكية في البلدان غير الوطنية. ولتحقيق ذلك، تستخدم مركبات الكربون الهيدروفلورية من طراز O9-1 كنموذج NC لدراسة الآثار والتغيرات استجابة للهيدروجلز الصلبة مقابل الهيدروجيلات اللينة. O9-1 NCCs هي خط خلايا NC مستقر معزول عن جنين الفأر (E) في اليوم 8.5. O9-1 NCCs تحاكي NCCs في الجسم الحي لأنها يمكن أن تفرق إلى أنواع مختلفة من الخلايا المشتقة من NC في وسائط التمايزالمحددة 22. لدراسة الإشارات الميكانيكية للمركبات غير السارية ، تم تصنيع ركيزة مصفوفة بمرونة غير قادرة من تركيزات مختلفة من حلول الأكريلاميد والبيس أكريلاميد لتحقيق الصلابة المطلوبة ، ترتبط بصلابة الركيزة البيولوجية20،21،23. لتحسين شروط ركيزة المصفوفة ل NCCs ، وتحديدا خلايا O9-1 ، تم إجراء تعديلات من البروتوكول المنشور سابقا20. وكان أحد التغييرات التي أجريت في هذا البروتوكول لاحتضان الهيدروجيلات في الكولاجين الأول، المخفف في حمض الخليك 0.2٪ بدلا من 50 mM HEPES، في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. انخفاض درجة الحموضة من حمض الخليك يؤدي إلى توزيع متجانسة وارتفاع الكولاجين أنا التأسيس، مما يسمح لمرفق أكثر اتساقا من البروتين ECM24. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام مزيج من مصل الحصان ومصل الأبقار الجنينية (FBS) بتركيزات 10٪ و 5٪ في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) ، على التوالي ، قبل تخزين الهيدروجيلات في الحاضنة. تم استخدام مصل الحصان كمكمل إضافي لFBS بسبب قدرته على تعزيز انتشار الخلايا والتمايز بتركيز 10٪25.

مع هذه الطريقة، تم محاكاة البيئة البيولوجية من قبل طلاء البروتين ECM (على سبيل المثال، الكولاجين I) لخلق بيئة دقيقة في المختبر لNCCs لتنمو والبقاء على قيد الحياة20،21. تم تحليل صلابة الهيدروجيلات المعدة كميا عن طريق المجهر للقوة الذرية (AFM) ، وهي تقنية معروفة لتصوير المغير المرن26. لدراسة تأثير مستويات صلابة مختلفة على NCCs، تم استزراع الخلايا البرية O9-1 وإعدادها على الهيدروجيلات للفلورية المناعية (IF) تلطيخ ضد أكتين خيوط (F-actin) لإظهار الاختلافات في الالتصاق بالخلايا ومورفولوجيس استجابة للتغيرات في صلابة الركيزة. وباستخدام هذا النظام المختبري، سيتمكن الباحثون من دراسة أدوار الإشارات الميكانيكية في المركبات غير السارية وتفاعلها مع الإشارات الكيميائية الأخرى للحصول على فهم أعمق للعلاقة بين المركبات غير السارية والإشارات الميكانيكية.

Protocol

1. إعداد هيدروجيل

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية التي تم تطهيرها مع الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) تعقيمها قبل استخدامها للحفاظ على العقم. يجب رش الأدوات، مثل الملاقط والمواسير، بالإيثانول. يجب أيضا أن تكون حلول المخزن المؤقت معقمة- تصفية.

  1. إعداد الأغطية الزجاجية المغلفة بالأحماض الأمينوسيلينية
    1. ضع العدد المطلوب من الأغطية الزجاجية على قطعة من المسح المختبري.
      ملاحظة: تحضير إضافية 3-4 coverlips لضمان مستلزمات النسخ الاحتياطي كافية كما أنها كسر بسهولة. مواد مختلفة من الزجاج coverlips سوف تسفر عن توافق مختلف من البذر الخلية والتعلق. من الأفضل تحديد النوع الذي يناسب التجربة بشكل أفضل قبل بدء التجارب (انظر جدول المواد).
    2. استخدام الموقد الكحول أو الموقد بونسن لتعقيم كل coverslip عن طريق تمريرها ذهابا وإيابا من خلال اللهب (30 ق لتجارب فحص البروتين). ضع كل غطاء زجاجي على مسحة مختبرية لتبرد.
    3. بمجرد تبريد الأغطية الزجاجية ، قم بنقلها إلى طبق بيتري مبطن بالبارافيلم لمنع الانزلاق.
      ملاحظة: إذا كانت الأغطية ليست باردة بما فيه الكفاية، فإن الحرارة المتبقية تذوب البارافيلم على زلات، مما يجعلها غير صالحة للاستعمال.
    4. تغطية الأغطية مع ما يقرب من 200 ميكرولتر و 800 ميكرولتر من 0.1 M NaOH ل12 ملم و25 ملم coverslip، على التوالي، والسماح لهم الجلوس لمدة 5 دقائق. ثم يستنشق 0.1 M NaOH والسماح للأغطية للهواء الجاف لمدة 5 دقائق أخرى لتشكيل فيلم حتى.
    5. بمجرد تجفيف الأغطية، ماصة ما يقرب من 80 ميكرولتر و 150 ميكرولتر من ثلاثي إيثوكسيسيل 3-أمينوبروبيل (APTS) ل12 ملم و 25 ملم يغطي، على التوالي. كن حذرا لتجنب تسرب الحل على parafilm. السماح للحل للجلوس لمدة 5 دقائق.
    6. يستنشق أكبر قدر ممكن من APTS الزائدة والسماح APTS المتبقية لتجف لمدة 5 دقائق. شطف الأغطية جيدا عن طريق غمرها في العقيمة، deionized (DI) H2O ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.
      ملاحظة: إذا لم يتم شطف الأغطية الزجاجية بشكل جيد ، فإن APTS المتبقية تسبب ردود فعل غير مرغوب فيها مع الجلوتارانديهيد ، مما يسبب عجلة بيضاء لتشكيل مما يؤدي إلى أغطية غير صالحة للاستعمال.
    7. نقل الأغطية إلى طبق بيتري جديد مع الجانب التفاعلي التي تواجه. إضافة ما يكفي من 0.5٪ glutaraldehyde إلى طبق بيتري لتغطية الأغطية تماما والسماح للأغطية للجلوس لمدة 30 دقيقة.
    8. يستنشق 0.5٪ غلوتارالدهيد وشطف الأغطية مرة أخرى في DI H2O مرة واحدة لمدة 3 دقائق. تعيين الجانب التفاعلي coverslips حتى على مسح المختبر أو طبق بيتري نظيفة لتجف الهواء تماما قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا; يجب وضع الأغطية في معقمة DI H2O حتى الاستخدام.
  2. إعداد الأغطية السيليكونية
    1. ضع نفس العدد من الأغطية مثل الأغطية المغلفة بال أمينوسيلين (الخطوة 1.1.1) في طبق بيتري مبطن بالبارافيلم.
    2. ماصة 40 ميكرولتر أو 150 ميكرولتر لأغطية 12 ملم و 25 ملم، على التوالي، من ثنائي كلورو ميثيلسيلسيلين (DCMS) إلى جانب واحد من غطاء والسماح للحل للجلوس لمدة 5 دقائق.
    3. يستنشق أي محلول متبقي من غطاء الغطاء ، ويغسل في DI H2O العقيم مرة واحدة لمدة دقيقة واحدة ، ووضع الأغطية التفاعلية على مسح المختبر لتجف الهواء تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  3. إعداد الهيدروجيلات
    1. مزيج الأكريلاميد، بيس أكريلاميد، وDI H2O في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل لإعداد 500 ميكرولتر من الحلول مع صلابة متفاوتة (انظر الجدول 1). دوامة الحل لمدة 30 ق لمزجها جيدا.
    2. العمل بسرعة، إضافة محلول كبريتات الأمونيوم 10٪ (APS) وتيتراثيل إيثيلينديامين (تيميد) إلى الأنبوب ودوامة الحلول مرة أخرى لخلط الحلول.
      ملاحظة: إعداد الطازجة 10٪ وكالة الأنباء الجزائرية وتركها على الجليد أو تجميد في aliquots استخدام واحد بسبب تجميد الحساسة / دورة ذوبان الجليد.
    3. ماصة ما يقرب من 33 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر من الحل على المجففة 12 ملم أو 25 ملم أمينوسيلين المغلفة coverlips (القسم 1.1) ، على التوالي.
    4. باستخدام ملاقط منحنية ، ضع على الفور غطاء الأغطية المعالج DCMS على رأس محلول الجل مع الجانب المعالج الذي يلمس محلول الجل ، وبالتالي وضع محلول الجل بين غطاء الأغطية المعالج من DCMS وأغطية الأغطية المغلفة بال أمينوسيلين.
    5. السماح للمحلول هلام لبوليمرة لمدة 5-15 دقيقة، في حين رصد بنشاط لالبوليمرة هلام من بقايا الحل في الأنبوب.
    6. بمجرد بلمرة الجل ، افصل غطاء DCMS المعالج بالملاقط المنحنية أو شفرة الحلاقة ، تاركا الجل متصلا بالزلاقة المغلفة بالأحماض الأمينوسيلانية الأصلية.
    7. ضع على الفور غطاء مع الهيدروجيل المرفقة في لوحة محددة سلفا 4-well/24-well و6-well مغطاة 500 ميكرولتر و 2 مل من برنامج تلفزيوني معقم أو DI H2O لأغطية 12 مم و 25 ملم، على التوالي، لمنع الجل من الجفاف.
    8. كرر الخطوات 1.3.4-1.3.7 لجميع الأغطية.
    9. غمر الهيدروجيلات في برنامج تلفزيوني معقم أو DI H2O لمدة 30 دقيقة لإزالة محلول الأكريلاميد الزائد. تخزين الهيدروجيلات في برنامج تلفزيوني معقم أو DI H2O في 4 درجة مئوية لوقف الإجرائية هنا.
    10. في غرفة مظلمة، وإعداد خليط الهيكسانوات (السلفو-سانباه) من قبل 4'-azido-2'-nitrophenylamino) خليط الهيكسانوات (السلفو-سانباه) عن طريق خلط 2.5 مل من 50 م 2-[4-(2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-1-yl] حمض الإيثانسلفونيك (HEPES) (درجة الحموضة = 8.5) مع 25 ميكرولتر من 50 ميكروغرام/مل سولفو-سانباه في أنبوب مخروطي، ملفوفة في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. استخدام ماصة لخلط الحل جيدا قبل استخدام.
      ملاحظة: حجم 2.5 مل من محلول السلفو-سانباه يكفي لما يقرب من خمسة وعشرين هيدروجيلس 12 ملم أو خمسة هيدروجيلات 25 ملم.
    11. أسبيرات برنامج تلفزيوني أو DI H2O من لوحة البئر. أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر أو 500 ميكرولتر للأغطية مقاس 12 مم و25 مم على التوالي من محلول sulfo-SANPAH (الخطوة 1.3.10) لتغطية الجل. تأكد من أن الحل يغطي الجل بالكامل.
      ملاحظة: ضبط قوة شفط فراغ لمنع القوة القوية من تمزيق أو إزعاج الهيدروجيل.
    12. ضع المواد الهلامية مع الحل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 15 واط، 365 نانومتر لمدة 10 دقائق، وكشف للحد من أي تدخل من ضوء الأشعة فوق البنفسجية تتفاعل مع sulfo-SANPAH.
    13. يستنشق السلفو-سانباه الزائدة عن طريق إمالة لوحة لجمع أكبر قدر ممكن من الحل. غسل الجل مع 50 MM HEPES مرتين إلى ثلاث مرات.
    14. إضافة 500 ميكرولتر و 2 مل ل12 مم و 25 مم هلام، على التوالي، من 50 ملغ / مل الكولاجين أنا المخفف في حمض الخليك 0.2٪ إلى كل بئر تحتوي على الهيدروجيل. السماح للجل لاحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: تمييع الكولاجين I في 0.2٪ حمض الخليك بدلا من 50 mM HEPES لتعزيز التوزيع المتجانس والتعلق من الكولاجين I.
    15. يستنشق الكولاجين أنا ويغسل المواد الهلامية مع برنامج تلفزيوني معقم ثلاث مرات لإزالة الكولاجين الزائد I لمدة 5 دقائق كل غسل. احتضان الهيدروجيلات في برنامج تلفزيوني مع مصل الحصان 10٪، 5٪ FBS لمدة 2 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: إضافة مصل حصان 10٪ يعزز انتشار أعلى مقارنة باستخدام FBS فقط كما فعلت في المنشور السابق.
    16. يستنشق الوسط. إضافة 500 مل من دولبيكو المصفاة المعقمة النسر المتوسطة المعدلة (DMEM) مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-streptomycin (P /S) إلى كل بئر. تخزين المواد الهلامية في 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة CO2 حتى جاهزة لثقافة الخلية.
    17. مرة واحدة جاهزة، لوحة ما يقرب من 1.5 × 104 O9-1 الخلايا / سم2 في المتوسط القاعدي في أطباق الثقافة. احتضان الخلايا لمدة يومين في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. تحقق من الخلايا للالتقاء للتأكد من أن الخلايا مرتبطة بما فيه الكفاية بالمواد الهلامية ، وأن عدد الخلايا يكفي قبل جمعها للتحليل.
      ملاحظة: راجع البروتوكول المنشور مسبقا للحصول على خطوات الاسترداد والمرور، ومجموعة من خلايا O9-120.
    18. انتقل إلى الأقسام 2 أو 3 أو 4 لمزيد من التحليل للهيدروجلز.

2. التحليل الكمي للتصلب عبر AFM

  1. بدء تشغيل الكمبيوتر نظام AFM، تليها وحدة تحكم AFM (انظر جدول المواد).
  2. جبل cantilever AFM على حامل التحقيق AFM. استخدام كانتيليفر كروية مع حبة السيليكا 0.5 ميكرومتر التي شنت في نهاية cantilever (cantilever مع حبة كروية).
    ملاحظة: بالنسبة للهيدروجيلات الأكثر صلابة، مثل 10 كيلو باسكال و20 كيلو باسكال و40 كيلو باسكال، تم استخدام مسبار أكثر صلابة مع ثابت الربيع 0.24 N/m. واستخدم مسبار أكثر ليونة للهيدروجيلات الأكثر ليونة، مثل 0.5 كيلو باسكال و1 كيلو باسكال، مع ثابت ربيعي قدره 0.059 N/m.
  3. تعيين برنامج AFM تحت وضع الاتصال.
  4. قم بتركيب رقاقة السيليكون على مرحلة عينة AFM لجمع منحنيات القوة من خلال النقر على Engage للكانتيليفر للمس ركيزة السيليكون ، وبالتالي توليد منحنيات القوة.
  5. استخدام منحنيات القوة أعلاه (2.4) للمعايرة، انقر على معايرة في البرنامج المسيطر للحصول على متوسط ثابت الربيع من cantilever تحت شرط اللحن الحراري، وحفظ القيم معايرة في البرنامج المسيطر.
  6. قم بتركيب العينات عن طريق وضع غطاء الغطاء مع الهيدروجيل المرفق في طبق بيتري مقاس 60 مم على مرحلة المسح الضوئي AFM. أضف 3 مل من برنامج تلفزيوني إلى الطبق قبل إجراء القياسات لمنع الجل من الجفاف.
  7. قم بتعيين AFM للعمل في وضع الاتصال (السائل) لبدء القياس. إشراك حبة كروية للمس باستمرار ورفع من عينة هلام.
  8. تعيين cantilever بحيث عتبة انحراف لها لا يزال في 10 نانومتر. الحفاظ على حجم المنحدرة من التحقيق في 10 ميكرومتر. ثم قم بتسجيل منحنيات القوة كما في الخطوة 2.4.
  9. الحصول على ما لا يقل عن 20 منحنيات القوة من 3 إلى 10 بقع مختلفة على الأقل عبر سطح الهيدروجيل.
  10. حساب متوسط معامل يونغ من ~ 20 منحنيات القوة لكل بقعة مع التصوير AFM وبرامج التحليل. استخدام تمديد منحنى قوة المنحدر ونموذج خطي (كروي). حساب متوسط جميع البقع لكل عينة لتسفر عن صلابة النهائي.
    ملاحظة: يتم حفظ معامل Young والبيانات ذات الصلة(أي الانحرافات المعيارية) تلقائيا كجداول بيانات.
  11. كرر الخطوات 2.6-2.10 لجميع العينات.

3. التحليل الجزيئي للتصلب عن طريق تلطيخ immunofluorescence

  1. استخدم الملاقط لنقل الغطاء إلى لوحة جديدة لتقليل الإشارات الخاطئة من الخلايا التي تزرع مباشرة على اللوحة. غسل الخلايا مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم ثلاث مرات لإزالة الخلايا الميتة وأي وسيلة الثقافة المتبقية.
  2. إصلاح الخلايا باستخدام 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، دون عائق. ثم، إعادة غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / جيدا لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
    ملاحظة: يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية للتوقف الإجرائي.
  3. علاج الخلايا مع 500 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / جيدا.
  4. منع الخلايا مع 250 ميكرولتر من مصل الحمير 10٪ (المخفف في برنامج تلفزيوني و 0.1٪ توين 20) لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / جيدا لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: تم استخدام مضاد فينكولين (Vcl) (1:250) ومكافحة AP2 ألفا (1:250) في هذه التجربة وتم تخفيفها في مصل الحمير بنسبة 10٪.
  6. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة و / أو phalloidin المستخدمة لتلطيخ F-actin في تخفيف 1:400 في 250 ميكرولتر من مصل الحمير 10٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: يمكن أن يكون 568 نانومتر Phalloidin تشارك في احتضان مع 488 نانومتر أو 647 نانومتر الأجسام المضادة الثانوية أو من تلقاء نفسها.
  7. احتضان الخلايا مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 التخفيف) في 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة تليها غسل آخر واحد من برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة.
  8. إضافة 3-4 قطرات من تصاعد المتوسطة إلى كل بئر. تخزين العينات في 4 درجة مئوية لتعيين لمدة 2 ساعة على الأقل قبل التصوير لضمان وضع المتوسطة تصاعد بشكل صحيح.
  9. التقاط صور لما لا يقل عن 3 إطارات عشوائية لكل عينة هيدروجيل مع مجهر مضان ، مما ينتج قنوات فردية ومندمجة.

4. الكم في الوقت الحقيقي PCR (RT-qPCR)

  1. نقل الهيدروجيلات مع الخلايا الملتصقة لجمع الحمض النووي الريبي إلى لوحة جديدة لتقليل الحمض النووي الريبي غير المرغوب فيه من الخلايا المرفقة بلوحة الخلية. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لإزالة الخلايا الميتة والثقافة المتوسطة.
  2. استخراج mRNA مجموع باستخدام عدة استخراج الجيش الملكي النيبالي. إجراء النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام supermix النسخ العكسي اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  3. أداء RT-qPCR مع التمهيديات لVCL كعلامة صلابة الاختيار وتحليل باستخدام طريقة 2-ΔΔCT.
    ملاحظة: التسلسل التمهيدي ل Vcl: إلى الأمام 5 'GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; عكس 5 'AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

النتائج

إعداد هيدروجيل وتقييم صلابة من خلال AFM ونموذج هيرتز
هنا، يتم توفير بروتوكول مفصل لتوليد هيدروجيلات البولي أكريلاميد من صلابة متفاوتة من خلال تنظيم نسبة الأكريلاميد والبيس أكريلاميد. ومع ذلك، فإن هيدروجيلات البولي أكريلاميد ليست جاهزة لتصاق الخلايا بسبب نقص بروتينات ECM. وهكذا،...

Discussion

والهدف من الدراسة الحالية هو توفير نظام فعال وفعال في المختبر لفهم تأثير الإشارات الميكانيكية في المركبات غير السارية فهما أفضل. بالإضافة إلى اتباع البروتوكول خطوة بخطوة المذكورة أعلاه، يحتاج الباحثون إلى أن نضع في اعتبارنا أن ثقافة الخلية من O9-1 NCCs تتأثر بنوع من الأغطية الزجاجية ال?...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgements

نشكر الدكتورة آنا ماريا زاسكي، مشغلة منشأة المجهر-UT Core التابعة للقوة الذرية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس، على الخبرة المساهمة في AFM في هذا المشروع. كما نشكر مصادر التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (K01DE026561، R03DE025873، R01DE029014، R56HL142704، وR01HL142704 إلى J. Wang).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (spherical bead)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Powder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Fluorescence microscopeLeicaModel DMi8
Fluoromount-G mounting mediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Powder
Horse serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterile 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterile deionized waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

References

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 O9 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved