A عالية الإنتاجية ميكروبليت المغذية المقايسة للقياس الكمي للاستهلاك في Drosophila

Summary

يوفر المقايسة المغذية microplate طريقة اقتصادية عالية الإنتاجية لقياس استهلاك الأغذية السائلة في Drosophila. يربط جهاز مطبوع ثلاثي الأبعاد لوحة صغيرة من 96 بئرا يتم فيها إيواء الذباب بصحونة صغيرة من 1536 بئرا يستهلك منها الذباب محلول تغذية بصبغة متتبعة. يتم قياس انخفاض حجم الحل الطيفيمقطيا.

Abstract

يستخدم قياس مداواة الغذاء في دروسوفيلا لدراسة الأسس الوراثية والفسيولوجية للسمات المرتبطة بالاستهلاك، وعواملها البيئية، والآثار السمية والصيدلانية للعديد من المواد. وهناك عدد قليل من الأساليب التي تطبق حاليا قابلة لقياس الإنتاجية العالية. تم تطوير المقايسة المغذية Microplate (MFA) لقياس استهلاك الأغذية السائلة للذباب الفردي باستخدام الامتصاص. في هذا المقايسة، يستهلك الذباب وسط الطعام السائل من آبار مختارة من لوحة صغيرة 1536 بئرا. من خلال دمج صبغة التتبع المخففة في وسط الطعام السائل وتحميل حجم معروف في كل بئر ، تعكس قياسات الامتصاص للبارا المكتسبة قبل وبعد الاستهلاك التغير الناتج في الحجم (أي الحجم المستهلك). لتمكين تحليل الإنتاجية العالية باستخدام هذه الطريقة، تم تصميم مقسم مطبوع ثلاثي الأبعاد يسمح بفرز الذباب بشكل فردي إلى لوحات صغيرة ذات 96 بئرا. هذا الجهاز يوجه بدقة 96- و 1536-جيدا لوحات صغيرة لإعطاء كل ذبابة الوصول إلى ما يصل إلى 4 آبار للاستهلاك، وبالتالي تمكين القياس الكمي تفضيل الغذاء بالإضافة إلى الاستهلاك المنتظم. وعلاوة على ذلك، يحتوي الجهاز على شرائط حاجزة تبدل بين المراكز المفتوحة والمغلقة للسماح بالاحتواء المراقب وإطلاق عمود من العينات في كل مرة. تمكن هذه الطريقة قياسات الإنتاجية العالية لاستهلاك المحاليل المائية من قبل العديد من الذباب في وقت واحد. كما أن لديها القدرة على التكيف مع الحشرات الأخرى وفحص استهلاك المواد الغذائية أو السموم أو المستحضرات الصيدلانية.

Introduction

Drosophila melanogaster شهدت استخدام واسعة ككائن حي نموذج الوراثية لدراسة الأسس البيولوجية لتناول الطعام والصفات المرتبطة الاستهلاك¹. وتشير التقديرات إلى أن 65٪ من الجينات المسببة للأمراض البشرية لديها تجانس وظيفي في الذباب، مع نسبة كبيرة من تلك التي يتم التعبير عنها في الأنسجة المكافئة وظيفيا بين الذباب والبشر². وعلاوة على ذلك، فإن حجم D. melanogaster، والوقت القصير بين الأجيال، والصيانة البسيطة، وقابلية الالتقاط الجيني تجعل منه نموذجا جذابا للدراسات حول استهلاك المواد الغذائية^3و4 والآثار السمية والصيدلانية لمجموعة متنوعة من المواد، بما في ذلك المبيدات الحشرية⁵والملوثات⁶والمستحضرات الصيدلانية⁷وأدوية تعاطي^8و9و10.

وفي كثير من الحالات، تتطلب دراسة هذه الصفات تحديدا دقيقا للاستهلاك. طرق لقياس الاستهلاك متنوعة وتشمل CApillary FEeder (CAFE) المقايسة¹¹، وFEeding MAnual (MAFE) المقايسة¹²، Proboscis تمديد الاستجابة (PER) المقايسة¹³، تتبع استخراج^{صبغة 14،15}، oligonucleotide تعقب استخراج¹⁶، واستخراج النظائر الراديوية^5،17. وقد ركزت الجهود الأخيرة على تعزيز الإنتاجية من هذه المقايسات، كما هو الحال في المقايسة اكسبرسو¹⁸ أو لوحة القائم على تغذية الحيوان كله FLat (WAFFL) نظام¹⁹. وعلى الرغم من فائدتها، يمكن أن تكون هذه المقايسات معقدة أو مكلفة أو كثيفة العمالة، مما يعوق استخدامها في الدراسات عالية الإنتاجية.

الشكل 1: مكونات المقايسة المغذية Microplate. (A) تقديم 3D من المقايسة المغذية microplate تجميعها. يتم توجيه اللوح الصغير الذي يحتوي على 1536 بئرا من قبل الزوجين المطبوع ثلاثي الأبعاد بحيث يمكن لكل بئر من اللوحة الدقيقة السفلية ذات ال 96 بئرا الوصول إلى أربعة آبار من اللوحة الدقيقة العلوية ذات 1536 بئرا. ويمكن التحكم في الوصول إلى الآبار عن طريق ضبط وضع شرائط الحاجز المشقوقة من خلال الزوجين. (ب) تمثيل رسومي لكل بئر من المقايسة المغذية microplate. يتم الاحتفاظ حلول الاستهلاك في كل بئر باستخدام فيلم الختم التي تم ثقبها للسماح بالوصول عن طريق الذبابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2:نظرة عامة على الإجراءات في المقايسة المغذية Microplate. يظهر الشكل رسم تخطيطي للتدفق يتوافق مع الخطوات 4.1-5.8 من البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

للتغلب على هذه العقبات، المقايسة المغذية Microplate (وزارة الخارجية؛ الشكل 1) تم تطويره. في هذا المقايسة ، يتم إيواء الذباب بشكل فردي في لوحات صغيرة من 96 بئرا. ويقترن كل لوحة صغيرة إلى لوحة صغيرة 1536 جيدا باستخدام مخصص, 3D المطبوعة الجهاز. يوجه الجهاز بدقة الصفيحتين بحيث تطير كل واحدة منها في بئرها من الصفيحة ذات ال 96 بئرا ويمكن الوصول إلى 4 آبار من اللوحة الدقيقة ذات 1536 بئرا. باستخدام لوحة بلا قعر 1536 بئرا وختم الأفلام، يتم الاستغناء عن الحلول في آبار مختارة ومثقبة مع الإبر قطرها 0.25 ملم دقيقة لتوفير الوصول إلى الذباب. ومن الأهمية بمكان أن السماح بالاستهلاك مباشرة من لوحة صغيرة يسمح بإجراء قياسات فورية قائمة على الامتصاص باستخدام قارئ لوحة صغيرة. يتم دمج صبغة التتبع المخفف في وسط الاستهلاك ، ويتم استخدام التغيير في الامتصاص بعد التعرض لتحديد الحجم المستهلك(الشكل 2 والشكل 3). وبما أن السائل في كل بئر يقترب من عمود من السوائل، فإن الاختلافات الحجمية سوف تظهر كاختلافات في ارتفاع العمود. (الشكل 3A) وفقا لقانون بير لامبرت²⁰:

حيث A هو الامتصاص، ε هو معامل امتصاص الضرس للتوهين التحليلي، l هو طول المسار البصري، و c هو تركيز التحليل المخفف. وهكذا، مع معامل امتصاص الضرس المستمر والتركيز، والتغيرات في امتصاص ويرجع ذلك فقط إلى التغيرات في مسار الضوء البصري، أي مستوى السوائل داخل بئر معين. ومن خلال قياس الامتصاص قبل التعرض وبعده، يعكس التغير النسبي في الامتصاص التغير النسبي في الحجم(الشكل 3B).

الشكل 3: القياس الكمي القائم على الامتصاص لحجم البئر. (A)ضوء الحادث من كثافة الإدخال المعروفة (I₀) يجتاز كل بئر. تخفيف الضوء في أحجام التعبئة المختلفة تسفر عن كثافة الانتاج المختلفة (I)، مما يدل على وجود علاقة خطية بين الحجم وامتصاص. (ب)القياس التجريبي للامتصاص مقابل الحجم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

استنادا إلى التغير في الحجم، يمكن حساب كمية أي مركب تم تناوله من تركيزه المعروف في محلول التغذية. الأجزاء اللازمة للمقايسة منخفضة التكلفة ولها درجة عالية من إعادة الاستخدام ، مما يقلل بشكل كبير من التكلفة المتكررة للمقايسة. وهكذا، يوفر هذا الإجراء طريقة إنتاجية عالية التكلفة لقياس الاستهلاك بدقة.

Protocol

1. إعداد لوحة المجاعة

1. تزن 1.5 غرام من الآغاروز في كوب زجاجي 250 مل.
2. إضافة 100 مل من المقطر H₂O إلى الكأس.
3. الميكروويف بشكل متقطع حتى يتم منصهرة تماما agarose.
   ملاحظة: مراقبة الكأس منذ agarose عرضة للغليان.
4. صب agarose المنصهر في الحوض الصغير كاشف والاستغناء عن 80 ميكروغرام من الآغاروز المنصهر في كل بئر من لوحة صغيرة 96 جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات. السماح لوحات لعلاج في حين غطت في درجة حرارة الغرفة. قم بتبريد بقايا الآغاروز لمدة تصل إلى أسبوع في كيس مختوم وأعيد إذابته لصنع لوحات إضافية.

2. يطير الفرز والتجويع

1. إعداد الأزواج عن طريق إدخال شرائط الحاجز في قنوات الشريط الحاجز. إذا كانت شرائط الحاجز فضفاضة جدا، لفها حول الإصبع لإعطائها انحناء لعقد لهم في القنوات.
2. ألصق الزوجة على طبق المجاعة. لا تستخدم الزوجة لمعالجة اللوحة لأن الزوجة قد تنزلق. تأكد من أن الزوجين موجهة بشكل صحيح (أي ضمان الزاوية الزاوية للمنبر يطابق الزاوية الزاوية من لوحة صغيرة).
3. تحت CO_{2 التخدير} (جدول المواد), نوع 3-5 يوم الذباب القديم. تحميل الذباب الفردية عن طريق العمود في لوحة المجاعة.
   ملاحظة: على الرغم من أن الذباب يتم تحميله بواسطة عمود، فمن المستحسن توزيع مجموعات من العينات أسفل صفوف اللوحة بدلا من أسفل الأعمدة (انظر الشكل 4 للحصول على مثال تخطيط اللوحة).
4. أغلق كل عمود أثناء تعبئته عن طريق ضبط شريط الحاجز الخاص به إلى الموضع المغلق.

الشكل 4: ممثل تخطيط لوحة المجاعة. يظهر الرسم البياني تنظيم ضوابط التبخر والذباب الذكور والإناث في لوحة من 96 بئرا تستخدم في هذه الدراسة. ويمكن أيضا استخدام تكوينات بديلة، بما في ذلك صفوف متناوبة من الذكور والإناث مع ضوابط التبخر في الصفين A و H. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. سجل تخطيط العينة بعناية داخل اللوحة الدقيقة. بمجرد ملء لوحة المجاعة ، اسمح للذباب بالتعافي تلقائيا بعد إزالة_ثاني أكسيد الكربون وتجويعه لمدة 6 ساعة بدءا من وقت التخدير الأولي.

3. إعداد الطعام السائل

ملاحظة: جعل الطعام السائل الطازج كل يوم.

1. إعداد 10 ملغ / مل من محلول مخزون صبغ من FD & C الأزرق # 1 في المقطر H₂O.
   ملاحظة: قد يتم تخزين هذه الوظيفة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. إعداد 10 مل من المواد الغذائية السائلة (4٪ السكروز، 1٪ استخراج الخميرة، 40 ميكروغرام / مل من FD & C الأزرق # 1) في أنبوب مخروطي 15 مل عن طريق حل 0.4 غرام من السكروز و 0.1 غرام من استخراج الخميرة في 10 مل من المقطر H₂O. دوامة الأنبوب حتى المواد الصلبة تذوب تماما. إضافة 40 ميكرولتر من محلول مخزون الصبغة وعكس الأنبوب مرارا وتكرارا لتجانس الحل.
3. نقل الطعام السائل إلى حقنة 10 مل يميل مع مرشح 0.45 ميكرومتر. فلتر ~ 1.5 مل من الحل في وقت واحد في أنبوب 1.7 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق. خصص المحقنة التي تحتوي على المحلول وتصفية المحلول الإضافي حسب الحاجة أثناء إعداد لوحة التغذية.

4. إعداد لوحة التغذية

ملاحظة: التعامل مع لوحات التغذية بلطف بعد ملء لمنع تشكيل فقاعات أو قطرات في البئر التي يمكن أن تؤثر على قراءات امتصاص.

1. إعداد لوحة التغذية عن طريق ختم الجزء السفلي من لوحة صغيرة 1536 جيدا مع فيلم الختم. استخدام مجداف الختم على الالتزام الفيلم بدقة. تقليم الفيلم الزائد قبالة الحواف اليسرى واليمينية مع شفرة حلاقة.
2. اصرف 10 ميكرولتر من عمود الطعام السائل المصفى (انظر الشكل 5 للرسم التوضيحي) في الآبار المناسبة للصفيحة الدقيقة ذات 1536 بئرا. الاستغناء في البئر العلوي الأيسر لكل مجموعة من أربعة آبار (انظر الشكل 5 للحصول على توضيح).

الشكل 5:ملء النظام وموقع جيد للوحة التغذية 1536 جيدا. يوضح الرسم التخطيطي الخطوة 4.2 من البروتوكول. تظهر الأسهم الترتيب الذي يتم إدخال محلول التغذية به في لوحة التغذية عمود واحد في كل مرة من العمود 1 إلى 12. يتم تكبير العينة B1 لإظهار مثال على موقع حلول التغذية لإجراء فحوصات الاختيار الأول والاختيارين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. مرة واحدة يتم تعبئة جميع الآبار، وتطبيق فيلم الختم إلى أعلى لوحة. استخدام مجداف الختم على الالتزام الفيلم بدقة. تقليم الفيلم الزائد قبالة الحواف اليسرى واليمينية مع شفرة حلاقة. كرر لعدد المطلوب من لوحات.
4. الطرد المركزي لوحات في 200 × ز لمدة 10 ق لتسوية السائل. لا تسمح بتبريد اللوحة لأن هذا يمكن أن يسبب تراكم التكثيف في الآبار ، مما يحجب قراءات الامتصاص.

5. التعرض

1. بمجرد أن يكون الذباب جاهزا للمقاهة الاستهلاكية ، ثقب الآبار على السطح العلوي من اللوحة باستخدام أداة مسبار الإبرة المجهزة بإبرة قطرها 0.25 مم. استخدم نفس الترتيب للثقب كما تم استخدامه عند الاستغناء عن الحلول. الوجه لوحة وثقب الآبار في الجزء السفلي. مسح الإبرة بين الحلول لمنع التلوث المتبادل. يجب الحرص على عدم لمس ثقوب وهذا الفتائل الحل من الآبار.
2. قراءة امتصاص لوحة في 630 نانومتر دون غطاء.
3. ضع غطاء داخليا على أعلى فيلم الختم لضمان أن حلقات التكثيف تطوق الآبار المثقبة. ضع الغطاء الخارجي على اللوحة.
4. ضع لوحة التغذية وجها لوجه على المنافر بحيث تقوم الأدلة بمحاذاة الثقوب المناسبة للوحة التغذية ولوحة المجاعة. تأكد من أن المناصفة واللوحات موجهة بشكل صحيح (أي ضمان الركن الزاوية للمقنة ومطابقة اللوحات). التفاف العصابات مرنة حول لوحات أعلى وأسفل لعقد الزوجين معا. تحقق من وجود محاذاة والفجوات بين لوحة التغذية وموصن.
5. بمجرد تحميل جميع لوحات التغذية على الزوجين، افتح الآبار للوحات عن طريق ضبط شرائط الحاجز على الزوجين. ضع تجميعات المناصف/اللوحة في الحاوية الثانوية. يمكن أن تستوعب كل حاوية ثانوية ما يصل إلى ستة تجميعات.
6. ضع النصف السفلي من صندوق ماصة يحتوي على مناشف ورقية منقوعة في كل حاوية ثانوية لتوفير الرطوبة. أغلق غطاء الحاويات الثانوية ونقلها إلى بيئة خاضعة للرقابة (25 درجة مئوية ، الرطوبة التي تسيطر عليها ، 12 ساعة ضوء : دورات الظلام). السماح للذباب تستهلك لمدة 22 ساعة.
7. بعد التعرض 22 ساعة، تحقق من كل لوحة من الذباب الميت وتحديث تخطيط لوحة وفقا لذلك. بعد فحص جميع اللوحات ، تخدير الذباب بشكل جماعي عن طريق ضخ_ثاني أكسيد الكربون داخل الحاوية الثانوية. بعد ~ 60 ق ، وضمان أن جميع الذباب معطلة. قم بلطف بتكبيس الذباب في لوحة المجاعة واستبدال شرائط الحاجز البلاستيكي. قم بإزالة لوحات التغذية للقراءة.
8. إعادة قراءة امتصاص لوحة في 630 نانومتر. كرر حتى يتم قراءة جميع اللوحات.

6. تحليل البيانات

ملاحظة: يمكن إجراء التحليل باستخدام حزمة البرامج المفضلة لدى المحقق.

1. حذف أي الذباب الذي توفي خلال التعرض 22 ساعة.
2. لكل بئر، حساب حجم المستهلكة على النحو التالي:
   
   C - حجم المستهلكة (μL)
   V - حجم البئر الأولي (أي 10 ميكرولتر)
   ABS₀ - امتصاص ما قبل التعرض
   ABS₁ - امتصاص ما بعد التعرض
   ملاحظة: يتم الإشارة الاستهلاك كوحدة تخزين موجبة في الحساب.
3. لحساب التبخر، طرح متوسط حجم التبخر من قيم استهلاك الذبابة داخل لوحات كل منها. لاختبار 2-choice/preference، اضبط كل بئر حسب الحل الخاص به،علىسبيل المثال، ضبط آبار "الاختيار 1" عن طريق "الاختيار 1" في عناصر التحكم في التبخر.
4. بعد ضبط للتبخر، إسقاط أي عينات مع قيمة استهلاك أقل من الصفر.
5. لاختبار خيارين، احسب الأفضلية لكل منها بالإضافة إلى:
   
   P - مؤشر الأفضلية (يشير الاتجاه الإيجابي إلى الأفضلية)
   F_A - حجم الأغذية السائلة المستهلكة التي تحتوي على المضافة (الخيار 2)
   F_N - حجم الأغذية السائلة العادية المستهلكة (الخيار 1)

7. ميكروبليت وبروتوكول الغسيل بين الزوجين.

ملاحظة: الحرص على منع الأضرار التي لحقت قيعان لوحات صغيرة، كما يمكن أن تؤثر الضرر الختم.

1. إزالة الأفلام والتسميات من لوحات صغيرة 1536 جيدا. فصل بين الزوجين وشرائط الحاجز. ضع الحاجز في حاوية قابلة للغلق، مثل الزجاجة. غسل شرائط الحاجز عن طريق اهتزاز بقوة في سلسلة من مياه الصنبور الدافئة، محلول المنظفات خفيفة، ومياه الصنبور الدافئة، ثم المقطر H₂O.
2. شطف 1536-جيدا لوحات صغيرة ومقرنات تحت مياه الصنبور الدافئة. بالنسبة للألواح الدقيقة، قم بتشغيل مياه الصنبور عبر آبار كل لوحة صغيرة لمسح أكبر قدر ممكن من الحلول والحطام. إذا لزم الأمر، استخدم طرف ماصة لإزاحة الحطام. لا تستخدم الأواني المعدنية أو الزجاجية على لوحات.
3. قم بتغطية كل طبق ومنظف بمحلول منظف خفيف (على سبيل المثال، 1٪ v/v Aquet). للوحات، فرك السطوح بيد قفاز. بالنسبة للمنفرين، استخدم فرشاة.
4. شطف كل لوحة جيدا مع مياه الصنبور، ومن ثم مع المقطر H₂O. تأكد من أن يتم شطف الآبار على وجه التحديد تحت تدفق المياه.
5. السماح للوحات ومجففات الهواء الجافة التي تغطيها درجة حرارة الغرفة. تخزين في سلة تخزين نظيفة حتى الاستخدام.
   ملاحظة: لا تتعامل أبدا مع اللوحات الدقيقة ذات 1536 جيدا بدون قفازات. الزيوت المتبقية من الجلد يمكن أن تعوق الختم، مما يؤدي إلى تسرب بئر والتبخر.

النتائج

ولتحديد ما إذا كانت هناك أي ارتباطات بين آبار الصفائح الفردية، تم قياس التبخر كميا لكل بئر (ن = 96 بئرا/طبق لثلاث لوحات). تم العثور على التبخر ليكون -0.036 ميكرولتر ± 0.003 ميكرولتر (متوسط ± SEM في جميع أنحاء). (الشكل 6A) تم حساب ارتباطات بيرسون لتقييم الاتجاهات بين التبخر ومواقع الآبار. معامل الارتباط(الشكل 6B، C)للتبخر مقابل الصفوف كان -0.04 (p = 0.4949) وبالنسبة للتبخر مقابل الأعمدة كان -0.23 (p = 0.0001). ووزعت المجموعات فيما بعد بين الأعمدة للتخفيف من الارتباطات المعتدلة ولكن ذات الأهمية الإحصائية عبر الأعمدة.

الشكل 6:التبخر في وزارة الخارجية (أ) توزيع كثافة التغيرات التبخر مع متوسط ± SD المشار إليها من قبل خط متقطعة. الارتباطات بين التبخر والصفوف(ب)أو الأعمدة(C)مع معامل ارتباط Pearson وقيمة p كما هو مبين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ولتحديد صلاحية البروتوكول، تم تحديد استهلاك ذباب كانتون-S B الذي يبلغ عمره 3-5 أيام (ن = 36/الجنس/الصفيحة والن = 24 من عناصر التحكم في التبخر/اللوحة لثلاث لوحات)(الشكل 7). وكان التبخر بين آبار التحكم مختلفا اختلافا كبيرا عن الصفر (-0.030 ميكرولتر ± 0.006 ميكرولتر، ص = 4.81 × 10^-6؛عينة واحدة t-testمقابل صفر). وحذفت عينتان (كلاهما ذكر) من مجموعة البيانات، إحداهما بسبب الوفاة أثناء التعرض الليلي والأخرى بسبب قيمة الاستهلاك السلبية بعد تعديل التبخر. وأسفر ذلك عن معدل استبقاء عينة > 99 في المائة.

الشكل 7: الاستهلاك القياس الكمي باستخدام وزارة الخارجية (أ) تم تصور الاستهلاك باستخدام غرفة زجاجية مخصصة ملفقة. ولوحظ أن الذباب يشرب من آبار مثقبة وأظهر تلطيخا أزرق في البطن بعد ابتلاع المحلول المصبوغ. انظر أيضا التكميلية فيديو S.1. (ب) قيم الاستهلاك (متوسط ± SEM) بين ضوابط التبخر، الذباب الذكور، والذباب الإناث. تم تنفيذ اختبار t اللاحق معالتباين غير المتكافئ للمقارنات الإحصائية ، مع الإشارة إلى الأهمية بواسطة الأشرطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في وقت لاحق، تم بناء نموذج تحليل التباين (ANOVA) كما هو موضح من قبل Y = μ + S + P + SxP + e، مع Y كما يعني المجموعة، μ كما المتوسط العام، S كأثر ثابت للجنس، P كأثر ثابت للوح، SxP كتفاعل بين الجنس والطبق، وه كتغير المتبقية. ولم تظهر ANOVA أي تباين كبير بين اللوحة والطبق (p = 0.671) أو تفاعلات خاصة بالجنس مع اللوحات (p = 0.104) للاستهلاك، في حين ساهم الجنس وحده بشكل كبير في الاختلاف الملحوظ في الاستهلاك (p = 4.17 × 10^-18). وأظهر اختبار t اللاحقأن الذكور يستهلكون أقل بكثير من الإناث (0.500 ميكرولتر ± 0.017 ميكرولتر مقابل 0.811 ميكرولتر ± 0.028 ميكرولتر، ص = 1.13 × 10^-17، عينة اثنين t-test مع تباين غير متكافئ).

لإثبات أنه يمكن استخدام المقايسة لتحديد كمية الأفضلية من خيارين ، تم إعطاء الذباب خيارا بين محلول السكروز بنسبة 4٪ مع مستخلص خميرة 1٪ وحل السكروز بنسبة 4٪ المكمل مع الإيثانول بنسبة 15٪ ومستخلص الخميرة 1٪. وأظهر كل من الذكور والإناث تفضيلا ساحقا للحل مع استخراج الإيثانول والخميرة مع مؤشرات تفضيل 0.974 ± 0.026 للذكور و 0.876 ± 0.06 للإناث (متوسط ± SEM) (الشكل 8).

الشكل 8:تقدير كمية التفضيل باستخدام وزارة الخارجية. استهلاك 4٪ السكروز مقابل 4٪ السكروز تكملها مع 15٪ الإيثانول والخميرة استخراج للذباب الذكور والإناث (ن = 33 لكل جنس). استهلك الذباب الذكر أكثر من محلول الإيثانول من محلول السكروز التحكمي (0.511 ميكرولتر ± 0.029 ميكرولتر مقابل 0.00 ميكرولتر ± 0.017 ميكرولتر؛ p = 4.06e^-10؛ عينتين t-test). كما استهلكت الذبابات الأنثوية محلول إيثانول أكثر من محلول السكروز التحكمي (0.939 ميكرولتر ± 0.044 ميكرولتر مقابل 0.132 ميكرولتر ± 0.044 ميكرولتر؛ p = 7.38e^-17؛ عينتان t-test). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو التكميلية S.1: يظهر الفيديو ذبابة تغذية من بئر مثقبة وتراكم تلطيخ البطن الأزرق أثناء تناول محلول مصبوغ. تظهر صورة ثابتة في الشكل 7A. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

ملف التكميلية S.2: ميكروبليت المغذية المقايسة المقايسة. هذا هو بناء 3D للطباعة من الزوجين المستخدمة في وزارة الخارجية. استخدمت مواد الطباعة نايلون PA12 لFA. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف التكميلية S.3: Microplate المغذية المقايسة حاجز قطاع. هذا يحتوي على تصميم شرائط حاجز من البلاستيك المستخدمة للتبديل التعرض للذباب إلى لوحة التغذية. يمكن لمكون واحد الاستفادة من ما يصل إلى اثني عشر شرائط الحاجز. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف إضافي S.4: تعليمات تفريغ وتصنيع للماكروبليت المغذية المقايسة. يتم تضمين تعليمات لتفريغ الزوجة وشرائط الحاجز. يتم تضمين تعليمات التصنيع للغطاء الداخلي والغطاء الخارجي والحاوية الثانوية المستخدمة للحد من التبخر أثناء التعرض. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف التكميلية S.5:مقارنة التكلفة من المقايسة المغذية Microplate (وزارة الخارجية) و1-اختيار ذبابة واحدة CApillary FEeder (CAFE) المقايسة. اختبار 72 الذباب / الجنس لخط واحد يتطلب مجموعتين من معدات وزارة الخارجية (الزوجين + لوحات + شرائط الحاجز) ، في حين أن CAFE سوف تحتاج فقط 1 الشعيرات الدموية لكل قارورة الثقافة. وعلى الرغم من الفرق الكبير في الاستثمار الأولي في وزارة الخارجية، فإن الفرق الكبير في التكاليف المتكررة (14.80 دولارا مقابل 46.08 دولارا على التوالي) سيسمح باسترداد التكاليف الأولية بعد اختبار 4 خطوط فقط (نقطة التعادل). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

تصف الدراسة بروتوكولا جديدا لقياس الاستهلاك في Drosophila:المقايسة المغذية Microplate (MFA). في هذا المقايسة، يستهلك الذباب من الآبار المغلقة من لوحة صغيرة 1536 جيدا من خلال ثقوب الحجم الخاضعة للرقابة (الشكل 1، الشكل 2؛ فيديو التكميلية S.1). وبما أن الأغذية السائلة مصبوغة وتقدم عن طريق الصفائح الدقيقة، يمكن الحصول على قياسات للامتصاص البصري للغذاء باستخدام مطياف مجهري(الشكل 3). وبهذه الطريقة، يتحدد الاستهلاك بمقارنة الامتصاص قبل الاستهلاك وبعده، ثم بتطبيق هذه النسبة على الحجم المعروف الذي تم صرفه قبل الاستهلاك. وقد تم التحقق من ذلك تجريبيا من خلال قياس امتصاص كميات مختلفة من المتوسط المصبوغ(الشكل 3B).

ولتطوير هذا المقايسة، كانت هناك حاجة إلى جهاز يمكن أن يستفيد من القياس الكمي للاستهلاك القائم على الامتصاص. اختبار الذباب في شكل لوحة صغيرة جذابة لأنه يكمل لوحة صغيرة تستخدم لصرف الطعام ويسمح بالمرونة في الاختيار من صيغ لوحة متعددة (على سبيل المثال، 6-، 12-، 48-، أو 96-جيدا الأشكال) عن طريق ضبط هندسة الزوجين. تم اختيار تنسيق 96 لوحة صغيرة بشكل جيد للسماح بثقافة الطيران الفردية.

الجهاز المطبوع ثلاثي الأبعاد(الشكل 1)يوجه بدقة لوحة التغذية 1536 جيدا مع لوحة الثقافة 96 جيدا، مما يعطي كل ذبابة الوصول إلى ما يصل إلى 4 آبار من لوحة التغذية للاستهلاك. وعلاوة على ذلك، لتوفير الوقت الكافي لتوزيع الذباب في لوحة الإسكان والسيطرة على بدء الفحص، ويشمل الجهاز شرائط حاجز تحويل التي تحتوي على الذباب في الآبار الخاصة بهم ومنع الخروقات. يتم توفير الملفات اللازمة لشراء أو تعديل هذه الأجزاء(الملفات التكميلية S.2-S.3)،فضلا عن تعليمات التصنيع اللازمة للقطع ذات الصلة (ملف التكميلية S.4).

يوفر وزارة الخارجية طريقة إنتاجية عالية بسيطة تكمل أساليب أكثر تفصيلا لمراقبة سلوك تغذية Drosophila^18و21و22. توفر وزارة الخارجية مزايا متعددة على الطرق الأخرى المستخدمة لقياس كمية تناول الطعام. يتم زيادة الإنتاجية عن طريق تحديد الاستهلاك باستخدام قارئ لوحة. هذا يلغي القياسات اليدوية وينافي إدخال البيانات اليدوية. البيانات قابلة أيضا لاستخراج البرامج ومعالجتها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن زيادة الإنتاجية تزيد من العدد الممكن من التكاثر البيولوجي، ولا سيما بالمقارنة مع تصاميم التغذية المجتمعية، مما يزيد إلى حد كبير من القدرة على اكتشاف الاختلافات الصغيرة في الاستهلاك. باستخدام وزارة الخارجية، يمكن لمجرب واحد قياس استهلاك أو تفضيل أكثر من 500 ذبابة لكل تشغيل بين عشية وضحاها من المقايسة. من خلال تداخل عمليات الفحص ، يمكن اختبار أكثر من 2000 ذبابة في فترة 5 أيام. وأخيرا، هناك وفورات في التكاليف على المدى الطويل بسبب إعادة استخدام لوحات صغيرة ومجزرة(ملف التكميلية S.5). وباستخدام وزارة الخارجية، يمكن أن تصل التكلفة المقدرة لكل فحص إلى 14.80 دولارا، مع تكلفة مقدمة للمعدات قدرها 127.60 دولارا. باستخدام المقايسة الكلاسيكية CApillary FEeder (CAFE) ، والتي تتطلب دقة مكلفة microcapillaries ، والتكلفة المقدرة لكل مقايسة لعدد مماثل من التكرارات هو 46.08 دولار. وهكذا، فبينما يوجد استثمار أولي في اقتناء المعدات اللازمة، يمكن أن يؤدي تخفيض التكاليف المتكررة إلى تحقيق وفورات كبيرة، لا سيما في الحالات التي تجرى فيها اختبارات متكررة.

وكما هو الحال مع جميع المقايسات، فإن وزارة الخارجية لديها بعض القيود. أساسا، فإنه يتطلب الوصول إلى مطياف microplate قادرة على قراءة 1536-جيدا لوحات صغيرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الاعتماد على قياسات الامتصاص للقياس الكمي يجعل الطريقة عرضة للتداخل البصري. يظهر هذا كقيم استهلاك سالبة لمجموعة فرعية صغيرة من العينات التي تم اختبارها. يجب أن تكون المواد الغذائية أو الأدوية أو الأدوية أو السموم ذات الأهمية قابلة للذوبان في الماء أيضا لتكون متوافقة مع المقايسة.

على الرغم من القيود المفروضة عليه، تقدم هذه الطريقة طريقة إنتاجية عالية لقياس سلوكيات الاستهلاك في Drosophila. وعلاوة على ذلك ، يمكن تعديل جهاز الاقتران بسهولة لقبول العديد من أشكال اللوحات ، مما يسمح له لاستيعاب مجموعة متنوعة من أنواع الحشرات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm Diameter Needles	Rave Scientific	RS-MN-52-001012
0.45 µm Syringe Filters	Olympus Plastics	25-245
10 mL Disposable Syringe	EXELINT	26200
Agarose	Fisher Scientific	BP1600
Barrier Strips (Laser Cut)	Ponoko	-	Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File:
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625501
Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets	Eppendorf	22638041
FD&C Blue #1	Spectrum Chemical Mfg Corp	FD110
Film Sealing Paddle	Fisher Scientific	50-563-280
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	#59-114 and #59-119	CO2 Anesthesia: The Flypads  come in two sizes, either of which is appropriate
Microplate Coupler (3D Printed)	Shapeways	-	Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File:
Microplate Lids	Greiner Bio-One	656170
Molecular Devices SpectraMax iD5	Molecular Devices	-	Any microplate reader with 1536-well resolution will do.
Needle Probe Holder	Rave Scientific	RS-MN-52-001000
Polyester Sealing Film	Excel Scientific, Inc.	100-SEAL-PLT
Polystyrene 96-well microplates	Greiner Bio-One	655101
Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates	Greiner Bio-One	783000	Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing.
Rubber Bands
Sucrose	Sigma	S7903
Weather Stripping			1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422