التصوير البصري بالمنظار لقلب الفأر بالكامل

Summary

نبلغ عن طريقة لإعادة البناء الميزوسكوبي لقلب الفأر بالكامل من خلال الجمع بين التطورات الجديدة في تحويل الأنسجة وتلطيخها مع تطوير مجهر ورقة ضوئية ممسوحة محوريا.

Abstract

يمكن أن تسبب كل من أمراض القلب الوراثية وغير الوراثية عمليات إعادة تشكيل شديدة في القلب. يمكن أن تؤثر إعادة البناء الهيكلي ، مثل ترسب الكولاجين (التليف) والاختلال الخلوي ، على التوصيل الكهربائي ، وإدخال اختلالات كهروميكانيكية ، وفي النهاية تؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب. تستند النماذج التنبؤية الحالية لهذه التعديلات الوظيفية إلى معلومات هيكلية غير متكاملة ومنخفضة الدقة. يعد وضع هذا الإطار على ترتيب مختلف من حيث الحجم أمرا صعبا بسبب عدم فعالية طرق التصوير القياسية في إجراء تصوير عالي الدقة في الأنسجة الضخمة. في هذا العمل ، نصف إطارا منهجيا يسمح بتصوير قلوب الفئران بأكملها بدقة ميكرومترية. وقد تطلب تحقيق هذا الهدف جهدا تقنيا حيث تم الجمع بين التقدم في تحويل الأنسجة وطرق التصوير. أولا ، نصف بروتوكول CLARITY المحسن القادر على تحويل القلب السليم إلى شكل نانوي مسامي ، مهجن هيدروجيل ، خالي من الدهون يسمح بشفافية عالية وتلطيخ عميق. بعد ذلك ، يتم وصف مجهر ورقة ضوئية مضان قادر على الحصول بسرعة على صور لمجال رؤية ميزوسكوبي (مقياس مم) بدقة مقياس ميكرون. بعد مشروع mesoSPIM ، يسمح المجهر المصمم بإعادة بناء قلب الفأر بالكامل بدقة ميكرومترية في مسح مقطعي واحد. نعتقد أن هذا الإطار المنهجي سيسمح بتوضيح تورط فوضى العمارة الخلوية في الاختلالات الكهربائية ويمهد الطريق لنموذج شامل يأخذ في الاعتبار كل من البيانات الوظيفية والهيكلية ، مما يتيح تحقيقا موحدا للأسباب الهيكلية التي تؤدي إلى تغييرات كهربائية وميكانيكية بعد إعادة تشكيل الأنسجة.

Introduction

يمكن أن تؤثر إعادة البناء الهيكلي المرتبطة بأمراض القلب على التوصيل الكهربائي وإدخال اختلالات كهروميكانيكية للجهاز ^1,2. عادة ما تستخدم الأساليب الحالية المستخدمة للتنبؤ بالتغيرات الوظيفية التصوير بالرنين المغناطيسي و DT-MRI للحصول على إعادة بناء شاملة لترسب التليف وشجرة الأوعية الدموية وتوزيع الألياف للقلب ، ويتم استخدامها لنمذجة مسارات انتشار إمكانات العمل التفضيلي (APP) عبر العضو ^3,4. يمكن أن توفر هذه الاستراتيجيات نظرة عامة جميلة على تنظيم القلب. ومع ذلك ، فإن دقتها المكانية غير كافية للتحقيق في تأثير إعادة البناء الهيكلي على وظيفة القلب على المستوى الخلوي.

إن وضع هذا الإطار في ترتيب مختلف من حيث الحجم ، حيث يمكن للخلايا المفردة أن تلعب أدوارا فردية في انتشار جهد الفعل ، يمثل تحديا. القيد الرئيسي هو عدم كفاءة طرق التصوير القياسية لأداء تصوير عالي الدقة (دقة ميكرومترية) في الأنسجة الضخمة (بحجم السنتيمتر). في الواقع ، تصوير الأنسجة البيولوجية في 3D بدقة عالية أمر معقد للغاية بسبب عتامة الأنسجة. الطريقة الأكثر شيوعا لإجراء إعادة بناء 3D في الأعضاء بأكملها هي إعداد أقسام رقيقة. ومع ذلك ، فإن التقسيم الدقيق والتجميع والتصوير يتطلب جهدا ووقتا كبيرين. النهج البديل الذي لا يتطلب قطع العينة هو توليد نسيج شفاف. خلال السنوات الأخيرة ، تم اقتراح عدة منهجيات لتوضيح الأنسجة⁵،⁶،^7،8. تم تحقيق التحدي المتمثل في إنتاج أنسجة ضخمة وشفافة وموسومة بالفلورسنت مؤخرا من خلال تطوير مناهج تحويل الأنسجة الحقيقية (CLARITY⁹ ، SHIELD¹⁰). على وجه الخصوص ، تعتمد طريقة CLARITY على تحويل الأنسجة السليمة إلى شكل نانوي مسامي ، مهجن هيدروجيل ، خال من الدهون يمكن من منح شفافية عالية عن طريق الإزالة الانتقائية لطبقات الدهون الغشائية المزدوجة. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة قد وجدت ناجحة أيضا في إعداد القلب¹¹،^12،13،14. ومع ذلك ، نظرا لأن القلب هش للغاية بحيث لا يكون مناسبا للمقاصة النشطة ، فيجب تطهيره باستخدام النهج السلبي ، والذي يتطلب وقتا طويلا لمنح الشفافية الكاملة.

بالاقتران مع تقنيات التصوير المتقدمة مثل الفحص المجهري للصفائح الضوئية ، فإن CLARITY لديه القدرة على تصوير أنسجة القلب الضخمة 3D بدقة ميكرومترية. في الفحص المجهري للورقة الضوئية ، يتم إجراء إضاءة العينة باستخدام ورقة رقيقة من الضوء محصورة في المستوى البؤري لهدف الكشف. يتم جمع انبعاث التألق على طول محور عمودي على مستوى الإضاءة¹⁵. تشبه بنية الكشف الفحص المجهري واسع المجال ، مما يجعل الاستحواذ أسرع بكثير من مجاهر المسح بالليزر. يسمح نقل العينة عبر ورقة الضوء بالحصول على تصوير مقطعي كامل للعينات الكبيرة ، حتى عينات بحجم سنتيمتر. ومع ذلك ، نظرا للخصائص الجوهرية لحزمة Gaussian ، من الممكن الحصول على ورقة ضوئية رقيقة جدا (بترتيب بضعة ميكرونات) فقط لامتداد مكاني محدود ، مما يحد بشكل كبير من مجال الرؤية (FoV). في الآونة الأخيرة ، تم تقديم مخطط إثارة جديد للتغلب على هذا القيد وتطبيقه على تصوير الدماغ ، مما يسمح بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد بدقة¹⁶.

في هذه الورقة ، يتم تقديم نهج المقاصة السلبية ، مما يتيح تقليل كبير في توقيت المقاصة الذي يحتاجه بروتوكول CLARITY. يسمح الإطار المنهجي الموصوف هنا بإعادة بناء قلب فأر كامل بدقة ميكرومترية في مسح مقطعي واحد مع وقت اكتساب في حدود الدقائق.

Protocol

تم تنفيذ جميع إجراءات وإجراءات التعامل مع الحيوانات وفقا للإرشادات الواردة في التوجيه 2010/63 / EU الصادر عن البرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية وتتوافق مع مبادئ وأنظمة وزارة الصحة الإيطالية. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل وزارة الصحة الإيطالية (البروتوكول رقم 647/2015-PR). تم توفير جميع الحيوانات من قبل ENVIGO ، إيطاليا. لهذه التجارب ، تم استخدام 5 ذكور من الفئران C57BL / 6J من عمر 6 أشهر.

1. إعداد الحل

1. تحضير 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (درجة الحموضة 7.6) في غطاء كيميائي. قم بتخزين حصص 4٪ PFA في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
2. تحضير محلول هيدروجيل: مزيج 4٪ أكريلاميد ، 0.05٪ مكرر أكريلاميد ، 0.25٪ بادئ AV-044 في 0.01 M PBS في غطاء كيميائي. الحفاظ على الكواشف والمحلول على الجليد أثناء التحضير بأكمله. قم بتخزين حصص الهيدروجيل في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
3. تحضير محلول المقاصة: امزج 200 مللي متر من حمض البوريك ، 4٪ صوديوم دوديسيل سلفات (SDS) في ماء منزوع الأيونات ؛ درجة الحموضة 8.6 في غطاء كيميائي. قم بتخزين المحلول بين 21-37 درجة مئوية لتجنب هطول SDS.
4. تحضير محلول Tyrode طازج في يوم التجربة: أضف 10 mM Glucose و 10 mM HEPES و 113 mM NaCl و 1.2 mM MgCl₂ و 4.7 mM KCl ؛ معايرة إلى الرقم الهيدروجيني 7.4 باستخدام 1 M NaOH.

2. عزل القلب

1. حقن 0.1 مل من 500 وحدة دولية من الهيبارين تحت الجلد قبل 30 دقيقة من إجراء عزل القلب.
2. املأ حقنة سعة 30 مل وثلاثة أطباق بتري مقاس 6 سم بمحلول تيرود الطازج. اصنع صدعا صغيرا (بعمق 3-4 مم) على حدود أحد أطباق بتري وضعه تحت مجهر مجسم.
3. ثبت قنية قطرها 1 مم على المحقنة وأدخلها في صدع طبق بتري. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في المحقنة.
4. املأ حقنة سعة 20 مل بنسبة 4٪ PFA واحتفظ بها في الغطاء الكيميائي. تحضير طبق بتري فارغ تحت غطاء محرك السيارة.
5. تخدير الفأر بنسبة 3٪ إيزوفلوران / أكسجين بمعدل تدفق 1.0 لتر / دقيقة والتضحية به عن طريق خلع عنق الرحم وفقا لقواعد رعاية الحيوان المعمول بها.
6. بعد التضحية ، قم بإزالة الفراء فوق الصدر وافتح الصدر للوصول الكامل إلى القلب.
7. اعزل القلب ، واغمره في طبق بتري المملوء مسبقا ب 50 مل من محلول تيرودي. استخدم المقص الجراحي لقطع الشريان الأورطي مباشرة بالقرب من قوس الأبهر لكشف القلب.
8. نقل القلب تحت المجهر مجسمة وإجراء القنية بعناية. لا تقم بإدخال القنية في عمق الشريان الأورطي (لا يزيد عن 2 مم) لتجنب تلف الأنسجة.
9. استخدم مشبكا صغيرا وخياطة (مقاس 5/0) لتثبيت القلب في القنية.
10. قم بتخلل القلب ب 30 مل من محلول Tyrode بضغط ثابت قدره 10 مل / دقيقة لإزالة الدم من الأوعية.
11. افصل القنية عن المحقنة وضع القلب في طبق بتري المملوء بمحلول تيرودي. احرص على عدم وجود فقاعات هواء في القنية ؛ خلاف ذلك ، قم بإزالة فقاعات الهواء بشكل صحيح.
12. قم بتوصيل المحقنة سعة 20 مل المملوءة ب 4٪ PFA البارد بالقنية وقم بتعكير القلب بنفس الضغط المستمر.
13. احتضان القلب في 10 مل من 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (O / N). لتجنب تدهور الأنسجة ، قم بتنفيذ الخطوات 2.6-2.13 في أقصر وقت ممكن.

3. تطهير القلب

1. في اليوم التالي ، اغسل القلب في 0.01 M PBS 3 مرات عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين القلب في PBS + 0.01٪ أزيد الصوديوم (NaN3) عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
2. احتضان القلب في 30 مل من محلول هيدروجيل في الهز (15 دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام.
3. قم بإزالة الغاز من العينة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجفف ومضخة تفريغ ونظام أنبوب يربط المجفف بكل من المضخة وخط أنابيب النيتروجين.
   1. ضع العينة في المجفف وافتح القارورة ، مع الحفاظ على الغطاء عليها.
   2. أغلق المجفف وأزل الأكسجين من الأنبوب عن طريق فتح خط أنابيب النيتروجين.
   3. قم بتشغيل مضخة التفريغ لإزالة الأكسجين من المجفف لمدة 10 دقائق.
   4. قم بإيقاف تشغيل المضخة واستخدم مقبض المجفف لفتح خط أنابيب النيتروجين. بمجرد أن يصبح الضغط مساويا للضغط الجوي ، افتح المجفف بعناية وأغلق القارورة بسرعة.
4. احتفظ بالقلب في محلول هيدروجيل مفرغ عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في حالة راحة.
5. عندما يتم بلمرة الهيدروجيل بشكل صحيح ويبدو هلاميا تماما ، قم بإزالة القلب منه بعناية وضعه في حامل العينة.
6. أدخل حامل العينة مع القلب في إحدى غرف المقاصة وأغلقه بشكل صحيح لتجنب تسرب محلول المقاصة.
7. قم بتشغيل الحمام المائي حيث يتم وضع حاوية محلول المقاصة والمضخة التمعجية لبدء إعادة تدوير محلول المقاصة.
8. قم بتغيير محلول المقاصة في الحاوية مرة واحدة في الأسبوع لتسريع إجراء التوضيح.

4. تلطيخ الغشاء الخلوي

1. بمجرد أن يظهر القلب واضحا تماما ، أخرجه من حامل العينة واغسله في 50 مل من برنامج تلفزيوني دافئ لمدة 24 ساعة. اغسل مرة أخرى في 50 مل من PBS + 1٪ من Triton-X (PBS-T 1x) لمدة 24 ساعة.
2. احتضان العينة في 0.01 مجم / مل من تراص جنين القمح (WGA) - Alexa Fluor 633 في 3 مل من PBS-T 1x في الهز (50 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 أيام.
3. بعد الحضانة لمدة 7 أيام ، اغسل العينة في 50 مل من PBS-T 1x في درجة حرارة الغرفة في الاهتزاز لمدة 24 ساعة.
4. احتضان العينة في 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة ثم اغسلها 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
   ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين القلب في PBS + 0.01٪ NaN3 عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
5. احتضان القلب بتركيزات متزايدة من 2,2′-Thiodiethanol (TDE) في 0.01 M PBS (20٪ و 47٪ TDE / PBS) لمدة 8 ساعات لكل منهما ، حتى التركيز النهائي 68٪ TDE في 0.01 M PBS لتوفير معامل الانكسار المطلوب (RI = 1.46). هذا هو وسيط مطابقة RI (RI-medium) للحصول على الصور¹⁶.

5. تركيب القلب واكتسابه

ملاحظة: يتم سرد جميع مكونات النظام البصري بالتفصيل في جدول المواد.

1. املأ برفق حوالي 80٪ من الكوفيت الخارجي (الكوارتز ، 45 مم × 45 مم × 42.5 مم) باستخدام RI-medium.
   ملاحظة: هنا ، من الممكن استخدام حلول مختلفة غير متطايرة تضمن مثيلا محصورا يبلغ 1.46.
2. املأ الكوفيت الداخلي برفق (الكوارتز ، 45 مم × 12.5 مم × 12.5 مم) بنفس وسيط RI.
3. اغمر العينة داخل الكوفيت الداخلي. تسمح حضانة العينة الموصوفة أعلاه للعينة بالبقاء مستقرة داخل وسط RI دون الاحتفاظ بها.
4. حرك العينة برفق إلى أسفل الكوفيت باستخدام ملاقط رفيعة ورتب القلب بمحوره الطولي الموازي للمحور الرئيسي للكوفيت لتقليل مسار ضوء الإثارة عبر الأنسجة أثناء المسح.
5. ثبت القابس المخصص برفق فوق الكوفيت الداخلي بمسمارين.
6. قم بتركيب العينة في مرحلة المجهر باستخدام المغناطيس.
7. قم بترجمة مرحلة العينة الرأسية يدويا لغمر الكوفيت الداخلي في المرحلة الخارجية.
8. قم بتشغيل مصدر ضوء الإثارة (الطول الموجي 638 نانومتر) ، مع ضبط طاقة منخفضة (في حدود 3 ميغاواط).
9. حرك العينة باستخدام المترجم الآلي لإضاءة المستوى الداخلي للنسيج.
10. قم بتشغيل برنامج التصوير (HCImageLive) واضبط مشغل الكاميرا على الوضع الخارجي (ورقة الضوء) لدفع مشغل الاستحواذ للكاميرا بواسطة البرنامج المخصص الذي يتحكم في الإعداد بأكمله.
11. قم بتمكين الحفظ التلقائي في لوحة إعدادات المسح الضوئي وقم بتعيين مجلد الإخراج حيث يجب حفظ الصور.
12. اضبط موضع العينة يدويا في المستوى XY باستخدام المترجمين الخطيين لنقل العينة إلى مركز FoV لمستشعر الكاميرا.
13. حرك العينة على طول المحور Z باستخدام المترجم الخطي الميكانيكي لتحديد حدود القلب لإعادة البناء المقطعي.
14. زيادة طاقة الليزر إلى ~ 20 ميغاواط ، جاهزة لجلسة التصوير.
15. ابدأ الاكتساب المقطعي ، وانقر فوق الزر " ابدأ " في لوحة التسلسل الخاصة ببرنامج التصوير ، وفي نفس الوقت حرك العينة على طول المحور Z بسرعة ثابتة تبلغ 6 ميكرومتر / ثانية باستخدام المترجم الآلي.

النتائج

يسمح إعداد المقاصة السلبية المطور بالحصول على قلب فأر بالغ تم تطهيره (ببعد من الطلب 10 مم × 6 مم × 6 مم) في حوالي 3 أشهر. يتم تثبيت جميع مكونات الإعداد كما هو موضح في الشكل 1. يسمح تدرج درجة الحرارة الضئيل بين كل غرفة مقاصة (بترتيب 3 درجات مئوية) بالحفاظ على درجة الحرارة في نطاق منا...

Discussion

في هذا العمل ، تم تقديم نهج ناجح لمسح وصبغ وصورة قلب فأر كامل بدقة عالية. أولا ، تم تحسين بروتوكول تحويل الأنسجة (CLARITY) وتنفيذه ، وتم تعديله قليلا لتطبيقه على أنسجة القلب. في الواقع ، للحصول على إعادة بناء فعالة في 3D من القلب كله ، من الضروري منع ظاهرة تشتت الضوء. تسمح لنا منهجية CLARITY بالحصول ع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB