نموذج حيواني كبير لتقييم فعالية العلاج الجيني في القلب الإقفاري

Summary

يحمل العلاج الجيني لعضلة القلب لمرض القلب الإقفاري وعدا كبيرا للعلاجات المستقبلية. هنا ، نقدم نموذجا حيوانيا كبيرا لتقييم فعالية العلاج الجيني في القلب الإقفاري.

Abstract

مرض الشريان التاجي هو أحد الأسباب الهامة للوفيات والمراضة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من تطور العلاجات الحالية ، لا تزال نسبة كبيرة من مرضى مرض الشريان التاجي يعانون من أعراض. يوفر تكوين الأوعية العلاجي بوساطة العلاج الجيني طريقة علاجية جديدة لتحسين نضح عضلة القلب وتخفيف الأعراض. تمت دراسة العلاج الجيني بعوامل وعائية مختلفة في عدد قليل من التجارب السريرية. نظرا لحداثة الطريقة ، فإن تقدم العلاج الجيني لعضلة القلب هو مسار مستمر من مقاعد البدلاء إلى السرير. لذلك ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية كبيرة لتقييم السلامة والفعالية. كلما حدد النموذج الحيواني الكبير المرض الأصلي ونقاط النهاية المستخدمة في العيادات ، زادت النتائج التي يمكن التنبؤ بها من التجارب السريرية. هنا ، نقدم نموذجا حيوانيا كبيرا لتقييم فعالية العلاج الجيني في قلب الخنازير الإقفاري. نحن نستخدم طرق التصوير ذات الصلة سريريا مثل التصوير بالموجات فوق الصوتية و ¹⁵H₂O-PET. لاستهداف عمليات نقل الجينات إلى المنطقة المرغوبة ، يتم استخدام رسم الخرائط الكهروتشريحية. الهدف من هذه الطريقة هو: (1) محاكاة مرض الشريان التاجي المزمن ، (2) للحث على تكوين الأوعية العلاجية في مناطق نقص الأكسجين في القلب ، و (3) لتقييم سلامة وفعالية العلاج الجيني باستخدام نقاط النهاية ذات الصلة.

Introduction

مرض الشريان التاجي مسؤول عن النسبة العظمى من الوفيات وعبء المرض في جميع أنحاء العالم¹. استراتيجيات العلاج الحالية هي التدخلات عن طريق الجلد ، والعلاج الدوائي ، وجراحة المجازة². ومع ذلك ، على الرغم من تطور هذه العلاجات الحالية ، يعاني العديد من المرضى مما يسمى بالذبحة الصدرية المقاومة للحرارة ، مما يؤكد الحاجة غير الملباة لنهج علاجية جديدة³. يمكن أن يستهدف تكوين الأوعية العلاجية بوساطة العلاج الجيني هذه المجموعة من المرضى.

غالبا ما يتم تقديم العلاج الجيني لعضلة القلب باستخدام نواقل فيروسية مختلفة ، وأكثرها شيوعا الفيروس الغدي 4 الذي يعاني من نقص التكاثر^. كجينات علاجية ، يتم استخدام عوامل نمو وعائية مختلفة. أكثر عوامل النمو الوعائية التي تمت دراستها بشكل كبير هي عوامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGFs) التي تتوسط إشاراتها الوعائية من خلال مستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGFRs) ومستقبلاتها^{المشتركة 5}. أثبتت العديد من التجارب السريرية فائدة وسلامة العلاج الجيني للقلب وجعلت طريقة العلاج الجديدة هذه خيارا واقعيا لعلاج أمراض القلب الإقفارية ^6,7. ومع ذلك ، لا يزال هذا المفهوم بحاجة إلى تعزيز الجينات العلاجية والنواقل الفيروسية التي يتم اختبارها في النماذج الحيوانية الكبيرة قبل دخول العيادات. كثيرا ما يستخدم الخنزير كحيوان مختبر لأن قلبه يشبه إلى حد كبير قلب الإنسان. يسمح حجم نظام القلب والأوعية الدموية للخنزير باستخدام اختراعات قسطرة مماثلة كما هو مستخدم في البشر. يمكن استخدام جميع طرق التصوير المتاحة للبشر في الخنازير⁸.

هناك العديد من النماذج الحيوانية الكبيرة لنقص التروية المزمن. الأكثر استخداما هو نموذج مضيق الأمرويد⁹،^10،11. الجانب السلبي لهذه الطريقة هو الغزو لأن بضع الصدر ضروري للوصول إلى الأوعية الدموية التاجية. سابقا في مجموعتنا ، تم تطوير نموذج دعامة عنق الزجاجة الغازية المصغرة لنقص تروية عضلة القلب المزمن¹². تستخدم هذه الطريقة أيضا في هذه المخطوطة للحث على نقص تروية عضلة القلب.

تطورت قابلية استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية بشكل كبير على الرغم من عمر طريقة التصوير. على سبيل المثال ، لا تزال سلالة عضلة القلب في الاستخدام البحثي بشكل رئيسي بسبب حداثتها. يعكس إجهاد عضلة القلب التغيرات في وظيفة انقباض القلب بشكل أفضل من قياس الكسر القذفي التقليدي^{في الوضع M 13}. وهكذا ، هنا في النموذج الحيواني الكبير ، يتم استخدام قياس إجهاد عضلة القلب. لتقييم وظيفة القلب ، يتم قياس النتاج القلبي أيضا عن طريق التصوير السينمائي للبطين الأيسر أثناء تصوير الأوعية. يتم قياس النتاج القلبي أثناء الراحة وتحت الإجهاد الناجم عن الدوبوتامين لتقييم وظيفة عضلة القلب تحت الضغط.

بالإضافة إلى قياسات وظيفة القلب ، فإن المعلومات المتعلقة بنضح عضلة القلب ضرورية في دراسات العلاج الجيني التي تهدف إلى تكوين الأوعية العلاجية. في هذا النموذج الحيواني ، يتم تصوير الحيوانات باستخدام 15 تصوير مقطعي بالإصدار البوزيتروني للمياه المشعة المسمى O (¹⁵H₂O-PET) لأن هذا هو المعيار الذهبي لقياس نضح عضلة القلب. ¹⁵تم التحقق من صحة H₂O-PET مسبقا لقياس نضح قلب الخنازير^{الإقفاري 14}.

وبالتالي ، فإن الأساليب والطرائق المذكورة أعلاه تشكل منظورا ممتازا لتقييم فعالية العلاج الجيني في القلب الإقفاري.

Protocol

يتم إجراء التجارب المعروضة هنا باستخدام إناث الخنازير المنزلية البالغة من العمر حوالي 10 أسابيع وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس التجارب على الحيوانات في فنلندا. تزن الحيوانات 30-40 كجم في بداية البروتوكول ، مما يسمح بنفس المعدات الإجرائية وطرق التصوير الممكنة للبشر. يحدث نقص التروية المزمن قبل 14 يوما من نقل الجينات ، ويعتمد وقت المتابعة بعد نقل الجينات على الناقل الفيروسي المستخدم. يظهر بروتوكول الدراسة في الشكل 1. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء حقن العلاج الجيني الفيروسي الغدي أو AAV. يجب تعديل وقت جمع العينات إلى ذروة تعبير جين التحوير ، والتي تعتمد على الناقل الفيروسي المستخدم. على سبيل المثال ، عند إجراء عمليات نقل الجينات الفيروسية الغدية ، يتم ضبط وقت جمع العينات على 6 أيام بعد نقل الجينات.

1. الدواء

1. تطبيق جرعة يومية من 200 ملغ من الأميودارون و2.5 ملغ من بيسوبرولول لمنع عدم انتظام ضربات القلب البطيني المميت. يبدأ الدواء قبل 1 أسبوع من عملية نقص التروية ويستمر يوميا حتى المتابعة.
2. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تطبيق جرعات peroral من كلوبيدوقرل (300 ملغ) وحمض أسيتيل الساليسيليك (300 ملغ) للحيوانات قبل يوم واحد من عملية نقص التروية لمنع تجلط الدم الحاد في الدعامة بعد وضع الدعامة.
3. تطبيق 100 ملغ من الليدوكائين و2.5 مل من (246 ملغ/مل) مغسو₄ عن طريق الوريد للحيوانات في بداية عملية نقص التروية لمنع عدم انتظام ضربات القلب البطيني.
4. تطبيق الحقن العضلي للسيفوروكسيم (500 ملغ) في بداية كل عملية للوقاية من العدوى.
5. تطبيق 30 ملغ من إينوكسابارين عن طريق الوريد في بداية عمليات نقص التروية وتحت الجلد بعد إجراء العملية للوقاية من تجلط الدم.
6. للتخدير وتسكين الألم، يتم تطبيق 1.5 مل من الأتروبين، 6 مل من الأزابيرون (40 ملغ/مل)، البروبوفول 20 ملغ/مل، بمعدل 15 ملغ/كغ/ساعة، والفنتانيل 50 ميكروغرام/مل بمعدل 10 ميكروغرام/كغ/ساعة. كانت جرعات الدواء هي نفسها لكل خنزير. ارجع إلى إرشادات استخدام الحيوانات المحلية لإدارة الجرعة.
7. تخدير الحيوانات خلال جميع العمليات. يجب إجراء جميع العمليات في بيئة معقمة باستخدام تقنية معقمة.

2. تخطيط صدى القلب عبر الصدر

1. إجراء تخطيط صدى القلب عبر الصدر قبل عملية نقص التروية ونقل الجينات والقتل الرحيم لتقييم أي سائل التامور يمكن اكتشافه وتحديد سلالة عضلة القلب.
2. ضع محول الطاقة في الفضاء الوربي الثالث أو الرابع تحت إبط الخنزير للوصول إلى مناظر المحور القصير شبه القصي على مستوى الصمام التاجي والعضلات الحليمية والمستويات القمية (الفيديو 1). يجب أن تشير علامة محول الطاقة إلى عظم الخنزير. لحفظ مقطع، اضغط على اكتساب.

3. عمليات الأوعية الدموية تحت التوجيه الفلوري

1. إجراء تصوير سينمائي للبطين الأيسر بعد تصوير الأوعية التاجية قبل عملية نقص التروية ونقل الجينات وجمع الأنسجة.
2. التحضير للعملية
   1. الاستعداد للعمليات عن طريق تخدير الخنازير مع الحقن العضلي من 1.5 مل من الأتروبين و 6 مل من azaperone.
   2. بعد التخدير ، قم بتحفيز التخدير العام للبروبوفول والفنتانيل لإجراءات تصوير الأوعية الدموية للخنازير بجرعات 15 مجم / كجم / ساعة و 10 ميكروغرام / كجم / ساعة ، على التوالي.
      ملاحظة: يتم تخدير الخنازير للإجراء بأكمله.
   3. دعم التهوية عن طريق التنبيب وجهاز التنفس الصناعي ومراقبة المعلمات الفسيولوجية الحيوية ، مثل تخطيط القلب والمعلمات التنفسية.
3. وضع غمد المعرف
   1. ضع غمد مقدم في الشريان الفخذي الأيمن لجميع العمليات كممارسة قياسية في أمراض القلب. استخدم الموجات فوق الصوتية لتتبع الشريان الفخذي وثقبه بإبرة دخول (18 جم).
      ملاحظة: استخدم غمد مقدم 8F لنقل الجينات داخل عضلة القلب وغمد 6F لجميع العمليات الأخرى. أدخل سلك التوجيه الخاص بالغلاف من خلال الإبرة لربط الشريان وتثبيت سلك التوجيه أثناء إزالة الإبرة.
   2. أدخل غلاف الإدخال على طول سلك التوجيه ، وعند وضعه ، قم بإزالة سلك التوجيه وإعطاء 1.25 مجم من ثنائي النترات تحت اللسان للخنزير للحث على توسع الأوعية التاجية.
4. تصوير الأوعية التاجية
   1. إجراء تصوير الأوعية التاجية مباشرة قبل عملية نقص التروية ونقل الجينات وجمع الأنسجة. يوضح الشكل 2 الآلات اللازمة للتصوير الوعائي.
   2. استخدم قسطرة 6F تحت توجيه التنظير الفلوري مع عامل تباين اليود لتصوير الشريان التاجي الأيمن والشريان التاجي الصاعد الأيسر (فيديو 2).
5. تصوير البطين الأيسر السينمائي تحت الراحة وإجهاد الدوبوتامين
   1. تطبيق بلعة 21 مل من عامل تباين اليود في البطين الأيسر عبر قسطرة ضفيرة 5F باستخدام حاقن تلقائي. أولا، اضبط مدة البلعة على 3 ثوان والحجم الكلي على 21 mL. ثم اضغط على مفرد ونعم.
   2. احسب الكسر القذفي بواسطة برنامج القياس لمحطة عمل تصوير الأوعية. لإجراء العملية الحسابية، حدد التحليل البطيني للصورة المعنية. قم بتمرير الصورة لتحديد إطار زمني ، واحد في الانبساط والآخر في الانقباض. حدد أداة لرسم الخطوط العريضة البطينية لكل إطار زمني.
      ملاحظة: يقوم البرنامج الآن بحساب الكسر القذفي وحجم السكتة الدماغية بطريقة Simpson. يتم إجراء قياس الكسر القذفي أثناء الراحة وتحت الضغط الناجم عن الدوبوتامين.
6. تصوير الإجهاد
   1. جرعة الدوبوتامين عن طريق الوريد في جرعات متصاعدة من 10 ميكروغرام / كغ / دقيقة إلى 20 ميكروغرام / كغ / دقيقة لتصوير الإجهاد الناجم عن الدوبوتامين حتى يتم الوصول إلى معدل ضربات القلب المستهدف البالغ 160 نبضة في الدقيقة. ثم قم بإجراء التصوير السينمائي.
7. عملية نقص التروية
   1. ضع دعامة عنق الزجاجة في الشريان التاجي الأيسر (LAD) قبل 14 يوما من نقل الجينات للحث على إقفار عضلة القلب المزمن. بعد وضع دعامة عنق الزجاجة ، تحقق مما إذا كانت دعامة عنق الزجاجة موضوعة بشكل صحيح ، مما يحد من تدفق الدم التاجي.
      ملاحظة: يتم وضع دعامة عنق الزجاجة على قسطرة التمدد وتتكون من دعامة معدنية عارية مغطاة بأنبوب متعدد تترافلورو إيثيلين يتكون في شكل عنق الزجاجة لتقليل تدفق الدم التاجي⁹.
8. تحديد حجم الدعامة
   1. اختر حجم الدعامة ، إما 3.0 / 3.5 / 4.0 × 8 مم ، وفقا لحجم الشريان التاجي الصاعد الأيسر في تصوير الأوعية باستخدام برنامج القياس التلقائي في محطة عمل تصوير الأوعية (فيديو 3)¹².
9. وضع الدعامة
   1. ضع ملفا على الشريان التاجي الأيسر وحرك دعامة عنق الزجاجة إلى LAD ، وضعها بعيدا إلى القطر الأول.
   2. قم بتضخيم الدعامة إلى الضغط الاسمي في الشريان باستخدام مفرغ الهواء بنسبة دعامة إلى تجويف تبلغ 1.3 ، لتثبيت عنق الزجاجة في مكانه. بعد 15 ثانية إضافية ، قم بتفريغ الدعامة وسحب المعدات من الشريان.
      ملاحظة: تأكد من الموضع الصحيح لدعامة عنق الزجاجة عن طريق تصوير الأوعية الدموية.

4. التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني

ملاحظة: قبل يوم واحد من نقل الجينات ، قم بإجراء الراحة والإجهاد ¹⁵فحص PET / CT للمياه المشعة المسمى O (يتطلب بيئة المستشفى وفنيي الأشعة).

1. التصوير المرجعي
   1. قم بإجراء فحوصات التصوير المقطعي المحوسب (CT) قبل الراحة وتصوير الإجهاد. استخدم معلومات التصوير المقطعي المحوسب لتصحيح التوهين.
2. ¹⁵تصوير المياه المشعة المسمى O
   1. قم بإجراء تصوير الراحة والإجهاد باستخدام جرعة 800 MBq ¹⁵H₂O.
3. تصوير الإجهاد
   1. قم بإجراء تصوير الإجهاد باستخدام بلعة ماء إضافية تبلغ 800 ميجابايت ^{+ 15}بعد اضمحلال إشعاعي مناسب لمدة 12 دقيقة.
      ملاحظة: يحدث احتقان الدم بواسطة الأدينوزين (200 ميكروغرام / كجم / دقيقة عن طريق الوريد) ، كما هو موضح سابقا¹².

5. نقل الجينات

1. رسم الخرائط الكهروتتشية
   1. انتقل إلى رسم الخرائط الكهروتشريحية بعد تصوير الأوعية التاجية والقياسات الوظيفية (تخطيط صدى القلب ، التصوير السينمائي LV).
   2. إدخال قسطرة رسم الخرائط إلى البطين الأيسر عن طريق غمد الفخذ في التوجيه بالمنظار.
      ملاحظة: سجل حوالي 100-150 نقطة حول البطين الأيسر باستخدام قسطرة رسم الخرائط لإنشاء الخريطة التشريحية الكهربائية.
2. الانتهاء من الخريطة الكهروتتشية
   1. احذف النقاط المتطرفة لضمان خريطة تشريحية كهربية أكثر موثوقية للبطين الأيسر.
   2. قم بذلك عن طريق تحديد Clip Planes من الخريطة وحذف النقاط التي تختلف عن النقاط التي تشكل شكل البطين. بعد ذلك، حدد المسارات لعرض الخريطة واحذف النقاط التي انتقلت أفقيا أثناء تسجيل النقاط.
      ملاحظة: تأكد من أن النقاط المتبقية تغطي البطين الأيسر وتسجيل المزيد من النقاط إذا لزم الأمر.
3. حقن نقل الجينات
   1. إدخال قسطرة حقن داخل عضلة القلب إلى البطين الأيسر عبر غمد الفخذ تحت توجيه التنظير الفلوري. اضبط طول إبرة الحقن على 3 مم.
4. معايير الحقن داخل عضلة القلب
   1. توجيه عمليات نقل الجينات عن طريق نظام رسم الخرائط الكهروتشريحية واستهداف الحقن في مناطق قابلة للحياة ولكن ناقصة الحركة في البطين الأيسر.
      ملاحظة: من أجل الجدوى ، استخدم جهدا أحادي القطب يزيد عن 5 مللي فولت كمعيار. بالنسبة لنقص الحركة ، حدد تقصيرا خطيا محليا (LLS) منخفضا بقدر ما هو متاح ، على الأقل أقل من 12٪ ولكن يفضل أن يكون أقل من 6٪ ¹³.
5. حقن داخل عضلة القلب
   1. خلال 30 ثانية ، قم بحقن المادة المتجهة في نقطة الاختيار (الخطوة 5.4) واحتفظ بإبرة الحقن داخل عضلة القلب لمدة 5 ثوان إضافية قبل التراجع لمنع التدفق العكسي إلى البطين الأيسر.

6. القتل الرحيم وجمع العينات

ملاحظة: بعد تصوير الأوعية التاجية وقياسات الكسر القذفي الموصوفة في الخطوتين 3.4.1 و 3.5.2 ، على التوالي ، يتم تطبيق 50 مل من كلوريد البوتاسيوم المشبع عن طريق الوريد للخنزير المخدر.

1. تثبيت التروية للقلب
   1. حصاد القلب من التجويف الصدري. شطف بالماء. ضع إبرة 18 جم فوق الصمام الأبهري وقم بتوصيل الإبرة بمضخة التروية. قم بتغذية القلب ب 750 مل من 1٪ بارافورمالدهيد (PFA).
2. جمع العينات
   1. قطعي القلب إلى شرائح بسمك 1 سم باستخدام سكين مطبخ حاد. اجمع العينات من منطقة نقل الجينات إلى 4٪ PFA والنيتروجين السائل.
      ملاحظة: لحصاد الضوابط السلبية ، اجمع عينة تحكم من الجدار الخلفي للبطين الأيسر.
3. جمع أنسجة السلامة
   1. حصاد العينات من الأنسجة النائية ، مثل الرئة والكبد والكلى والطحال والمبيض. خذ عينات إلى 4٪ PFA والنيتروجين السائل.

7. تخزين العينات

1. قم بتخزين العينات للتلطيخ في 4٪ PFA لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: استبدل PFA يوميا بسائل جديد.
   1. بعد 48 ساعة ، استبدل PFA بنسبة 15٪ سكروز في ماء منزوع الأيونات. يخزن لمدة 24 ساعة على الأقل قبل تضمين العينات في كتل البارافين. يتم تخزين العينات المجمدة المفاجئة في -70 درجة مئوية.

النتائج

يمكن تأكيد نجاح عملية نقص التروية من خلال هذا البروتوكول عن طريق تصوير الأوعية التاجية وتحديد منطقة نقص الحركة عن طريق الموجات فوق الصوتية عبر الصدر (الشكل 1) قبل الشروع في توصيل الجينات. يمكن تقييم حالة انسداد الشريان التاجي عن طريق تصوير الأوعية التاجية ، ويضمن رسم الخرا?...

Discussion

يمكن تعديل النقاط الزمنية لهذا البروتوكول وفقا للناقل الفيروسي المستخدم. أيضا ، يمكن اختيار التحليلات المناعية وفقا للجين العلاجي. من الممكن أيضا إضافة المزيد من النقاط الزمنية ونقاط النهاية إلى البروتوكول إذا لزم الأمر.

يتكون هذا البروتوكول من مراحل ضرورية للنجاح ومن ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Prepared from solid sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylic acid			Varying producer
Amiodarone			Varying producer
Angiographic station	GE Healthcare
Angiolaboratory set	Mölnlycke		designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs
Bisoprolol			Varying producer
Cefuroxime			Varying producer
Clopidogrel			Varying producer
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalog number depends on stent size
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Varying producer
Electroanatomical mapping system	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Varying producer
Fentanyl			Varying producer
Intramyocardial injection catheter	Johnson & Johnson
Iodine contrast agent	Iomeron
Kitchen knife			Varying producer
Lidocaine			Varying producer
Liquid nitrogen			Varying producer
MgSO4			Varying producer
Needle 18 G	Cordis	12-004943
Perfusion pump
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluoroethylene tube
Propofol			Varying producer
Scalpel no 11	VWR	SWAN0503
Sublingual dinitrate	Takeda
Ultrasound machine	Philips