JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، يتم تقديم سير عمل تجريبي يمكن من الكشف عن معالجة caspase-8 مباشرة في مجمع الإشارات المسببة للوفاة (DISC) ويحدد تكوين هذا المجمع. هذه المنهجية لها تطبيقات واسعة النطاق، من كشف الآليات الجزيئية لمسارات موت الخلايا إلى النمذجة الديناميكية لشبكات موت الخلايا المبرمج.

Abstract

يتم التوسط في موت الخلايا المبرمج ال extrinsic عن طريق تنشيط مستقبلات الموت (DRs) مثل CD95/Fas/APO-1 أو الليغاند المسبب لداء موت الخلايا المبرمج المرتبط بعامل الورم (TRAIL) - مستقبلات 1/مستقبلات 2 (TRAIL-R1/R2). تحفيز هذه المستقبلات مع ليغاندس cognate يؤدي إلى تجميع مجمع الإشارات المسببة للموت (DISC). القرص يتكون DR، البروتين المحول Fas المرتبطة مع مجال الموت (FADD)، procaspases-8/-10، والخلوية مثل FADD interleukin (IL) -1β تحويل البروتينات المثبطة للإنزيم (c-FLIPs). القرص بمثابة منصة لمعالجة procaspase -8 والتنشيط. يحدث هذا الأخير عن طريق التعتيم / oligomerization في مجال تأثير الموت (DED) خيوط تجميعها في القرص.

ويتبع تنشيط procaspase-8 معالجتها، والذي يحدث في عدة خطوات. في هذا العمل ، يتم وصف سير عمل تجريبي ثابت يسمح بقياس تكوين DISC ومعالجة procaspase-8 في هذا المجمع. ويستند سير العمل على تقنيات التكفير المناعي المدعومة بتحليل البقع الغربية. هذا سير العمل يسمح رصد دقيق لخطوات مختلفة من procaspase-8 التوظيف إلى القرص ومعالجتها، وهي ذات صلة عالية للتحقيق في الآليات الجزيئية للخلايا المبرمج extrinsic.

Introduction

واحدة من مستقبلات الموت الأكثر دراسة (DRs) هو CD95 (Fas, APO-1). يبدأ المسار الأبوبتوتيكي extrinsic مع تفاعل DR مع ليغند cognate لها، أي CD95L يتفاعل مع CD95 أو تريل يربط تريل-Rs. وهذا يؤدي إلى تشكيل القرص في القرص DR. المقابلة يتكون من CD95، FADD، procaspase-8/-10، وC-FLIP البروتينات1،2. وعلاوة على ذلك، يتم تجميع القرص عن طريق التفاعلات بين مجال الموت (DD) التي تحتوي على البروتينات، مثل CD95 و FADD، والبروتينات المحتوية على DED مثل FADD، procaspase-8/-10، وc-FLIP (الشكل 1). Procaspase-8 يخضع لoligomerization عن طريق جمعية من DEDs لها، مما أدى إلى تشكيل خيوط DED، تليها تنشيط procaspase-8 وتجهيزها. وهذا يؤدي إلى سلسلة كاسباس، مما يؤدي إلى موت الخلية (الشكل 1)3،4. وهكذا، procaspase-8 هو caspase البادئ المركزي للمسار الخلايا المبرمج extrinsic بوساطة CD95 أو تريل-Rs، تفعيلها في منصة الجزيئية الكلية المقابلة، القرص.

اثنين من isoforms من procaspase -8 ، وهي procaspase - 8a (p55) و -8b (p53) ، ومن المعروف أن يتم تجنيدهم في القرص5. كلا isoforms تتألف من اثنين من DEDs. يقع DED1 و DED2 في الجزء N-terminal من procaspase-8a/b متبوعا بنطاقي p18 و p10 الحفازين. كشف التحليل التفصيلي المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) ل procaspase-8 DEDs عن تجميع بروتينات procaspase-8 في هياكل خيوط تسمى خيوط DED4،6. ومن اللافت للنظر أن سلاسل procaspase-8 الخطية اقترحت في البداية للمشاركة في التعتيم يليه تنشيط procaspase-8 في DISC. الآن، ومن المعروف أن تلك السلاسل ليست سوى بنية فرعية من خيوط بروكاسباس-8 DED، وهذا الأخير يتألف من ثلاث سلاسل تجميعها في الحلزون الثلاثي3،4،6،7.

عند التعتيم في خيوط DED ، تؤدي التغييرات التشكيلية في procaspase-8a /b إلى تشكيل المركز النشط للبروكاسباس -8 وتفعيله3،8. ويتبع ذلك معالجة procaspase-8 ، والتي يتم التوسط فيها عبر مسارين: الأول يمر عبر توليد منتج شق p43/p41 والثاني عبر الجيل الأولي من منتج الانقسام p30. يبدأ مسار p43/p41 من خلال انشقاق procaspase-8a/b في Asp374 ، مما أدى إلى منتجات الانقسام p43/p41 و p12 (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، يتم قطع هذه الشظايا تلقائيا بشكل تحفيزي في Asp384 و Asp210/216، مما أدى إلى تشكيل التروتروترمر caspase-8 النشط، p102/p1829،10،11. وبالإضافة إلى ذلك، تبين أنه بالتوازي مع مسار p43/p41 للمعالجة، procaspase-8a/b هو أيضا مشقوق في Asp216، مما يؤدي إلى تشكيل المنتج C-محطة الانقسام p30، تليها بروتيوليسيس إلى p10 و P1810 (الشكل 2).

Procaspase-8a/b التنشيط في خيوط DED ينظم بدقة من قبل البروتينات المسماة c-FLIPs12. تحدث بروتينات c-FLIP في ثلاثة أشكال متساوية: c-FLIPLong (c-FLIPL)،c-FLIPShort (c-FLIPS)،وc-FLIPRaji (c-FLIPR). تحتوي جميع الأشكال الثلاثة على اثنين من DEDs في منطقة N-terminal الخاصة بهم. ج-فليبL أيضا C-محطة نشطة بشكل حفاز caspase مثل المجال12,13. كل isoforms قصيرة من C-FLIP-C-FLIPS و C-FLIPR-العملبطريقة مضادة للapoptotic عن طريق تعطيل تشكيل خيوط DED في القرص6,14,15. وبالإضافة إلى ذلك، C-FLIPL يمكن تنظيم caspase-8 التنشيط بطريقة تعتمد على التركيز. وهذا يمكن أن يؤدي إلى كل من الموالية ومكافحة apoptotic آثار16,17,18. من خلال تشكيل procaspase-8/c-FLIPL heterodimer النشطة تحفيزيا، c-FLIPL يؤدي إلى استقرار المركز النشط من procaspase-8 وتفعيله. تعتمد الدالة المؤيدة أو المضادة للأبوبتوتيك ل c-FLIPL بشكل مباشر على مقدارها في خيوط DED والمبلغ اللاحق من procaspase-8/c-FLIPL heterodimers19. تركيزات منخفضة أو متوسطة من C-FLIPL في DISC يؤدي إلى كميات كافية من التروديمرات procaspase-8/c-FLIPL في خيوط DED، والتي تدعم تنشيط caspase-8. في المقابل، زيادة كميات C-FLIPL يؤدي مباشرة إلى آثارها المضادة لل أبوتوبوتيك في القرص20.

معا، وتنشيط وتجهيز procaspase-8a/b في القرص هو عملية منظمة للغاية تنطوي على عدة خطوات. تناقش هذه الورقة قياس معالجة procaspase-8 مباشرة في DISC بالإضافة إلى تحليل تكوين هذا المجمع. وسيتم تقديم هذا باستخدام CD95 DISC كمجمع DR المثالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم إجراء تجارب الخلايا التائية وفقا للاتفاق الأخلاقي 42502-2-1273 Uni MD.

1. إعداد الخلايا للتجربة

ملاحظة: متوسط عدد الخلايا لهذا التكفير المناعي هو 1 × 107. يجب أن تزرع الخلايا الملتصقة قبل يوم واحد من التجربة بحيث يكون هناك 1 × 107 خلايا في يوم التجربة.

  1. إعداد الخلايا الملتصقة للتجربة
    1. البذور 5-8 × 106 خلايا معتنقة في 20 مل من المتوسط (انظر جدول المواد لتكوين) لكل شرط في أطباق 14.5 سم قبل يوم واحد من بدء التجربة.
    2. في يوم التجربة ، تأكد من أن الخلايا هي التقاء بنسبة 80-90 ٪ وتمسك الطبق. تجاهل المتوسط وإضافة وسط جديد إلى الخلايا الملتصقة.
  2. إعداد خلايا التعليق للتجربة
    1. ضع بعناية 1 × 107 خلايا تعليق في 10 مل من متوسط الثقافة (انظر جدول المواد للتكوين) لكل حالة في أطباق 14.5 سم قبل بدء التجربة مباشرة.
    2. إذا كنت تستخدم الخلايا الأساسية، قم بعزل الخلايا التائية الأساسية وفقا للإجراء21الموصوف سابقا. علاج الخلايا التائية الأولية مع 1 ميكروغرام / مل phytohemagglutinin لمدة 24 ساعة، تليها 25 U / مل IL2 العلاج لمدة 6 أيام.
    3. ضع بعناية 1 × 108 خلايا تي الأولية في 10 مل من المتوسطة الثقافة (انظر جدول المواد لتكوين) لكل شرط في أطباق 14.5 سم مباشرة قبل بدء التجربة.
      ملاحظة: ينصح بهذا العدد الأعلى من الخلايا التائية الأساسية، حيث أن هذه الخلايا أصغر.

2. CD95L التحفيز

  1. تحفيز الخلايا مع CD95L (المنتجة كما هو موضح سابقا20 أو المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد)).
    ملاحظة: تركيز CD95L ووقت التحفيز هي خلية نوع تعتمد13,15,22,23,24,25. إعداد شرط تحفيز واحد مرتين لتوليد عينة "التحكم في حبة" بالتوازي.
    1. تحفيز الخلايا الملتصقة بتركيز محدد من CD95L. عقد لوحة في زاوية وماصة ليغاند في الوسط دون لمس الخلايا الملتصقة.
    2. تحفيز خلايا التعليق مع CD95L عن طريق pipetting الحل ليغاند في تعليق الخلية.

3. حصاد الخلية وتحلل

  1. ضع أطباق الزنزانة على الثلج.
    ملاحظة: لا تجاهل الوسيطة. تطفو الخلايا المحتضرة في الوسط وهي مهمة للتحليل.
  2. إضافة 10 مل من المالحة الباردة الفوسفات المخزنة (PBS) إلى تعليق الخلية وكشط الخلايا المرفقة قبالة لوحة. جمع تعليق الخلية في أنبوب 50 مل.
  3. غسل طبق الخلية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة مرتين ووضع محلول الغسيل في نفس أنبوب 50 مل. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية.
  4. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل.
  5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
  6. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من العازلة تحلل (تحتوي على 4٪ كوكتيل مثبطات البروتيز). احتضنه لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  7. الطرد المركزي lysate في أقصى سرعة (~ 17000 × غرام)لمدة 15 دقيقة ، 4 درجة مئوية.
  8. نقل supernatant (lysate) إلى أنبوب نظيف. تجاهل بيليه. خذ 50 ميكرولتر من اللذوب في أنبوب آخر. تحليل تركيز البروتين من قبل برادفورد المقايسة واتخاذ كمية من التحلل المقابلة ل25 ميكروغرام من البروتين في قارورة. أضف مخزن التحميل المؤقت (راجع جدول المواد للتركيب) إلى القارورة. تخزينه في -20 درجة مئوية كما lysate التحكم.

4. التكفير المناعي (IP)

  1. إضافة 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة APO-1 و 10 ميكرولتر من البروتين حبات سيفاروز (أعدت على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) إلى lysate. أضف 10 ميكرولتر فقط من الخرز إلى أنبوب منفصل يحتوي على lysate (عينة محفزة) لتوليد "عنصر تحكم حبة".
    ملاحظة: استخدام نصائح pipet مع فتحات واسعة إما عن طريق قطع النصائح أو شراء نصائح خاصة للملكية الفكرية أثناء التعامل مع البروتين حبات سيفاروز.
  2. احتضان خليط من اللحواف مع الأجسام المضادة / البروتين حبات سيفاروز مع خلط لطيف بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. الطرد المركزي ليسات مع الأجسام المضادة / البروتين حبات سيفاروز في 500 × غرام لمدة 4 دقائق، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى الخرز، وتكرار هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل.
  3. تجاهل الناتنات الفائق. يستنشق الخرز ويفضل مع حقنة هاملتون 50 ميكرولتر.

5. بقعة الغربية

  1. أضف 20 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت 4x (انظر جدول المواد للتركيب) إلى الخرز والحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. سخني عناصر التحكم في التسليك عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. تحميل الليزات، IPs، ومعيار البروتين على 12.5٪ هلام كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) (انظر جدول المواد لإعداد هلام) وتشغيل مع الجهد المستمر من 80 V.
  3. نقل البروتينات من هلام SDS إلى غشاء النيتروسليلوز.
    ملاحظة: هنا، تم استخدام تقنية شبه جافة، الأمثل للبروتينات ذات الفائدة، لنقل أكثر من 12 دقيقة (25 V؛ 2.5 A = ثابت). نقع غشاء النيتروسليلوز واثنين من مداخن نقل صغيرة الحجم في العازلة الكهربائي (انظر جدول المواد لتكوين، وإعداد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) لبضع دقائق قبل النشاف الغربي.
  4. ضع الغشاء الملطخ في صندوق وحجبه لمدة ساعة واحدة في محلول الحجب (0.1٪ توين-20 في PBS (PBST) + 5٪ حليب). احتضان الغشاء مع حل حجب تحت التحريض لطيف.
  5. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل غسل.

6. غرب كشف لطخة

  1. إضافة أول الأجسام المضادة الأولية في التخفيف المشار إليها (انظر جدول المواد)إلى الغشاء واحتضانه بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع التحريض لطيف.
  2. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل غسل.
  3. احتضان الغشاء مع 20 مل من الأجسام المضادة الثانوية (المخفف 1:10،000 في PBST + 5٪ الحليب) مع اهتزاز لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل غسل.
  5. تجاهل PBST وإضافة ما يقرب من 1 مل من ركيزة البيروكسيديز الفجل إلى الغشاء.
  6. الكشف عن إشارة كيمولومينسنت (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يعتمد وقت التعرض وعدد الصور الملتقطة على كمية البروتين في الخلية وخصوصية الأجسام المضادة المستخدمة. يجب أن يتم إنشاؤه تجريبيا لكل الأجسام المضادة المستخدمة للكشف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لتحليل caspase -8 التوظيف إلى القرص ومعالجتها في القرص CD95 ، هذه الورقة يصف سير العمل الكلاسيكية ، الذي يجمع بين الملكية الفكرية للقرص CD95 مع تحليل لطخة الغربية. وهذا يسمح للكشف عن العديد من السمات الرئيسية لتفعيل caspase-8 في DISC: تجميع منصة caspase-8-activating الجزيئية، وتجنيد procaspase-8 إلى القرص، ومعالجة هذا c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد وصف هذا النهج في البداية كيشكل وآخرون27 وقد طورته بنجاح منذ ذلك الحين عدة مجموعات. ويتعين النظر في عدة مسائل هامة من أجل كفاءة معالجة الكاسباس -8 في هذا المجمع.

أولا، من الضروري اتباع جميع خطوات الغسيل أثناء التكفير المناعي. أهمية خاصة هي الخطوات النهائية لغس?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgements

نعترف بمؤسسة فيلهلم ساندر (2017.008.02)، ومركز الأنظمة الديناميكية (CDS)، الممول من قبل صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي) وبرنامج DFG (LA 2386) لدعم عملنا. نشكر كارينا غوتيك لدعمها تجاربنا. نحن نعترف البروفيسور ديرك راينهولد (OvGU، ماغديبورغ) لتوفير لنا الخلايا التائية الأولية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12.5% SDS gelself madefor two separating gels:
3.28 mL distilled H2O
2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M
4.06 mL acrylamide
100 µL 10% SDS
100 µL 10% APS
7.5 µL TEMED

for two collecting gels:
3.1 mL distilled H2O
1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M
0.5 mL acrylamide
50 µL 10% SDS
25 µL 10% APS
7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishesGreiner639160
acrylamideCarl RothA124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orificeVWR46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin AbSigma AldrichA2103dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Abprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by EnzoALX-805-038-C100used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Abcell signaling9662 Sdilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-242-C100dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-961-0100dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOADI-AAM-212-Edilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Abcell signaling9542dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford solution
Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml		Bio Rad500-0006used according to manufacturer's instructions
CD95Lprovided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-522-020-C005
chemoluminescence detector
Chem Doc XRS+		Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, MgPAN BiotechP04-53500dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis bufferself made10x electrophoresis buffer:
60.6 g Tris
288 g glycine
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 dilution before usage
glycineCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001for activation of T cells
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
loading buffer
4x Laemmli Sample Buffer,10 mL		Bio Rad161-0747prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrateMilliporeWBLUFO500
lysis bufferself made13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M
27.5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/LPAN BiotechP04-41154adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cellsgibco by Life Technologie21875034adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powderCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTself made20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milkself made50 g milk powder + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801for activation of T Cells
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beadsNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraperVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
shakerHeidolph
sodium azideCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacksBio Rad170-4270used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membraneBio Rad170-4270used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000

References

  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 CD95 8

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved