JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

يصف هذا العمل تحضير مستخلص الخلايا من الإشريكية القولونية (E. coli ) متبوعا بتفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) في أقل من 24 ساعة. يشرح شرح بروتوكول الحث الذاتي الخالي من الخلايا (CFAI) بالتفصيل التحسينات التي تم إجراؤها لتقليل إشراف الباحثين وزيادة كميات مستخلص الخلايا التي تم الحصول عليها.

Abstract

نمت توليف البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) كمنصة للتكنولوجيا الحيوية تلتقط آلات النسخ والترجمة في المختبر. جعلت العديد من التطورات منصة CFPS أكثر سهولة للمستخدمين الجدد ووسعت نطاق التطبيقات. بالنسبة لأنظمة CFPS القائمة على التحلل ، يمكن توليد مستخلصات الخلايا من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ، وتسخير الكيمياء الحيوية الفريدة لهذا المضيف لزيادة تخليق البروتين. خلال السنوات ال 20 الماضية ، أصبحت الإشريكية القولونية (E. coli) واحدة من أكثر الكائنات الحية استخداما على نطاق واسع لدعم CFPS بسبب قدرتها على تحمل التكاليف وتنوعها. على الرغم من العديد من التطورات الرئيسية ، ظل سير العمل لإعداد مستخلص خلايا E. coli عنق الزجاجة الرئيسي للمستخدمين الجدد لتنفيذ CFPS لتطبيقاتهم. يستغرق سير عمل إعداد المستخلص وقتا طويلا ويتطلب خبرة فنية لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. للتغلب على هذه الحواجز، أبلغنا سابقا عن تطوير سير عمل الحث التلقائي (CFAI) الخالي من الخلايا على مدار 24 ساعة والذي يقلل من مدخلات المستخدم والخبرة التقنية المطلوبة. يقلل سير عمل CFAI من العمالة والمهارة التقنية المطلوبة لتوليد مستخلصات الخلايا مع زيادة إجمالي كميات مستخلصات الخلايا التي تم الحصول عليها. هنا نصف سير العمل هذا بطريقة خطوة بخطوة لتحسين الوصول ودعم التنفيذ الواسع النطاق ل CFPS القائم على E. coli.

Introduction

نما استخدام تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية بشكل كبير خلال السنوات القليلة الماضية1،2،3. ويمكن أن يعزى هذا التطور جزئيا إلى زيادة الجهود المبذولة لفهم العمليات التي تحدث في CFPS ودور كل مكون 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن انخفاض التكاليف المنسوبة إلى الإعدادات المحسنة ومصادر الطاقة البديلة جعلت التكنولوجيا الخالية من الخلايا أسهل في التنفيذ للمستخدمين الجدد6،7،8،9. من أجل تنفيذ عوامل النسخ والترجمة اللازمة لتخليق البروتين ، غالبا ما يستخدم مستخلص الخلايا لدفع التفاعلات الخالية من الخلايا10. قدمت أدلة المستخدم المنشورة مؤخرا بروتوكولات بسيطة لإنتاج مستخلص وظيفي ، مما يسهل تنفيذه للمستخدمين الجدد وذوي الخبرة على حد سواء 1،11،12،13،14. عادة ما يتم الحصول على مستخلص الخلايا من خلال تحلل مزرعة الخلايا ، والتي يمكن زراعتها باستخدام كائنات حية مختلفة اعتمادا على الاستخدام المحدد المطلوب1،15،16.

أصبحت الإشريكية القولونية (E. coli) بسرعة واحدة من الكائنات الحية المضيفة الأكثر استخداما لإنتاج مقتطفات وظيفية17. يفضل سلالة BL21 Star (DE3) لأنها تزيل البروتياز من الغشاء الخارجي (OmpT protease) والسيتوبلازم (Lon protease) ، مما يوفر بيئة مثالية لتعبير البروتين المؤتلف. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي DE3 على λDE3 الذي يحمل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (T7 RNAP) تحت سيطرة مروج lacUV5 ؛ يحتوي المكون النجمي على جين RNaseE متحور يمنع انقسام الحمض النووي الريبوزي المرسال4،14،18،19. تحت مروج lacUV5 ، يسمح تحريض الأيزوبروبيل ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) بالتعبير عن T7 RNAP20,21. تستخدم هذه السلالات لزراعة وحصاد الخلايا ، والتي تعطي المواد الخام لإعداد المستخلص. يمكن إجراء تحلل الخلايا باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق ، بما في ذلك ضرب الخرز ، والصحافة الفرنسية ، والتجانس ، والصوتنة ، وتجويف النيتروجين1،11،12،22.

عملية الزراعة البكتيرية والحصاد متسقة عبر معظم المنصات عند استخدام الإشريكية القولونية، ولكنها تتطلب عدة أيام وإشرافا مكثفا من الباحثين1،11،13. تبدأ هذه العملية عموما بزراعة البذور بين عشية وضحاها في مرق LB ، والذي عند النمو بين عشية وضحاها يتم تلقيحه بعد ذلك في ثقافة أكبر من 2xYTPG (الخميرة ، التربتون ، الفوسفات العازل ، الجلوكوز) في اليوم التالي. تتم مراقبة نمو هذه الثقافة الأكبر حتى تصل إلى مرحلة السجل المبكرة إلى المتوسطة ، بكثافة بصرية (OD) تبلغ 2.514,20. مطلوب قياس مستمر حيث ثبت سابقا أن مكونات النسخ والترجمة نشطة للغاية في مرحلة السجل المبكر إلى المتوسط23,24. في حين أن هذه العملية يمكن أن تخلق مستخلصا قابلا للتكرار ، فقد طور مختبرنا مؤخرا طريقة جديدة باستخدام وسائط الحث التلقائي الخالية من الخلايا (CFAI) ، مما يقلل من إشراف الباحثين ، ويزيد من العائد الإجمالي للمستخلص للتر معين من زراعة الخلايا ، ويحسن الوصول إلى إعداد المستخلص القائم على الإشريكية القولونية لكل من المستخدمين ذوي الخبرة والجدد (الشكل 1 ). نقدم هنا الدليل خطوة بخطوة لتنفيذ سير عمل CFAI ، للانتقال من لوحة مخططة من الخلايا إلى تفاعل CFPS مكتمل في غضون 24 ساعة.

Protocol

1. نمو وسائل الإعلام

  1. قم بإعداد 960 مل من وسائط CFAI كما هو موضح في الجدول 1 واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام KOH.
  2. انقل وسائط الثقافة إلى قارورة محيرة سعة 2.5 لتر وأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
  3. تحضير محلول سكر 40 مل كما هو موضح في الجدول 1. قم بتصفية المحلول في حاوية زجاجية منفصلة معقمة.
    ملاحظة: يمكن تخزين محلول السكر في حاضنة 30 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  4. اسمح للوسائط بأن تبرد تماما إلى أقل من 40 درجة مئوية بعد التعقيم.
  5. قبل تلقيح وسائط CFAI ، أضف محلول السكر مباشرة إلى وسائط CFAI.
  6. لتلقيح الوسائط، اسحب حلقة من المستعمرات من لوحة E. coli BL21 Star (DE3) المخططة سابقا وأدخلها مباشرة في الوسائط. قم بتدوير الحلقة في الوسائط ولكن تجنب لمس جوانب الحاوية. تأكد من أن لوحة الخط طازجة ، مع خلايا قابلة للحياة.
  7. ضع القارورة مع الوسائط الملقحة في حاضنة 30 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. اسمح للثقافة بالنمو بين عشية وضحاها. إذا تم تلقيح الخلايا في المساء ، فستصل الثقافة إلى كثافة بصرية تقريبية ، تقاس عند 600 نانومتر (OD600) ، من 10 في صباح اليوم التالي. يمكن تعديل أوقات التلقيح والحصاد حسب الحاجة.

2. حصاد الخلايا

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت S30 مقدما واحفظه باردا. قم بإعداد المخزن المؤقت S30 وفقا للجدول 2 ، إلى درجة الحموضة النهائية 8.2.
    ملاحظة: يمكن تحضير المخزن المؤقت S30 قبل أيام من حصاد الخلايا. إذا تم ذلك ، فاستعد بدون ديثيوثريتول وخزنه عند 4 درجات مئوية. أضف ديثيوثريتول قبل الاستخدام مباشرة.
  2. من هذه النقطة فصاعدا ، احتفظ بجميع الحلول والمواد على الجليد. انقل 1 لتر من الوسائط إلى زجاجة طرد مركزي سعة 1 لتر وأجهزة طرد مركزي بسرعة 5000 × جم بين 4-10 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ديكان والتخلص من supernatant. باستخدام ملعقة معقمة ، انقل الكريات إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا ووزنه سابقا 50 مل.
  3. اغسل مرة واحدة باستخدام 30-40 مل من المخزن المؤقت S30 البارد عن طريق تعليق الكريات عن طريق الدوامة في رشقات نارية لمدة 30 ثانية مع فترات راحة على الجليد.
    ملاحظة: نظرا لارتفاع حجم الكريات ، يمكن أن يكون تقسيم حبيبة الخلية إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل مفيدا لخطوة الغسيل. يوفر تخزين الخلايا في أليكوتس أصغر أيضا مرونة للمعالجة النهائية.
  4. جهاز الطرد المركزي إعادة تعليق الخلية عند 5000 × g بين 4-10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. تخلص من السوبرناتانت وامسح أي فائض من الجدران الداخلية للأنبوب المخروطي سعة 50 مل باستخدام منديل نظيف ، وتجنب لمس الكريات نفسها. وزن وفلاش تجميد بيليه في النيتروجين السائل. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    ملاحظة: قد لا تتطلب الكريات تجميدا سريعا إذا كان المستخدم يخطط للاستمرار في بروتوكول إعداد المستخلص.

3. استخراج التحضير

  1. امزج الكريات المجمدة مع 1 مل من المخزن المؤقت S30 لكل 1 غرام من حبيبات الخلية واتركيها تذوب على الجليد لمدة 30-60 دقيقة تقريبا. أعد تعليق الكريات المذابة عبر الدوامة في رشقات نارية من 30 ثانية مع فترات راحة على الجليد. دوامة حتى لا تكون هناك كتل مرئية من الخلايا المتبقية.
    ملاحظة: يمكن إعادة تعليق الكتل الصغيرة عن طريق الخلط باستخدام ماصة.
  2. نقل الأليكوتات من 1.4 مل من إعادة تعليق الخلية إلى أنابيب microfuge 1.5 مل لتحلل الخلايا. سونيك كل أنبوب بتردد 20 كيلو هرتز وسعة 50٪ لثلاث رشقات نارية من 45 ثانية مع 59 ثانية من الراحة لكل دورة محاطة بحمام جليدي. اقلب الأنبوب بين الدورات وأضف على الفور 4.5 ميكرولتر من 1 M dithiothreitol بعد دورة الصوتنة الأخيرة.
    ملاحظة: نظرا للحرارة المنبعثة من الصوتنة ، من المهم للغاية التأكد من الاحتفاظ بجميع الأليكوتات على الجليد عندما لا يتم صوتها. يجب تجديد حمام الثلج باستمرار أو كبير بما يكفي للبقاء باردا طوال عملية الصوتنة بأكملها.
  3. جهاز طرد مركزي لكل أنبوب عند 18000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. استرجع supernatant و aliquot إلى أنابيب microfuge 1.5 مل في 600 ميكرولتر aliquots. قم بتجميد الأليكوتات بسرعة وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. يجب توخي الحذر في ماصة فقط supernatant.

4. تخليق البروتين الخالي من الخلايا

  1. قم بإذابة أليكوت واحد من المستخلص من الخطوة السابقة لأداء 15 ميكرولتر من تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في أنابيب microfuge 1.5 مل في أربعة أضعاف.
  2. تحضير كل تفاعل عن طريق الجمع بين 240 نانوغرام من الحمض النووي (16 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) ، 2.20 ميكرولتر من المحلول A ، 2.10 ميكرولتر من المحلول B ، 5.0 ميكرولتر من المستخلص ، وحجم مختلف من الماء الجزيئي لملء التفاعل إلى 15 ميكرولتر. يمكن تحجيم هذا التفاعل إلى أحجام أكبر. انظر الجدول 3 للاطلاع على النسب.
    1. إعداد الحل ألف وباء وفقا للجدول 4. يمكن تحضير كل محلول على دفعات من 100 ميكرولتر إلى 1 مل ، وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية الحمض النووي اعتمادا على البروتين محل الاهتمام. في هذه الحالة ، تم تحسين البلازميد المستخدم ، pJL1-sfGFP ، ليعمل عند 16 ميكروغرام / مل ، أو 597 ميكرومتر.
  3. دع التفاعلات تعمل لمدة 4 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية.

5. تحديد كمية البروتين مراسل ، سوبر مجلد بروتين الفلورسنت الأخضر (sfGFP)

  1. باستخدام صفيحة بوليسترين سوداء نصف مساحة 96 بئرا ، اجمع 2 ميكرولتر من كل منتج تفاعل تخليق البروتين الخالي من الخلايا مع 48 ميكرولتر من 0.05 M HEPES العازلة عند الرقم الهيدروجيني 7.2. يوصى بثلاثة إلى أربعة نسخ متماثلة لكل أنبوب تفاعل.
  2. حدد كميا شدة التألق ل sfGFP بطول موجي للإثارة يبلغ 485 نانومتر وطول موجي للانبعاثات يبلغ 528 نانومتر.
  3. لتحويل وحدات التألق النسبية إلى عائد حجمي (ميكروغرام / مل) من sfGFP ، قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام pJL1-sfGFP المنقى .

النتائج

عند تحضير وسائط CFAI ، تم استبدال الجلوكوز بزيادة اللاكتوز والجلسرين كركيزة الطاقة الرئيسية في الوسائط. بالإضافة إلى ذلك ، تم زيادة سعة التخزين المؤقت لوسائط CFAI أيضا. وترد هذه المكونات المحددة في الجدول 1.

ثم نمت الخلايا إلى كل من OD600 من 10 والمعيار 2.5 في وسائط CFAI ?...

Discussion

هناك حاجة تقليديا إلى إشراف الباحث لإجراءين رئيسيين أثناء نمو الخلايا: تحريض T7 RNAP وحصاد الخلايا في OD600 محدد. CFAI يتجنب كل من هذه المتطلبات لتقليل وقت الباحث والتدريب الفني المطلوب من أجل إعداد مستخلصات الخلايا عالية الجودة. يتم تحقيق الحث التلقائي ل T7 RNAP عن طريق استبدال الجلوكوز باللا...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب مصالح مالي منافس.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للدكتورة جنيفر فاندركيلين وأندريا لاوبشر على الدعم الفني. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا نيكول غريغوريو وماكس ليفين وأليسا مولين وبيونغ تشول سو وأوغست بروكويل وإليزابيث (ليزي) فويفودا ولوغان بورينغتون وجيليان كاسمان على المناقشات المفيدة. يعترف المؤلفون أيضا بدعم التمويل من صندوق بيل وليندا فروست ، ومركز التطبيقات في منحة شيفرون للبحوث التطبيقية للتكنولوجيا الحيوية ، وأبحاث كال بولي ، والعلمية ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF-1708919).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microfuge TubesPhenixMPC-425Q
1L Centrifuge TubeBeckman CoulterA99028
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
CoASigma-AldrichC3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBiotekBTCYT5F
D-GlucoseFisherD16-3
D-LactoseAlfa AesarJ66376
DTTThermoFisher15508013
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
GlycerolFisherBP229-1
GlycineSigma-AldrichG7126-100G
HEPESThermoFisher11344041
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ArginineSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparagineSigma-AldrichA0884-25G
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100G
L-CysteineSigma-AldrichC7352-25G
L-Glutamic AcidSigma-AldrichG1501-500G
L-GlutamineSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-IsoleucineSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucineSigma-AldrichL8000-25G
L-LysineSigma-AldrichL5501-25G
L-MethionineSigma-AldrichM9625-25G
L-PhenylalanineSigma-AldrichP2126-100G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreonineSigma-AldrichT8625-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-TyrosineSigma-AldrichT3754-100G
Luria BrothThermoFisher12795027
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
Molecular Grade WaterSigma-Aldrich7732-18-5
NaClAlfa AesarA12313
NADSigma-AldrichN8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R IncubatorEppendorfM1335-0000
NH4(Glu)Sigma-Aldrich09689-250G
NTPsThermoFisherR0481
Oxalic AcidSigma-AldrichP0963-100G
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
Potassium Phosphate DibasicAcros, OrganicsA0382124
Potassium Phosphate MonobasicAcros, OrganicsA0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
tRNASigma-Aldrich10109541001
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Ultrasonic ProcessorQSonicaQ125-230V/50HZ
Yeast ExtractFisher Bioreagents1/2/8013

References

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

Erratum


Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved