تحسين قابلية التكرار لتلبية الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية إرشادات 2018 في تحليل تتبع الجسيمات النانوية

Summary

تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لتوصيف الحويصلات خارج الخلية. تسلط هذه الورقة الضوء على المعلمات والضوابط التجريبية NTA بالإضافة إلى طريقة موحدة لتحليل وتوصيف العينات والمخففات اللازمة لاستكمال المبادئ التوجيهية المقترحة من قبل MISEV2018 و EV-TRACK للتكرار بين المختبرات.

Abstract

كان تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) أحد طرق التوصيف العديدة المستخدمة في أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV) منذ عام 2006. يعتبر الكثيرون أن أدوات NTA وحزم برامجها يمكن استخدامها بسهولة بعد الحد الأدنى من التدريب وأن معايرة الحجم ممكنة داخليا. نظرا لأن كل من اقتناء NTA وتحليل البرامج يشكلان توصيفا للمركبات الكهربائية ، فقد تم تناولهما في الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية 2018 (MISEV2018). بالإضافة إلى ذلك ، تم رصدها من خلال الإبلاغ الشفاف ومركزية المعرفة في أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV-TRACK) لتحسين متانة تجارب EV (على سبيل المثال ، تقليل التباين التجريبي بسبب العوامل غير المنضبطة).

على الرغم من الجهود المبذولة لتشجيع الإبلاغ عن الأساليب والضوابط ، فإن العديد من الأوراق البحثية المنشورة تفشل في الإبلاغ عن الإعدادات الحرجة اللازمة لإعادة إنتاج ملاحظات NTA الأصلية. ويشير عدد قليل من الأوراق البحثية إلى توصيف NTA للضوابط أو المخففات السلبية، على افتراض واضح أن المنتجات المتاحة تجاريا، مثل المياه المالحة العازلة بالفوسفات أو المياه المقطرة فائقة النقاء، خالية من الجسيمات. وبالمثل ، نادرا ما يتم الإبلاغ عن الضوابط الإيجابية أو معايير الحجم من قبل الباحثين للتحقق من حجم الجسيمات. تتضمن معادلة ستوكس-أينشتاين متغيرات لزوجة العينة ودرجة الحرارة لتحديد إزاحة الجسيمات. وبالتالي ، فإن الإبلاغ عن درجة حرارة غرفة الليزر المستقرة أثناء جمع عينة الفيديو بالكامل هو إجراء تحكم أساسي للتكرار الدقيق. كما لا يتم الإبلاغ عن ترشيح العينات أو المخففات بشكل روتيني ، وإذا كان الأمر كذلك ، فنادرا ما يتم تضمين تفاصيل المرشح (الشركة المصنعة ، ومواد الغشاء ، وحجم المسام) وظروف التخزين. يجب أن تتضمن معايير الحد الأدنى من المعايير التي وضعتها الجمعية الدولية للحويصلة خارج الخلية (ISEV) للتفاصيل التجريبية المقبولة بروتوكول NTA موثق جيدا لتوصيف المركبات الكهربائية. توفر التجربة التالية دليلا على أن بروتوكول تحليل NTA يحتاج إلى إنشاء بروتوكول تحليل من قبل الباحث الفردي وتضمينه في طرق المنشورات التي تستخدم توصيف NTA كأحد الخيارات لتلبية متطلبات MISEV2018 لتوصيف الحويصلة الواحدة.

Introduction

يمثل التحليل الدقيق والقابل للتكرار للمركبات الكهربائية وغيرها من الجسيمات ذات مقياس النانومتر العديد من التحديات عبر البحث والصناعة. كان تكرار أبحاث EV صعبا ، جزئيا ، بسبب عدم وجود توحيد في الإبلاغ عن المعلمات الضرورية المرتبطة بجمع البيانات. لمعالجة أوجه القصور هذه ، اقترحت ISEV إرشادات الصناعة كمجموعة دنيا من المعايير الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والوظيفية للباحثين في مجال EV ونشرتها كبيان موقف ، يشار إليه عادة باسم MISEV2014¹. تطلبت الوتيرة المتسارعة لأبحاث السيارات الكهربائية مبدأ توجيهيا محدثا ، ووسع "MISEV2018: بيان موقف ISEV" إرشادات MISEV2014². تضمنت ورقة MISEV2018 جداول وخطوطا عريضة للبروتوكولات المقترحة وخطوات يجب اتباعها لتوثيق توصيف محدد مرتبط بالمركبات الكهربائية. وكتدبير إضافي لتسهيل تفسير التجارب وتكرارها، تم تطوير EV-TRACK كقاعدة معارف للتعهيد الجماعي (http://evtrack.org) لتمكين الإبلاغ بشكل أكثر شفافية عن بيولوجيا المركبات الكهربائية والمنهجية المستخدمة في النتائج المنشورة³. وعلى الرغم من هذه التوصيات المتعلقة بتوحيد أساليب الإبلاغ عن الأساليب، لا يزال الميدان يعاني فيما يتعلق بتكرار النتائج المنشورة وتأكيدها.

بما يتناسب مع جهود المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الوطنية للعلوم لأدوات تقييم الجودة ، تشير هذه الورقة إلى أن ISEV يتطلب تقارير موحدة عن الأساليب والتفاصيل بحيث يمكن تطبيق أدوات تقييم البيانات بهدف تكرار النتائج بين المختبرات. يعد الإبلاغ عن مصادر الخلايا وإجراءات زراعة الخلايا وطرق عزل المركبات الكهربائية عوامل مهمة لتحديد صفات سكان المركبات الكهربائية. ومن بين أدوات NTA، فإن عوامل مثل إعدادات الكشف، ومعامل الانكسار للسائل الناقل، ومجموعات الجسيمات غير المتجانسة التي تسهم في تعدد التشتت، وعدم وجود متطلبات إبلاغ موحدة، وغياب نتائج القياس داخل المراقبين وفيما بينهم، تجعل مقارنة NTA بين المختبرات صعبة أو مستحيلة.

يستخدم NTA منذ عام 2006 ، وهو طريقة شائعة لتحديد حجم الجسيمات النانوية وتحديد تركيزها والتي يستخدمها حاليا حوالي 80٪ من الباحثين في EV⁴. تتطلب إرشادات MISEV2018 شكلين من أشكال تحليل الحويصلة الواحدة ، والتي تعد NTA أحد الخيارات الشائعة. لا يزال NTA شائع الاستخدام لتوصيف EV بسبب إمكانية الوصول إليه على نطاق واسع ، والتكلفة المنخفضة لكل عينة ، ونظريته التأسيسية المباشرة (معادلة ستوكس - أينشتاين). يولد تقييم EV بواسطة NTA توزيعا لحجم الجسيمات وتقديرا للتركيز باستخدام تشتت ضوء الليزر وتحليل الحركة البراونية ، مع تحديد الحد الأدنى للكشف بواسطة معامل الانكسار لل EV. عند استخدام عينة سائلة من اللزوجة ودرجة الحرارة المعروفتين ، يتم تتبع مسارات المركبات الكهربائية لتحديد متوسط إزاحتها المربعة في بعدين. وهذا يسمح بحساب معامل انتشار الجسيمات وتحويله إلى قطر هيدروديناميكي مكافئ للكرة بواسطة معادلة ستوكس-أينشتاين المعدلة ^5,6,7. تحليل NTA للجسيمات إلى الجسيمات له تداخل أقل من قبل التكتلات أو الجسيمات الأكبر في مجموعة غير متجانسة من المركبات الكهربائية مقارنة بطرق التوصيف الأخرى⁷. في حين أن عددا قليلا من الجسيمات الكبيرة لها تأثير ضئيل على دقة التحجيم ، فإن وجود كميات دقيقة من الجسيمات الكبيرة عالية تشتت الضوء يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في اكتشاف الجسيمات الأصغر بسبب انخفاض برنامج اكتشاف EV وتتبع⁸. كتقنية قياس ، يعتبر NTA عموما غير منحاز للجسيمات الأكبر أو مجاميع الجسيمات ولكن يمكنه حل المجموعات السكانية متعددة الأحجام من خلال تحليل الجسيمات الفردية⁹. بسبب استخدام تشتت الضوء بواسطة الجسيمات ، فإن أحد قيود تحليل NTA هو أن أي جسيمات مثل الغبار أو البلاستيك أو المسحوق ذات سمات انكسار وحجم مماثلة مقارنة بالمركبات الكهربائية لا يمكن تمييزها عن المركبات الكهربائية الفعلية من خلال طريقة التوصيف هذه.

تم بيع NanoSight LM10 (محلل حجم الجسيمات النانوية) و LM14 (وحدة الليزر) منذ عام 2006 ، وعلى الرغم من تطوير نماذج أحدث من هذا الجهاز ، إلا أن هذا النموذج الخاص موجود في العديد من المرافق الأساسية ويعتبر بمثابة العمود الفقري الموثوق. هناك حاجة إلى التدريب لتحسين إعدادات NTA بشكل صحيح للحصول على قياسات عالية الدقة للحجم والتركيز. الإعدادان المهمان اللازمان لتسجيل الفيديو الأمثل هما (1) مستوى الكاميرا و (2) عتبة الكشف. يجب أن يتم تعيينها من قبل المشغل بناء على خصائص العينة. أحد القيود الرئيسية لتحليل NTA هو التوصية بتركيزات العينة بين 10⁷ و 10⁹ جسيمات / مل ، لتحقيق هذا التخفيف من العينة قد يكون مطلوبا¹⁰. نادرا ما تكون المحاليل المستخدمة للتخفيف ، مثل المياه المالحة العازلة بالفوسفات ، أو محلول ملحي 0.15 متر ، أو المياه فائقة النقاء ، خالية من الجسيمات التي يقل حجمها عن 220 ميكرومتر ، مما قد يؤثر على قياسات NTA. يجب إجراء توصيف NTA للحلول المستخدمة للتخفيف على نفس مستوى الكاميرا وعتبة الكشف مثل عينات الجسيمات النانوية التي يتم تحليلها. نادرا ما يتم تضمين حجم وتركيز الجسيمات النانوية الموجودة في المخففات المستخدمة في تخفيفات عينات EV في المنشورات التي تنطوي على تحليل NTA للمركبات الكهربائية.

يستخدم هذا البروتوكول تحليل NTA للجسيمات الشحمية الاصطناعية الشبيهة ب EV التي تم تقييمها باستخدام مستويات الكاميرا المحددة وعتبات الكشف والتصفية الميكانيكية للعينات لتحليل التأثيرات المنهجية لمستوى الكاميرا أو عتبة الكشف أو ترشيح العينة على مجموعة بيانات NTA. تم تصنيع الجسيمات الشحمية كما هو موضح في الملف التكميلي S1. تم استخدام الجسيمات الشحمية الاصطناعية في هذه التجربة بسبب توحيد حجمها وخصائصها الفيزيائية واستقرارها في التخزين عند 4 درجات مئوية. على الرغم من أنه كان من الممكن استخدام عينات فعلية من المركبات الكهربائية ، إلا أن تباين واستقرار المركبات الكهربائية أثناء التخزين قد يكون قد عقد هذه الدراسة وتفسيرها. تشير أوجه التشابه في تقارير NTA من (A) الجسيمات الشحمية و (B) EVs إلى أن التأثيرات المنهجية التي تم الكشف عنها للجسيمات الشحمية في هذه الورقة من المرجح أن تنطبق أيضا على توصيف EV (الشكل 1). تدعم هذه النتائج مجتمعة فكرة أن الإبلاغ الكامل عن إعدادات البرامج الحرجة ووصف معالجة العينات ، مثل التخفيف والتخفيف والترشيح ، يؤثر على قابلية تكرار بيانات NTA.

الغرض من هذه الورقة هو إثبات أن تغيير إعدادات NTA (درجة الحرارة ومستوى الكاميرا وعتبة الكشف) وإعداد العينات يغير النتائج التي تم جمعها: تم الحصول على اختلافات منهجية وكبيرة في الحجم والتركيز. نظرا لأن NTA هو أحد الخيارات الشائعة للوفاء بمواصفات توصيف MISEV2018 ، فإن هذه النتائج توضح أهمية إعداد إعداد العينات وإعدادات NTA لضمان قابلية التكرار.

الشكل 1: تقارير NTA التمثيلية لمقارنة الجسيمات الشحمية بالمركبات الكهربائية. (أ) الجسيمات الشحمية: عينة غير مفلترة مميزة على NTA في 12 مارس 2020. (ب) المركبات الكهربائية: عينة غير مفلترة مميزة على NTA في 26 أغسطس 2021. الاختصارات: NTA = تحليل تتبع الجسيمات النانوية; EVs = الحويصلات خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. المبادئ التوجيهية العامة للبروتوكول

1. حافظ على المجهر على طاولة هوائية أو على الأقل على طاولة خالية من الاهتزاز. تأكد من الحفاظ على الاهتزازات الدخيلة (على سبيل المثال ، النقر على القدم على الأرض ، ولمس الطاولة ، وإغلاق الأبواب ، وحركة المرور في المختبر) إلى الحد الأدنى.
2. اضبط درجة حرارة وحدة الليزر وحافظ عليها عند درجة حرارة ثابتة لجميع تسجيلات الفيديو.
   ملاحظة: كانت درجة الحرارة المختارة 25 درجة مئوية لأن محلل حجم الجسيمات النانوية تمت معايرته عند درجة الحرارة تلك. لذلك ، من المهم أن يعرف جميع مستخدمي الأداة درجة الحرارة المعايرة ويستخدمونها. درجة حرارة الغرفة ليست إعدادا مقبولا لأنها يمكن أن تختلف.
3. تأكد من أن جميع المواد المخففة، التي تسمى أيضا عناصر التحكم السلبية (على سبيل المثال، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من دولبيكو، والماء المقطر فائق النقاء [DW])، تتميز جميعها بتقنية NTA باستخدام نفس مستوى الكاميرا وعتبة الكشف مثل عينات الجسيمات النانوية التي يتم قياسها. استخدام DPBS المميزة لتنظيف وحدة الليزر وتخفيف العينات. عامل الملوثات في DPBS السلبية التحكم في نتائج العينة إذا كانت مستوياتها كبيرة.
4. تخزين العينات في 4 درجات مئوية قبل التقييم وعدم تجميدها أبدا لأن هذا من شأنه أن يؤدي إلى تدهور عينة الجسيمات الشحمية. قم بتسخين العينات / المعايير / المخففات إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل التحليل.
   ملاحظة: كانت مناولة العينات خاصة بالمواد التي يتم فحصها.
5. تقييم العينة والمعايير باستخدام القياس السريع لإنشاء تخفيف مناسب للحصول على 10⁷ إلى 10⁹ جسيمات / مل (حوالي 50 إلى 100 جسيم / شاشة فيديو NTA) تم تحديدها لتكون مثالية لتحليلات NTA.
   ملاحظة: وجد المؤلفون أن تركيزات الجسيمات في الطرف الأعلى من هذا النطاق تنتج نتائج أكثر اتساقا وقابلة للتكرار.
6. املأ جميع الحقول القابلة للتطبيق داخل مربع الالتقاط في علامة التبويب SOP لكل من القياسات السريعة والقياسية، بما في ذلك التخفيف والتخفيف المستخدمان.

2. إعداد معايير معايرة حجم 50 نانومتر و 100 نانومتر

ملاحظة: انظر جدول المواد.

1. 50 نانومتر حجم معايير النقل المخففة 1:5,000
   1. أضف 2 ميكرولتر من معايير 50 نانومتر إلى 9,998 ميكرولتر من كلوريد البوتاسيوم 10 ميكرومتر المصفى 0.22 ميكرومتر (KCl) / 0.03٪ Tween 20 في DW فائق النقاء في أنبوب مخروطي 15 مل يتم شطفه مرتين. قم بتخزين معيار 50 نانومتر المخفف عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى عام.
2. 100 نانومتر حجم معايير النقل المخففة 1:333
   1. أضف 30 ميكرولتر من معايير 100 نانومتر إلى 9,970 ميكرولتر من 0.22 ميكرومتر مصفى 10 ميكرومتر KCl / 0.03٪ Tween 20 في DW فائق النقاء في أنبوب مخروطي 15 مل يتم شطفه مرتين. قم بتخزين معيار 100 نانومتر المخفف عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى عام.

3. تنظيف وتجميع وحدة الليزر

1. افحص بصريا وحدة الليزر ونوافذ غطاء خلية التدفق بحثا عن الخدوش أو العيوب.
   ملاحظة: إذا تعرض أي من السطحين الزجاجيين للخدش، فقد يتأثر التصوير.
2. نظف كلا السطحين الزجاجيين بلطف باستخدام منظف العدسات عالي الجودة وورق العدسة. لا تستخدم مناديل مبللة أو مناشف ورقية على الأسطح الزجاجية.
3. تأكد من أن ختم الحلقة O يجلس بشكل صحيح في أخدود غطاء خلية التدفق قبل التجميع.
4. ضع غطاء خلية التدفق على وحدة الليزر ، مما يضمن أن تكون جهات الاتصال الكهربائية في الاتجاه الصحيح. ضع 4 مسامير إبهام محملة بنابض من خلال لوحة خلية التدفق وقم بإشراك خيوط وحدة الليزر ولكن لا تشد بشكل فردي.
5. وضع ضغط موحد لأسفل على غطاء خلية التدفق ، وتشديد مسامير الإبهام بشكل موحد بطريقة قطرية متناوبة حتى تكون دافئة. قم فقط بتشديد مسامير الإبهام حتى يتم إحكام الإصبع. لا تبالغ في الشد.
   ملاحظة: يمكن أن يؤدي الشد غير المتساوي لمسامير الإبهام إلى تكسير سطح وحدة الليزر. سوف "تذهب" مسامير الإبهام المصممة حديثا إلى الأسفل عند الضغط المناسب ، مما يتجنب الإفراط في الشد المحتمل.

4. إجراء التنظيف لوحدة الليزر قبل وبين العينات

1. استخدم حاوية مفتوحة حديثا من DPBS و aliquot في أنابيب البولي بروبيلين ثلاثية الشطف سعة 15 مل. تأكد من أن المنتجات المستخدمة لمسح العينات أو تخفيفها تتميز ب NTA قبل الاستخدام (انظر الخطوة 1.3).
2. اغسل محاقن درنية سعة 1 مل مع محولات قفل الانزلاق 3 مرات مع 1 مل من DPBS لإزالة أي بقايا جسيمات. استخدم أي من المنفذين كمدخل ولكن استخدمه باستمرار أثناء التجربة. لا تستخدم محاقن أكبر بسبب خطر كسر منافذ المحاقن من زيادة وزن وحجم المحقنة.
3. قم بإزالة المكبس والتخلص منه من حقنة السل 1^st وأدخله في المنفذ المتبقي ليكون بمثابة خزان مخفف / عينة فارغ.
   ملاحظة: سيؤدي الفشل في إزالة المكبس إلى زيادة الضغط في غرفة العينة والتسرب حول الختم.
4. املأ المحقنة^{الثانية} ب 1 مل من DPBS وقم بإرفاقها بمنفذ المدخل لغطاء خلية التدفق.
5. أمسك وحدة الليزر مائلة مع رفع منفذ حقنة المخرج للسماح بتطهير الهواء من الغرفة أثناء حقن DPBS ببطء في وحدة الليزر.
6. اطرد DPBS المتبقية من وحدة الليزر عن طريق حقن 1 مل من الهواء في منفذ المدخل. كرر التنظيف 2 مرات أكثر.
7. قم بإفراغ وحدة الليزر على أكمل وجه ممكن بعد آخر تدفق.
   ملاحظة: من الضروري إجراء مسح شامل ودقيق بعد تحليل NTA لمعيار 50 نانومتر، حيث تستمر هذه الجسيمات في وحدة الليزر. وحدة الليزر جاهزة الآن للاستخدام.

5. وضع وحدة الليزر على مرحلة المجهر

1. حدد موقع أدلة محاذاة تركيز وحدة الليزر على ذراع المجهر (الشكل 2) وقم بمحاذاتها باستخدام مقبض التركيز البؤري.

الشكل 2: دليل محاذاة تركيز وحدة الليزر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. في مواجهة المجهر ، ضع وحدة الليزر في المرحلة المخددة وحركها بلطف قدر الإمكان إلى اليمين.
   ملاحظة: إذا تم ذلك بعناية، فسيكون من الأسهل تحديد موقع المحاذاة والنقطة البؤرية بين العينات.
3. قم بتشغيل مفتاح الروك في صندوق التحكم بالليزر.

6. التركيز وتحديد المواقع من وحدة الليزر

ملاحظة: يجب إجراء ذلك باستخدام سائل في الغرفة.

1. قم بتحميل برنامج NTA (انظر جدول المواد) من سطح المكتب.
   ملاحظة: قد يظهر خطأ، "درجة الحرارة H/W غير موجودة على COM3." ما عليك سوى إغلاق البرنامج وإعادة فتحه لإصلاحه.
2. انقر فوق بدء تشغيل الكاميرا ضمن علامة التبويب التقاط في الزاوية العلوية اليمنى. إذا تم إيقاف تشغيل الكاميرا تلقائيا بعد 5 دقائق، فما عليك سوى النقر فوق بدء تشغيل الكاميرا مرة أخرى لإعادة تشغيلها.
3. في نفس علامة التبويب، اضبط مستوى الكاميرا على 14 إلى 16 لتفتيح خط الليزر وتبسيط تحديد الجسيمات والتركيز البؤري.
4. قم بتحويل الصورة من الكاميرا إلى العدسات عن طريق تحريك شريط التمرير العلوي على الجانب الأيسر من غطاء الرأس للداخل أو للخارج.
5. أوجد المساحة ذات الكثافة المتزايدة، والتي يشار إليها عادة باسم بصمة الإبهام. قم بتوسيط بصمة الإبهام وتركيزها عموديا في مجال الرؤية.
   ملاحظة: سيكون خط الليزر على يسار بصمة الإبهام. قد يساعد تعتيم الغرفة في تسهيل تحديد موقع بصمة الإبهام والتركيز على خط الليزر.
6. مركز خط الليزر في مجال الرؤية ؛ حرك شريط التمرير العلوي لتحويل الضوء إلى الكاميرا كما هو ملاحظ على شاشة الكمبيوتر.
   ملاحظة: خط الليزر المرئي الآن على الشاشة هو صورة طبق الأصل لعرض العين. اليسار في العدسات سيكون الحق على شاشة الكمبيوتر.
7. اضبط التركيز البؤري لتوضيح صورة الجسيمات المتحركة الفردية على الشاشة باستخدام مقبض التركيز البؤري.
   ملاحظة: نظرا لعمق التركيز البؤري ، لن تكون جميع الجسيمات في التركيز البؤري ، وهو أمر مقبول. حتى الجسيمات التي تكون خارج نطاق التركيز البؤري قليلا سيتم التقاطها بواسطة الكاميرا وتحليلها بواسطة البرنامج.

7. تحميل المعايير / العينات / المخفف في وحدة الليزر لتحليل NTA

1. اسحب 1 مل من المعياري / العينة / المخفف في حقنة درنية 1 مل مغسولة وقم بتوصيلها بمنفذ المدخل لغطاء خلية التدفق. قم بتحريك المكبس حتى يتضح السائل في المحقنة المفتوحة المتصلة بمنفذ المخرج.
2. في طريقة عرض الكاميرا، انتقل إلى يمين خط الليزر إلى منطقة بها عدد موحد من الجسيمات. إذا لزم الأمر ، اضبط الاتجاه الرأسي لتوسيط نطاقات الضوء الأفقية. أعد التركيز البؤري حتى يظهر أكبر عدد من الجسيمات. ضمان الحفاظ على هذا الموقف قدر الإمكان بالنسبة لجميع التدابير اللاحقة.
3. اضبط مستوى الكاميرا بحيث يومض رمز المعلومات المظلمة بشكل متقطع في أعلى يسار عرض الكاميرا.
   ملاحظة: يساعد ذلك على ضمان إجراء تحديد متسق لمستوى الكاميرا عند الحد الأدنى من مستوى الحساسية لكل سلسلة من سلاسل جمع البيانات.
   ملاحظة: لا يمكن تغيير مستوى الكاميرا أثناء الالتقاط .

8. التحقق من صحة المعايرة

ملاحظة: يوصى بالتحقق من معايرة الوحدة النمطية باستخدام معايير الحجم (انظر القسم 2) قبل تحليل العينة. التحقق الروتيني ضروري لضمان قياسات دقيقة. في مختبر متعدد المستخدمين، يمكن أن تتسبب تعديلات المستخدم الفردية لإعدادات تكوين البرامج عن غير قصد في جمع بيانات غير دقيقة. بالنسبة لجمع البيانات الهامة، يعد التحقق اليومي مسألة ممارسة مختبرية جيدة. وينبغي إدراج إمكانية التكرار اليومي للتحقق من الصحة في النتائج المبلغ عنها. عادة ما يتم تعيين المعايرة بواسطة الفني ولا يمكن تعديلها من قبل المستخدم الفردي ما لم يكن لدى المستخدم حق وصول المسؤول. هذا يمنع إعادة التكوين غير المصرح به من قبل المستخدمين الفرديين.

1. معايير مخففة دافئة (انظر القسم 2) إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
2. دوامة المعايير لفترة وجيزة ثم تحميل كما هو موضح في القسم 7.
3. قم بإجراء نموذج NTA كما هو موضح في القسم 10 وسجل القيم للحساب اللاحق لمعامل التباين ، والذي يجب أن يكون أقل من 2٪ إذا تمت معايرته بشكل صحيح.

9. تحسين تركيز العينة ل NTA

ملاحظة: يجب أن تحتوي الشاشة على ما بين 50 و100 جسيم قابل للقياس عند ضبط مستوى الكاميرا وتركيز العينة بشكل صحيح. إذا كان هناك أي سؤال حول ما إذا كانت العينة تحتوي على رقم جسيم مناسب، فيمكن تشغيل قياس سريع على العينة في هذه المرحلة (راجع الخطوات من 9.1 إلى 9.7). يتم استخدامه لتقييم خصائص العينة بسرعة قبل التقاط الفيديو لفترة أطول. توجد علامة التبويب " قياس سريع" ضمن علامة التبويب SOP في المربع الأوسط السفلي.

1. اضبط مدة الالتقاط على 30 ثانية.
2. اقبل اسم الملف الأساسي الموجود أو أدخل اسم ملف جديد بالنقر فوق علامة التبويب ... لموقع تخزين جديد للبيانات التي تم إنشاؤها.
3. حدد المربع الخاص بدرجة الحرارة المستهدفة وأدخل درجة الحرارة المطلوبة.
4. قم بتحميل النموذج كما هو موضح سابقا (الخطوة 7.1) وانقر فوق إنشاء برنامج نصي وتشغيله.
5. انتظر حتى يتم عرض عدد الجسيمات لكل إطار في أسفل يمين شاشة الفيديو بعد الانتهاء من فيديو 30 ثانية. إذا كان عدد الجسيمات أكبر من 100 ، فقم بمسح وحدة الليزر 3 مرات (كما هو موضح سابقا في الخطوة 4.6).
6. قم بتخفيف العينة إلى نطاق التركيز المطلوب باستخدام المخفف المميز.
7. قم بتحميل العينة المخففة بشكل صحيح في وحدة الليزر التي تم مسحها وقم بتشغيل القياس السريع للتحقق من أن العينة ضمن النطاق المقبول.

10. عينة NTA

ملاحظة: تقع علامة التبويب " قياس قياسي" ضمن علامة التبويب SOP في المربع الأوسط السفلي وتستخدم لتحليل العينات الروتيني (راجع الخطوات من 10.1 إلى 10.12).

1. اضبط المدة على 30 أو 60 ثانية وعدد مقاطع الفيديو على 5.
2. اقبل اسم الملف الأساسي الموجود أو أدخل اسم ملف جديد بالنقر فوق علامة التبويب ... لموقع تخزين جديد للبيانات التي تم إنشاؤها.
3. حدد المربع الخاص بدرجة الحرارة المستهدفة وأدخل درجة الحرارة المطلوبة.
4. انقر فوق إنشاء برنامج نصي لإعادة استخدام هذا القياس القياسي.
5. بمجرد تحميل العينة كما هو موضح في القسم 7 وتصبح التجربة جاهزة للتشغيل، انقر فوق إنشاء برنامج نصي وتشغيله.
6. املأ الحقول في الشاشة المنبثقة تعيين تفاصيل التقرير بمعلومات عن عامل التشغيل ووصف العينة وتخفيف العينة والمخفف المستخدم.
   ملاحظة: سيتم تسجيل هذه المعلومات وطباعتها في التقرير التجريبي النهائي.
7. عند ملء كافة الحقول المطلوبة، انقر فوق موافق لبدء البرنامج النصي.
   ملاحظة: إذا تم تحديد درجة الحرارة المستهدفة ، فسيقوم السخان بتثبيت العينة في وحدة الليزر إلى درجة الحرارة المطلوبة لمدة 5 ثوان قبل السماح للبرنامج النصي بالمضي قدما في القياس. ستقوم لوحة التشخيص في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة بقراءة HEATER ON وعرض درجة حرارة العينة.
8. قبل كل التقاط فيديو، ابحث عن مطالبة بإدخال المكبس يدويا. حقن ~ 0.05 مل من العينة في غرفة الليزر واسمح للجسيمات بالوصول إلى "الراحة" (أي عدم التدفق) ، ثم انقر فوق موافق.
9. انتظر حتى يظهر مربع تأكيد الإعدادات عند الانتهاء من التقاط الفيديو^رقم 5 وحتى يومض مربع العملية . اضبط عتبة الكشف لمعالجة العينة من خلال ملاحظة عدد الصلبان الزرقاء التي تميز الجسيمات على الشاشة أثناء تقدم الإطارات يدويا من أسفل شاشة الفيديو. إذا كان هناك أكثر من 3-4 تقاطعات زرقاء تميز الجسيمات على كل شاشة أثناء تقدم الإطارات، فقم بزيادة عتبة الكشف.
   ملاحظة: الصلبان الزرقاء على الجسيمات الفردية مماثلة لتأثير "السرب" في قياس التدفق الخلوي ويجب تقليلها إلى الحد الأدنى لتحقيق الدقة المثلى وقابلية جمع البيانات للتكرار.
10. انقر فوق إعدادات موافق عندما تكون عتبة الكشف مقبولة.
11. انتظر حتى تتم معالجة مقاطع الفيديو تلقائيا وسيتم عرض رسم بياني للنتائج وإشعار مربع حوار بالاكتمال قبل النقر فوق موافق.
12. بمجرد ظهور المربع إعدادات التصدير ، احفظ النتائج بالنقر فوق تصدير.
    ملاحظة: سيتم تخزين كافة النتائج من مقاطع الفيديو والتحليلات في الملف الوجهة المحدد في الخطوة 10.2. هذا يتطلب كمية كبيرة من التخزين. راقب ونقل إلى جهاز تخزين ثانوي حسب الضرورة.

11. إعادة تحليل العينة الحالية عند عتبات الكشف المختلفة

ملاحظة: مباشرة بعد تحليل NTA (الخطوة 10)، يمكن إعادة تحليل البيانات باستخدام إعدادات عتبة الكشف المختلفة. ومع ذلك، لا يمكن تعديل مستوى الكاميرا بعد الالتقاط.

1. قم بتمييز جميع مقاطع الفيديو ال 5 المدرجة في التجربة الحالية.
2. انقر فوق معالجة الملفات المحددة، وانتظر حتى يظهر مربع تأكيد الإعداد ومربع العملية للوميض لتغيير عتبة الكشف.
3. اضبط عتبة الكشف إلى المستوى المطلوب وانقر فوق إعداد موافق.
4. انتظر حتى تتم معالجة مقاطع الفيديو تلقائيا وسيتم عرض رسم بياني للنتائج وإشعار مربع حوار بالاكتمال قبل النقر فوق موافق.
5. انقر على تصدير الإعدادات. عند إجراء تقييمات إضافية على أحدث عينة، تأكد من النقر فوق المربع تصدير النتائج في التجربة الحالية حيث لن يتم عرض المربع المنبثق تصدير النتائج بعد إعادة تحليل العينة.
   ملاحظة: نظرا لعدم وجود تذكيرات للقيام بذلك ، يمكن بسهولة التغاضي عنه ، وسيتم فقد التحليل. ومع ذلك ، ستبقى البيانات الأساسية ويمكن إعادة تحليلها لاحقا.

12. تحليل الملفات المؤرشفة

ملاحظة: إذا لم يتم حفظ التجارب التي تم تحليلها مسبقا أو إذا كانت هناك حاجة إلى إجراء تحليل إضافي على هذه العينات، فيمكن إعادة تحميل الملفات الفردية في برنامج NTA لإجراء تقييمات إضافية لعتبة الكشف . لا يمكن تعديل تغييرات مستوى الكاميرا بعد الالتقاط.

1. قم بتحميل برنامج NTA من سطح المكتب.
2. انقر فوق علامة التبويب تحليل في اللوحة الوسطى السفلية.
3. انقر فوق فتح التجربة وانتقل إلى ملف .nano المطلوب.
   ملاحظة: يجب أن تكون ملفات الفيديو المقترنة بتجربة .nano المحددة في نفس المجلد مثل ملف التجربة الرئيسي; خلاف ذلك ، سيظهر خطأ عند محاولة معالجة الملفات. أول 6 أرقام من اسم الملف هي تاريخ تشغيل التجربة (xx-xx-xx). آخر 6 أرقام من اسم الملف هي الوقت الذي تم فيه تسجيل الفيديو (xx-xx-xx) ومعرف الفيديو الفردي. يسرد ملف PDF لكل تجربة مدمجة ملفات .nano المضمنة لهذا التحليل.
4. انقر فوق معالجة الملفات المحددة لتشغيل التحليل.
5. بمجرد وميض مربع العملية للسماح بإجراء تغييرات في عتبة الكشف، قم بتعيين العتبة إلى المستوى المطلوب وانقر فوق موافق.
6. انتظر حتى تتم معالجة مقاطع الفيديو تلقائيا وسيتم عرض رسم بياني للنتائج وإشعار مربع حوار بالاكتمال قبل النقر فوق موافق.
7. انقر على تصدير النتائج. تأكد من النقر فوق المربع تصدير النتائج في التجربة الحالية، حيث لن يتم عرض المربع المنبثق تصدير النتائج بعد إعادة التحليل.
   ملاحظة: نظرا لعدم وجود تذكيرات للقيام بذلك ، يمكن بسهولة التغاضي عنه ، وسيتم فقد التحليل.

13. تنظيف وتفكيك وحدة الليزر

1. أوقف تشغيل صندوق التحكم بالليزر.
2. اغسل العينة بأكملها من وحدة الليزر وتخلص منها بشكل صحيح.
3. أمسك وحدة الليزر مائلة مع رفع منفذ المحقنة المفتوح للسماح بتطهير الهواء من الغرفة حيث يتم حقن DPBS ببطء في وحدة الليزر ويتم مسحه من منفذ حقنة المخرج.
4. اطرد DPBS المتبقية من وحدة الليزر وتخلص منها.
5. كرر التنظيف 2 مرات أكثر وإفراغ وحدة الليزر تماما قدر الإمكان بعد آخر تدفق.
6. وضع ضغط موحد لأسفل على غطاء خلية التدفق ، وفك مسامير الإبهام بشكل موحد بطريقة قطرية متناوبة حتى يتم فصلها عن الخيوط ، وإزالة مسامير الإبهام ، وتخزينها في علبة وحدة الليزر.
7. قم بإزالة غطاء خلية التدفق من وحدة الليزر.
8. نظف كلا السطحين الزجاجيين بلطف باستخدام منظف العدسات عالي الجودة وورق العدسة. لا تستخدم المناديل الورقية أو المناشف الورقية على الأسطح الزجاجية.
9. افحص بصريا وحدة الليزر وغطاء خلية التدفق "النوافذ" بحثا عن الخدوش أو العيوب بعد الاستخدام وأبلغ المشرف.
10. استبدل وحدة الليزر وغطاء خلية التدفق في حالتيهما لمنع تلف الأسطح الزجاجية أثناء التخزين.

14. بروتوكول تحليل العينات

1. العينات غير المصفاة
   1. قم بدرجة العينة قبل تحميل مقاطع فيديو 5 × 60 ثانية وتسجيلها في مستوى الكاميرا 12 ومستوى عتبة الكشف 3 كما هو موضح أعلاه. أعد تحليل مقاطع الفيديو هذه باستخدام عتبات الكشف 2 و5.
   2. كرر مجموعات الفيديو لنفس العينة في مستويي الكاميرا 13 و14 ومستوى عتبة الكشف 3. أعد تحليل مقطعي الفيديو الإضافيين هذين باستخدام عتبتي الاكتشاف 2 و5. كرر العملية بأكملها باستخدام مقاطع فيديو مقاس 5 × 30 ثانية في إعداد الإجراء التشغيلي الموحد.
2. العينات التي تمت تصفيتها
   1. دوامة العينة ثم تحميلها في وقت واحد وتصفيتها (0.22 ميكرومتر مرشح حقنة) مباشرة في وحدة الليزر.
      ملاحظة: تم مسح مرشح المحقنة مع 2 أضعاف حجم المساحة الميتة للمرشح قبل استخدامه لإزالة أي جسيمات مقيمة. كان لمرشحات المحاقن (انظر جدول المواد) مساحة ميتة مقاسة تبلغ 0.5 مل وتم مسحها ب 1.0 مل من العينة قبل القياسات. لاحظ نوع عامل التصفية في حقول بيانات الإجراء التشغيلي الموحد. تمت معالجة العينة التي تمت تصفيتها تماما كما هو موضح للعينات غير المصفاة في الخطوة 14.1.

15. التحليل الإحصائي لنتائج NTA

1. لتحليل التأثيرات أو التفاعلات الرئيسية ، قم بإجراء تحليل للتباين بعد التحقق من افتراضات ANOVA (طبيعية ، أحادية الواسطة ، تجانس التباين). استخدم Kruskal-Wallis ANOVA أحادي الاتجاه على الرتب في حالات فشل افتراضات ANOVA.
2. بعد عودة التأثيرات الرئيسية الهامة ، استخدم طريقة Dunn لإجراء اختبار الوسائل للمقارنات المخطط لها مسبقا. ضع في اعتبارك أن قيمة p البالغة 0.05 مهمة في الاختبار ثنائي الذيل.
   ملاحظة: تتوفر ملفات البيانات التي تم إنشاؤها هنا من المؤلفين بعد الانتهاء من اتفاقية نقل المواد.

النتائج

يحتوي الجدول 1 على نتائج مقاطع فيديو NTA لعينات الجسيمات الشحمية (18 تمت تصفيتها و 18 غير مصفاة) ومخفف DPBS تمثيلي. تم الانتهاء من المقارنات عبر المجموعتين بغض النظر عن مستوى الكاميرا أو عتبة الكشف في هذه الورقة. وكان متوسط قطر الجسيمات في العينات المصفاة 108.5 نانومتر، ووضع الجسيمات 86.2 نا...

Discussion

هناك عدة طرق متاحة لتقدير حجم وتركيز الجسيمات النانوية¹¹. وتشمل هذه الطرق الجماعية التي تولد تقديرا للحجم من السكان ، بما في ذلك تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، والترسيب بالطرد المركزي ، وتحليل مستوى الجسيمات الواحدة - المجهر الإلكتروني ، NTA ، مجهر القوة الذرية ، واستشعار النبض الم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container