JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الورقة طريقة قائمة على زراعة الإكسبولوجيا لعزل وزراعة خلايا العضلات الملساء الأبهرية البشرية الأولية الخاصة بالمريض والخلايا الليفية الجلدية. علاوة على ذلك ، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس تقلص الخلايا والتحليل اللاحق ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الاختلافات الخاصة بالمريض في هذه الخلايا.

Abstract

خلايا العضلات الملساء (SMCs) هي نوع الخلايا السائد في الوسط الأبهري. آلياتهم الانقباضية مهمة لنقل القوة في الشريان الأورطي وتنظم تضيق الأوعية وتوسع الأوعية. ترتبط الطفرات في الجينات المشفرة لبروتينات جهاز الانقباض SMC بأمراض الأبهر ، مثل تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري. يعد قياس انكماش SMC في المختبر أمرا صعبا ، خاصة بطريقة عالية الإنتاجية ، وهو أمر ضروري لفحص مواد المرضى. الطرق المتاحة حاليا ليست مناسبة لهذا الغرض. تقدم هذه الورقة طريقة جديدة تعتمد على استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية والركيزة (ECIS). أولا ، يتم وصف بروتوكول explant لعزل SMCs البشرية الأولية الخاصة بالمريض من خزعات الأبهر والخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية الخاصة بالمريض لدراسة تمدد الأوعية الدموية الأبهري. بعد ذلك ، يتم تقديم وصف مفصل لطريقة انكماش جديدة لقياس الاستجابة الانقباضية لهذه الخلايا ، بما في ذلك التحليل اللاحق والاقتراح لمقارنة المجموعات المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تقلص الخلايا الملتصقة في سياق الدراسات الانتقالية (القلبية الوعائية) ودراسات فحص المرضى والأدوية.

Introduction

خلايا العضلات الملساء (SMCs) هي نوع الخلايا السائد في الطبقة الإنسية الأبهرية، وهي الطبقة الأكثر سمكا في الشريان الأورطي. داخل الجدار ، يتم توجيهها شعاعيا وتشارك ، من بين وظائف أخرى ، في تضيق الأوعية وتوسيع الأوعية1. تشارك آلية الانقباض SMC في نقل القوة في الشريان الأورطي من خلال الرابط الوظيفي مع المصفوفة خارج الخلية2. ترتبط الطفرات في الجينات المشفرة لبروتينات جهاز انقباض SMC ، مثل سلسلة الميوسين الثقيلة للعضلات الملساء (MYH11) والأكتين العضلي الأملس (ACTA2) ، بحالات تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري العائلي ، مما يؤكد أهمية تقلص SMC في الحفاظ على السلامة الهيكلية والوظيفية للشريان الأورطي 1,2 . علاوة على ذلك ، ترتبط الطفرات في مسار إشارات TGFβ أيضا بتمدد الأوعية الدموية الأبهري ، ويمكن أيضا دراسة آثارها في الفيزيولوجيا المرضية لتمدد الأوعية الدموية الأبهري في الخلايا الليفية الجلدية3.

يعد قياس الإنتاجية العالية لانكماش SMC في المختبر تحديا. نظرا لأنه لا يمكن قياس انقباض SMC في الجسم الحي لدى البشر ، فإن الفحوصات المخبرية على الخلايا البشرية تقدم بديلا ممكنا. علاوة على ذلك ، فإن تطور تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) في النماذج الحيوانية إما مستحث كيميائيا عن طريق ، على سبيل المثال ، تروية الإيلاستاز ، أو ناجم عن طفرة محددة. لذلك ، لا يمكن مقارنة البيانات الحيوانية بتطور AAA في البشر ، والذي له في الغالب سبب متعدد العوامل ، مثل التدخين والعمر و / أو تصلب الشرايين. في المختبر تم قياس انقباض SMC حتى الآن بشكل رئيسي بواسطة الفحص المجهري لقوة الجر 4,5 ، وتحديد كمية تدفقات الكالسيوم داخل الخلايا Fura-2 الفلورية6 ، ومقايسات تجاعيد الكولاجين7. في حين أن الفحص المجهري لقوة الجر يوفر رؤية رقمية لا تقدر بثمن للقوى الناتجة عن خلية واحدة ، إلا أنه غير مناسب للفحص عالي الإنتاجية بسبب معالجة البيانات الرياضية المعقدة وتحليل خلية واحدة في كل مرة ، مما يعني أنه يستغرق وقتا طويلا جدا لقياس عدد تمثيلي من الخلايا لكل متبرع. تسمح اختبارات تجاعيد صبغة Fura-2 والكولاجين بالتحديد السطحي للانكماش ولا تعطي مخرجات رقمية دقيقة ، مما يجعلها أقل ملاءمة للتمييز بين الاختلافات الخاصة بالمريض. تم إثبات ضعف تقلص SMC في الخلايا المشتقة من الشريان الأورطي لمرضى تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني لأول مرة من خلال تحسين طريقة جديدة لقياس تقلص SMC في المختبر8. وقد تم ذلك عن طريق إعادة استخدام طريقة استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية (ECIS). ECIS هو اختبار متوسط الإنتاجية في الوقت الفعلي لتحديد حجم سلوك الخلايا الملتصقة وانكماشها9،10،11 مثل نمو SMC والسلوك في فحوصات التئام الجروح والهجرة 12،13،14. يتم وصف الطريقة الدقيقة في قسم البروتوكول. بهذه الطريقة المحسنة ، يمكن أيضا استخدام ECIS لدراسة تقلص الخلايا الليفية بسبب حجمها ومورفولوجيتها المتشابهة.

الهدف من هذه الورقة هو تقديم وصف تدريجي لطريقة قياس انكماش SMC في المختبر باستخدام ECIS8 ومقارنة الانكماش بين SMCs الضابطة والمريضة. أولا ، يتم شرح عزل وزراعة SMCs الأولية من خزعات الأبهر الضابطة والمريض ، والتي يمكن استخدامها لقياس الانقباض. ثانيا ، يتم وصف قياسات وتحليل الانكماش ، إلى جانب التحقق من تعبير علامة SMC. علاوة على ذلك ، تصف هذه الورقة طريقة عزل الخلايا الليفية الجلدية الخاصة بالمريض والتي يمكن قياس تقلصها باستخدام نفس المنهجية. يمكن استخدام هذه الخلايا للدراسات الخاصة بالمريض التي تركز على تمدد الأوعية الدموية الأبهري أو أمراض القلب والأوعية الدموية الأخرى15 أو الدراسات التنبؤية باستخدام بروتوكول التمايز الذي يسمح بقياس الانقباض قبل جراحة تمدد الأوعية الدموية16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على خزعات الأبهر أثناء إصلاح تمدد الأوعية الدموية المفتوح في المراكز الطبية بجامعة أمستردام ، المركز الطبي بجامعة VU ، أمستردام ، Zaans Medisch Centrum ، مستشفى Zaandam و Dijklander ، Hoorn ، هولندا. تم الحصول على أنسجة الأبهر الضابطة من قطعة الشريان الأورطي المرتبطة بالشريان الكلوي الذي تم حصاده لعمليات زرع الكلى. تم تضمين المرضى الذين تزيد أعمارهم عن 18 عاما فقط ، وأعطى جميع المرضى موافقتهم المستنيرة على المشاركة في الدراسة. تم جمع جميع المواد وفقا للوائح إعلان WMA في هلسنكي والمبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة الأخلاقيات الطبية التابعة لمركز VU الطبي. تم إجراء جميع التجارب والبروتوكولات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات الطبية في المركز الطبي VU. للحصول على معلومات كاملة حول التحكم وخطوط خلايا المريض المستخدمة، راجع 8.

1. عزل SMCs البشرية الأولية من خزعات الأبهر

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية تحت غطاء التدفق الرقائقي المعقم لزراعة الأنسجة. ارتداء القفازات واستخدام تقنيات التعقيم القياسية عند التعامل مع عينات الدم والأنسجة البشرية البشرية. يتم استزراع SMCs في 231 خلية العضلات الملساء الوعائية البشرية المتوسطة القاعدية مع 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، وملحق نمو العضلات الملساء المشار إليها باسم SMC المتوسطة.

  1. قم بتعقيم زوجين من الملقط الجراحي والمشرط عن طريق غمرهما في 70٪ من الإيثانول ثم مسحهما جافا.
  2. ماصة 2 مل من SMC المتوسطة في طبق بتري حيث سيتم إجراء تشريح الأنسجة.
  3. ماصة 2.5 مل من SMC متوسطة في قارورتين T25. قم بتدوير القوارير بحيث يغطي الحجم الصغير من الوسط السطح بأكمله.
  4. انقل خزعة جدار الأبهر البشري المحصود من غرفة العمليات إلى المختبر على الجليد في أنبوب بلاستيكي معقم مع محلول نقل الأنسجة الباردة والمعقمة (انظر جدول المواد) أو 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
  5. افتح الأنبوب مع الأنسجة داخل غطاء محرك الأنسجة. أخرج الخزعة من الأنبوب باستخدام الملقط المعقم وضعها في طبق بتري (الشكل 1A).
  6. افحص الخزعة بصريا لتحديد طبقات الأبهر الثلاث، الغلالة الداخلية (الداخلية)، الوسائط (الوسطى)، والطبقة الخارجية (الطبقة الخارجية). ابحث عن وجود لويحات تصلب الشرايين على الجانب الداخلي والنسيج الضام الغروي على الجانب العرضي (الشكل 1B) لتمييز الطبقات.
  7. لعزل SMCs عن الوسائط، قم بإزالة الطبقتين الأخريين. ضع المنديل مع جانب البلاك الداخلي لأعلى أولا (الشكل 1B). قم بإزالة البلاك الصلب عن طريق سحبه بعيدا عن الأنسجة باستخدام ملقط أثناء دفع الأنسجة لأسفل باستخدام الزوج الآخر من الملقط. قم بإزالة الطبقات اللاحقة من البلاك حتى تصبح الطبقة الإنسية الوردية الموحدة مرئية.
  8. اقلب الأنسجة (الشكل 1C). كرر نفس الإجراء ، كما هو الحال في الخطوة 1.7 ، عن طريق سحب الطبقة المغامرة (الشكل 1D). تأكد من إزالة جميع الأجزاء المرئية في أكبر عدد ممكن من المحاولات حسب الحاجة ، لأن هذه الطبقة لن تنفصل عن الوسائط بسهولة.
    ملاحظة: من الضروري إزالة الطبقات الداخلية والصناعية بشكل صحيح للحصول على أكبر عدد ممكن من سكان SMC نظيفين.
  9. بمجرد عزل الطبقة الإنسية ، قم بقطع الأنسجة إلى مكعبات تبلغ حوالي 1 مم × 1 مم × 1 مم. اضغط على الوسائط لأسفل باستخدام الملقط وقطع الأنسجة في اتجاه واحد باستخدام المشرط. لا تخفض ذهابا وإيابا. قم بإجراء تخفيضات نظيفة أحادية الاتجاه لتقليل الضرر. حاول عمل أكبر عدد ممكن من المكعبات ، بالنظر إلى حجم الخزعة (الشكل 1E).
  10. ضع قطع الأنسجة في الربع العلوي من قارورة T25 باستخدام الملقط. ضع 10-20 مكعبا لكل قارورة إذا كانت كمية المواد تسمح بذلك (الشكل 1F).
    ملاحظة: استخدم ملقطا ناعما لتقليل التصاق الأنسجة بأضلاع الملقط وفصل الأنسجة بسهولة في القارورة.
  11. احتضن مكعبات الأنسجة في قوارير T25 لمدة 10 أيام تقريبا عند 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
    ملاحظة: من المتوقع أن يكون نمو الخلايا الأولى في ذلك الوقت. قد تبدو الخلايا التي تهاجر في البداية أصغر من SMCs العادية.
  12. بمجرد ملاحظة نمو الخلايا ، أضف 2.5 مل من الوسط إلى القارورة ، مع التأكد من عدم ماصة على قطع الأنسجة لمنعها من الانفصال.
  13. بعد حوالي 5 أيام أخرى ، عندما يتم ملاحظة مجموعات من الخلايا حول قطع الأنسجة ، قم بتغيير وسط الثقافة. إذا انفصلت قطع الأنسجة، فقم بإزالتها لأنها لن تعيد تركيبها.
  14. بمجرد أن تلتقي الخلايا بنسبة 80-90٪ ، انقلها إلى قارورة T75 واستمر في الزراعة بهذا التنسيق.
    ملاحظة: يوصى باستخدام نسبة انقسام 1:2 أو 1:3. تجميد نسخة احتياطية من الخلايا في ممر مبكر. تحافظ الخلايا عموما على خصائصها حتى الممر 10 ؛ لا ينبغي استخدام المقاطع اللاحقة للتجارب.

2. عزل الخلايا الليفية الجلدية الأولية من خزعات الجلد

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية تحت غطاء التدفق الرقائقي المعقم لزراعة الأنسجة. ارتداء القفازات واستخدام تقنيات التعقيم القياسية عند التعامل مع عينات الدم والأنسجة البشرية البشرية. يتم استزراع الخلايا الليفية في الوسط القاعدي مع استكمال 10 ٪ من مصل البقر الجنيني ، و 100 U / مل البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، ويشار إليها باسم وسط الخلايا الليفية.

  1. قم بتعقيم زوجين من الملقط الجراحي والمشرط عن طريق غمسهما في 70٪ من الإيثانول ثم مسحهما جافا.
  2. ماصة 2 مل من وسط الخلايا الليفية في طبق بتري حيث سيتم إجراء تشريح الأنسجة.
  3. ماصة 2.5 مل من الخلايا الليفية المتوسطة في قارورتين T25. قم بتدوير القوارير بحيث يغطي الحجم الصغير من الوسط السطح بأكمله.
  4. انقل خزعة الجلد التي تم حصادها من غرفة العمليات إلى المختبر على الجليد في محلول نقل الأنسجة الباردة والمعقمة (انظر جدول المواد) أو 0.9٪ كلوريد الصوديوم في أنبوب بلاستيكي معقم.
  5. افتح الأنبوب مع الأنسجة داخل غطاء محرك الأنسجة. أخرج الخزعة من الأنبوب باستخدام الملقط المعقم وضعها في طبق بتري (الشكل 2A).
  6. افحص الخزعة بصريا لتحديد طبقات الجلد الثلاث ، البشرة ، الأدمة ، والدهون تحت الجلد. ابحثي عن سطح جلدي يمكن التعرف عليه، وأحيانا بشعر مرئي، لتحديد البشرة. على الجانب الآخر ، ابحث عن الدهون تحت الجلد ، والتي غالبا ما تكون صفراء وغروي. تحديد الطبقة بين البشرة والدهون تحت الجلد كأدمة - مصدر الخلايا الليفية القابلة للحياة (الشكل 2B).
  7. لعزل الخلايا الليفية عن الأدمة، قم بإزالة الطبقتين الأخريين ووضع الأنسجة على جانبها بحيث تكون الطبقات الثلاث مرئية.
    ملاحظة: على عكس أنسجة الأبهر ، لا يمكن فصل طبقات الجلد عن بعضها البعض. وبالتالي ، يجب قطعها. الأنسجة هي أيضا أكثر المطاط ، مما يجعل من الصعب قطعها. استخدم مشرطا حادا.
  8. امسك الأنسجة لأسفل باستخدام الملقط. قطع بالتوازي مع الحدود بين البشرة والأدمة. قطع البشرة بأكملها. حاول أن تقطع خطا نظيفا واحدا ولا تتحرك ذهابا وإيابا لتجنب تلف الأنسجة.
  9. اقلب الأنسجة. كرر نفس الإجراء كما في الخطوة 2.8 ؛ هذه المرة ، قطع داخل الأدمة موازية للحدود مع الدهون تحت الجلد.
  10. بمجرد عزل الأدمة ، قم بقطع الأنسجة إلى مكعبات حوالي 1 × 1 × 1 مم3. اضغط على الأنسجة لأسفل باستخدام الملقط وقطع الأنسجة في اتجاه واحد باستخدام المشرط. لا تخفض ذهابا وإيابا. قم بإجراء تخفيضات نظيفة أحادية الاتجاه لتقليل الضرر. حاول عمل أكبر عدد ممكن من المكعبات ، بالنظر إلى حجم الخزعة (الشكل 2C).
  11. ضع قطع الأنسجة في الربع العلوي من قارورة T25 باستخدام الملقط. ضع 10-20 مكعبا لكل قارورة إذا كانت كمية المواد تسمح بذلك (الشكل 2D).
    ملاحظة: استخدم ملقط أملس لتقليل التصاق الأنسجة بأضلاع الملقط وفصل الأنسجة بسهولة في القارورة.
  12. احتضن مكعبات الأنسجة في قوارير T25 لمدة 10 أيام تقريبا عند 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
    ملاحظة: من المتوقع أن يكون نمو الخلايا الأولى في ذلك الوقت. قد تبدو الخلايا التي تهاجر في البداية أصغر من الخلايا الليفية الطبيعية.
  13. بمجرد ملاحظة نمو الخلايا ، أضف 2.5 مل من الوسط إلى القارورة ، مع التأكد من عدم ماصة على قطع الأنسجة لمنعها من الانفصال.
  14. بعد حوالي 5 أيام أخرى ، عندما يمكن ملاحظة مجموعات من الخلايا حول قطع الأنسجة ، قم بتغيير وسط الثقافة. إذا انفصلت قطع الأنسجة، فقم بإزالتها لأنها لن تعيد تركيبها.
  15. بمجرد أن تلتقي الخلايا بنسبة 80-90٪ ، انقلها إلى قارورة T75 واستمر في الزراعة بهذا التنسيق.
    ملاحظة: يوصى باستخدام نسبة انقسام 1:2 أو 1:3. تجميد نسخة احتياطية من الخلايا في ممر مبكر. تحافظ الخلايا عموما على خصائصها حتى الممر 10 ؛ لا ينبغي استخدام المقاطع اللاحقة للتجارب.

3. قياس الانكماش (على سبيل المثال SMCs)

  1. قم بإعداد صفيف ECIS 96w10e (انظر الشكل 3A للحصول على صورة تمثيلية للصفيف مع أقطاب كهربائية مكبرة وخلايا مزروعة على الأقطاب الكهربائية).
    ملاحظة: نفذ الخطوات التالية تحت غطاء التدفق الرقائقي المعقم لزراعة الأنسجة.
    1. قم بتغطية صفيف 96w10e معقم ب 200 ميكرولتر من 10 mM L-cysteine لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغسل الطبق مرتين بالماء المعقم. دع اللوحة تجف بين عشية وضحاها في غطاء زراعة الأنسجة مع فتح الغطاء قليلا.
      ملاحظة: طلاء اللوحة ب L-cysteine ضروري فقط عند استخدام اللوحة لأول مرة.
    3. في اليوم التالي ، صفيحة تعقيم الأشعة فوق البنفسجية والغطاء لمدة 30 دقيقة. أدر الغطاء لأعلى بحيث يتم تعقيم الداخل. بمجرد تعقيم اللوحة ، لا تفتح اللوحة خارج غطاء التدفق.
  2. خلايا البذر على صفيف ECIS
    1. قم بتسخين محلول الجيلاتين المعقم بنسبة 1٪ في الحمام المائي لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يتم تخزين المحلول في الثلاجة وقد يتصلب، مما يجعل من الصعب ماصة.
    2. بعد ذلك ، قم بتغطية الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول الجيلاتين بنسبة 1٪ لكل بئر واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
    3. شفط الجيلاتين من الآبار.
    4. عد الخلايا باستخدام عداد خلية آلي وزرع SMCs في ثلاثة أضعاف بكثافة بذر تبلغ 30000 خلية / بئر في 200 ميكرولتر من وسط SMC.
    5. ضع اللوحة مع SMCs في حامل البئر ECIS 96 في حاضنة زراعة الخلايا. انقر نقرا مزدوجا فوق برنامج الفيزياء الحيوية التطبيقية ECIS لفتح البرنامج واضغط على زر الإعداد .
    6. تحقق مما إذا كانت جميع الأقطاب الكهربائية على اتصال بالحامل (أخضر ؛ أحمر إذا لم يكن هناك اتصال) في اللوحة السفلية اليسرى المسماة تكوين جيد. إذا لم تكن الأقطاب الكهربائية متصلة بشكل صحيح ، فاضبط اللوحة في الحامل قبل بدء القياس.
    7. حدد نوع اللوحة (صفيف 96 بئر) في نفس اللوحة بالنقر فوق نوع الصفيف.
    8. في اللوحة العلوية اليمنى إعداد جمع البيانات، انقر على تردد واحد وقم بتغيير قيمة المعاوقة إلى 4000 هرتز والفاصل الزمني إلى 8 ثوان.
    9. انقر فوق الزر ابدأ لبدء القياسات. انتظر حتى يتم فتح لوحة جديدة، حيث يمكن حفظ ملف ECIS.
    10. اسمح للخلايا بإرفاق وإنشاء طبقة أحادية لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: يولد ارتباط الخلايا وانتشارها على الأقطاب الكهربائية قيمة مقاومة أساسية (الشكل 3B).
  3. تحفيز الخلايا للحث على الانقباض
    1. تحفيز تقلص SMC عن طريق تحفيز الخلايا مع 10 ميكروغرام / مل من أيونوفور الكالسيوم ، الأيونومايسين.
      ملاحظة: سوف يحفز Ionomycin تدفق Ca2 + خارج الخلية ، وتنشيط الشلال المقلص ؛ انظر الشكل 4A للحصول على صور تمثيلية للخلايا المتعاقدة غير المحفزة والمحفزة.
    2. قم بتخفيف 1 ملغ من مسحوق الأيونومايسين في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد لصنع محلول مخزون من 10 ملغ / مل ، وتخزين 10 ميكرولتر أليكوتس عند -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، قم بتخفيف محلول ionomycin 1:10 في وسط SMC لإعداد محلول العمل لإضافته إلى الخلايا.
    3. قم بإجراء تحفيز الخلية بينما لا يزال الصفيف في حامل الصفيف داخل حاضنة زراعة الخلايا ويتم توصيل الأقطاب الكهربائية بالنظام.
      1. لتحفيز الخلايا ، قم بإزالة الغطاء ووضعه على سطح معقم داخل الحاضنة. تحضير اثنين من الماصات ، تعيين في 2 ميكرولتر و 150 ميكرولتر.
      2. قبل البدء في التحفيز ، اضغط على Mark في البرنامج ووضع تعليق.
        ملاحظة: سيسهل ذلك العثور على التوقيت الدقيق للتحفيز عند تحليل البيانات.
      3. ماصة 2 ميكرولتر من حل عمل الأيونوميسين في كل بئر في أسرع وقت ممكن. بمجرد تحفيز جميع الخلايا ، اخلط الوسط في الآبار باستخدام الماصة الثانية.
        ملاحظة: نظرا للتأثيرات السريعة ، ليس من الضروري تغيير النصائح بين خطوط الخلايا والظروف المختلفة. اعمل بسرعة أثناء التحفيز والخلط لأن الأيونوميسين له تأثير حاد. عند تحفيز لوحة كاملة ، قم بتحفيز 3 أعمدة كحد أقصى في وقت واحد. بعد كل تحفيز ، انتظر 30 دقيقة على الأقل حتى التحفيز التالي للسماح للخلايا بالتعافي من درجة الحرارة وتغير CO2 الناجم عن فتح باب الحاضنة.
      4. مباشرة بعد الانتهاء من التحفيز ، اضغط على Mark مرة أخرى لإضافة تعليق يفيد بأن التحفيز قد تم.
    4. الانتهاء من تجربة التحفيز
      1. سجل قيم المعاوقة لمدة 5 دقائق تقريبا بعد تحفيز الأيونومايسين. قم بإنهاء التسجيل بالضغط على إنهاء.
      2. أعد استخدام صفائف ECIS حتى ثلاث مرات: اغسل الآبار مرتين بالماء المعقم ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات باستخدام التربسين أو كاشف مماثل. كرر الخطوتين 3.1.2 و3.1.3.
  4. تصدير البيانات
    1. لتصدير البيانات، انقر فوق ملف | تصدير البيانات | إلى Excel (محدد). حدد مجلدا لحفظ الملف.
    2. انقر فوق فصل عندما يطلب البرنامج دمج الأوراق أو فصلها.
  5. تحليل الناتج المتقلص
    1. لحساب الاستجابة الانقباضية ، استخدم المعادلة التالية (1) ، حيث يشير C إلى الانكماش (معبرا عنه بنسبة التغير مقارنة بخط الأساس) ، يشير التحفيز المسبق (PrS) إلى قيمة المقاومة (المعبر عنها في Ω) قبل تحفيز الأيونوميسين مباشرة ويشير التحفيز اللاحق (PoS) إلى المقاومة (المعبر عنها في Ω) بعد 2 دقيقة من الانتهاء من التحفيز.
      figure-protocol-13260 (1)
      ملاحظة: كما هو موضح في المعادلة (1)، يتم طرح قيمة المعاوقة لبئر مملوء بوسط مستنبت بدون أي خلايا متصلة (قيمة 290 Ω) من جميع النتائج في الحساب النهائي. يوصى بقياس الاستجابات الانقباضية في ثلاثة أضعاف في كل تجربة وإجراء ثلاث تجارب مستقلة بنفس خط الخلية لحساب أي تباين بين التجارب وداخلها.
    2. بمجرد إجراء التجارب المستقلة الثلاث ، قم بتجميع البيانات معا عن طريق حساب متوسط القياسات الثلاثة ، بما في ذلك الانحراف المعياري (SD).
  6. مقارنة المجموعات المختلفة
    1. لتحديد نطاق الانقباض الطبيعي والتحقيق في أسئلة البحث المحددة اللاحقة ، استخدم المجموعة الضابطة لتعريف "الانقباض الطبيعي" ومقارنته بالاستجابة الانقباضية للمرضى أو مجموعات العلاج.
    2. احسب المتوسط الحسابي وSD لمجموعة التحكم بأكملها، أي القيم النهائية لجميع خطوط الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 3.5.2.
    3. استخدم نطاق المتوسط ± 2SD لتحديد الخلايا في المجموعة الأخرى التي تقع خارج هذا النطاق ، مما يشير إلى أن لديها استجابة انقباضية متغيرة.
      ملاحظة: تخضع الآلية الكامنة وراء الاستجابة الانقباضية المتغيرة لأسئلة بحثية محددة وتعتمد على الخلية والحالة ولن تتم مناقشتها في هذا البروتوكول.

4. الكشف عن وجود علامات محددة SMC

  1. عزل الحمض النووي الريبي
    1. زرع نفس خطوط الخلايا الخاصة بالمريض المستخدمة في قياسات الانكماش في لوحات 6 آبار ، بئر واحدة لكل خط خلية. عد الخلايا باستخدام عداد خلية آلي وزرع الخلايا بكثافة بذر تبلغ 200000 خلية / بئر في وسط SMC واسمح لها بالالتصاق بين عشية وضحاها.
    2. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS المعقم.
    3. قم بتحليل الخلايا وعزل الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تخليق cDNA
    1. إجراء تخليق cDNA في 20 ميكرولتر من خليط تفاعل النسخ العكسي. تمييع تركيزات الحمض النووي الريبي المعزول الكلي وفقا للتعليمات المقدمة من الشركة المصنعة.
  3. كيو بي سي آر
    1. قم بقياس التعبير الجيني لجينات علامة SMC ، على سبيل المثال ، ACTA2 و CNN1 و SMTN و TAGLN للتأكد من أن الخلايا المعزولة هي بالفعل SMCs واكتشاف علامات SMC. تحقق من وجود علاقة بين النتائج والمخرجات المقلصة.
    2. استخدم اثنين على الأقل من جينات التدبير المنزلي لتطبيع البيانات ، على سبيل المثال ، YWHAZ و TBP.
      ملاحظة: يمكن إجراء تشغيل وتحليل qPCR باستخدام أجهزة PCR مختلفة وبرامج متوافقة ، اعتمادا على ما هو متاح ومحسن في المختبر. انظر الجدول التكميلي S1 للاطلاع على تسلسلات التمهيدي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لاختبار قابلية تكرار هذه الطريقة ، تم التحقق من صحة الطريقة أولا باستخدام SMCs التحكم فقط. لتحديد قابلية تكرار القياس بين التجارب، تم رسم قياسين مستقلين لجميع خطوط خلايا التحكم والمريض المضمنة كمخطط Bland-Altman (الشكل 3B). أظهرت المؤامرة أن هذه الطريقة لا تظهر التباين خارج فترة ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تقدم هذه الورقة طريقة لقياس انكماش SMC في المختبر ، بناء على التغيرات في المعاوقة واحتلال السطح. أولا ، يتم وصف عزل وزراعة وتوسيع SMCs البشرية الأولية الخاصة بالمريض والخلايا الليفية الجلدية ، تليها كيفية استخدامها لقياسات الانقباض.

يرتبط أحد قيود الدراسة بالحصول على ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

نود أن نعرب عن امتناننا لتارا فان ميرينبوير ، وألبرت فان ويك ، ويولاندا فان دير فيلدن ، وجان د. بلانكنشتيجن ، ولان تران ، وبيتر ل. هورديك ، وفريق PAREL-AAA ، وجميع جراحي الأوعية الدموية في أمستردام UMC ، و Zaans Medisch Centrum ، ومستشفى Dijklander لتوفير المواد والدعم لهذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well ArrayApplied Biophysics96W10idf PETArray used to measure contraction in the ECIS setup
CustodiolDr. Franz Höhler Chemie GmbHRVG 12801Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich472301Solution used to dilute ionomycin
Fetal Bovine SerumGibco26140079Addition to cell culture medium
Ham's F-10 Nutrient MixGibco11550043Medium used to culture skin fibroblasts
Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'')GibcoM231500Medium used to culture smooth muscle cells
Invitrogen countess IIThermo Fisher ScientificAMQAX1000Automated cell counter
Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatusSigma-AldrichI0634-1MGCompound used for contraction stimulation
NaCl 0.9%Fresenius KabiB230561Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Antibiotics used for cell culture medium
Phospathe buffered salineGibco10010023Used to wash cells
Quick-RNA Miniprep KitZymo ResearchR1055Kit used for RNA isolation
Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)GibcoS00725Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermo Fisher Scientific11754250Kit used for cDNA synthesis
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155Reagent for qPCR
Trypsin-EDTAGibco15400-054Used to trypsinize cells
ZThetaApplied BiophysicsZThetaECIS instrument used for contraction measurements

References

  1. Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
  2. Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
  3. Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
  4. Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
  5. Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
  6. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
  7. Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
  8. Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
  9. Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
  10. Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
  11. Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
  12. Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
  13. Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
  14. Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
  15. Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
  16. Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved