توليد طعم Xenograft التقويمي لخلايا سرطان البنكرياس عن طريق الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية

Summary

نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج سرطان البنكرياس التقويمي طفيف التوغل عن طريق الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية لخلايا سرطان البنكرياس البشرية والمراقبة اللاحقة لنمو الورم في الجسم الحي عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية.

Abstract

يمثل سرطان البنكرياس (PCa) أحد أكثر أنواع السرطان فتكا في جميع أنحاء العالم. تعتمد أسباب الورم الخبيث PCa بشكل أساسي على سلوكه الخبيث الجوهري ومقاومته العالية للعلاجات العلاجية. في الواقع ، على الرغم من العديد من الجهود ، فشل كل من العلاج الكيميائي القياسي والعلاجات المستهدفة المبتكرة بشكل كبير عند الانتقال من التقييم قبل السريري إلى الإعداد السريري. في هذا السيناريو ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير نماذج الفئران قبل السريرية التي تحاكي بشكل أفضل خصائص PCa في الجسم الحي لاختبار الأدوية المطورة حديثا. يصف البروتوكول الحالي طريقة لتوليد نموذج فأر من PCa ، يمثله طعم أجنبي تقويمي يتم الحصول عليه عن طريق الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية لخلايا ورم البنكرياس البشري. باستخدام مثل هذا البروتوكول الموثوق به والأقل بضعا ، نقدم أيضا دليلا على التطعيمات في الجسم الحي وتطور كتل الورم ، والتي يمكن مراقبتها عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة). أحد الجوانب الجديرة بالملاحظة في نموذج PCa الموصوف هنا هو التطور البطيء لكتل الورم بمرور الوقت ، مما يسمح بتحديد دقيق لنقطة البداية للعلاجات الدوائية ومراقبة أفضل لآثار التدخلات العلاجية. علاوة على ذلك ، فإن التقنية الموضحة هنا هي مثال على تنفيذ مبادئ 3Rs لأنها تقلل من الألم والمعاناة وتحسن بشكل مباشر رفاهية الحيوانات في البحث.

Introduction

يعد PCa ، وشكله الأكثر شيوعا ، سرطان البنكرياس القنوي (PDAC) ، أحد أكثر أسباب الوفاة المرتبطة بالسرطان شيوعا مع معدل بقاء لمدة عام واحد أقل من 20٪ ومعدل بقاء لمدة 5 سنوات يبلغ 8٪ ، بغض النظر عن المرحلة ^1,2. يكون المرض مميتا دائما تقريبا ، ومن المتوقع أن ينمو حدوثه باستمرار في السنوات القادمة ، على عكس أنواع السرطان الأخرى ، التي ينخفض معدل حدوثها³. عوامل مثل الكشف المتأخر عن السرطان ، وميل التقدم السريع ، وعدم وجود علاجات محددة تؤدي إلى سوء تشخيص PCa⁴. تم الحصول على تقدم كبير في أبحاث السرطان ، وذلك بفضل تطوير نماذج أكثر دقة للفئران قبل السريرية. قدمت النماذج رؤى مناسبة لفهم الآلية الجزيئية الكامنة وراء السرطان وتطوير علاجات جديدة⁵. تنطبق هذه التطورات بشكل سيئ على PCa ، والتي ، على الرغم من الجهود الكبيرة الأخيرة ، لا تزال مقاومة للعلاجات الكيميائية الحالية¹. لهذه الأسباب ، فإن تطوير مناهج جديدة لتحسين آفاق المرضى أمر إلزامي.

على مر السنين ، تم تطوير العديد من نماذج الماوس PCa ، بما في ذلك xenografts ، والتي هي النماذج الأكثر استخداما في الوقت الحاضر⁵. تصنف نماذج Xenograft على أنها غير متجانسة تحت الجلد وتقويم العظام ، اعتمادا على موقع الخلايا السرطانية المزروعة. الطعوم الخارجية غير المتجانسة تحت الجلد أسهل وأرخص في تحقيقها ولكنها تفتقد بعض السمات المميزة ل PCa (أي البيئة المكروية للورم الغريبة ، والتي تتميز بتراكم الأنسجة الليفية ، ونقص الأكسجة ، والحموضة ، وتكوين الأوعية)^6,7. وهذا ما يفسر سبب فشل الطعوم الخارجية تحت الجلد في كثير من الأحيان في توفير بيانات قوية للعلاجات العلاجية مما يؤدي إلى الفشل عند ترجمتها إلى الإعداد السريري⁸. من ناحية أخرى ، تشبه الطعوم الخارجية التقويمية البيئة المكروية للورم عن كثب ، مما يؤدي إلى محاكاة أفضل للتطور الطبيعي للمرض. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر الطعوم الخارجية التقويمية أكثر ملاءمة لدراسة العملية النقيلية والسمات الغازية ل PCa ، والتي لا تحدث تقريبا في النماذج تحت الجلد⁹. بشكل عام ، تفضل نماذج فأر xenograft التقويمية في الوقت الحاضر لإجراء اختبار المخدرات قبل السريري ^9,10. عادة ما تعتمد الطعوم الخارجية التقويمية على الإجراءات الجراحية لزرع خلايا أو قطع صغيرة جدا من أنسجة الورم في البنكرياس. في الواقع ، تم نشر العديد من الأوراق البحثية القائمة على النماذج الجراحية ل PCa في العقود القليلة الماضية¹¹. ومع ذلك ، فإن جودة ونتائج الإجراء الجراحي لإنشاء نموذج ورم تقويمي تعتمد بشدة على المهارة الفنية للمشغل. نقطة رئيسية أخرى لنجاح تقويم العظام PCa xenograft لنهج سريري متعدية هي إمكانية إنشاء مرض موضعي مع حركية نمو يمكن التنبؤ بها.

لمعالجة هذه المشكلات ، نصف هنا إجراء مبتكرا لإنتاج طعم أجنبي PCa تقويمي ، مستغلا الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) لخلايا PCa البشرية في ذيل البنكرياس في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. يقوم هذا الإجراء بإنشاء نموذج ماوس PCa موثوق. يتبع نمو الورم في الجسم الحي التصوير الأمريكي.

Protocol

حصل البروتوكول الحالي على موافقة من وزارة الصحة الإيطالية برقم ترخيص 843/2020-PR. من أجل ضمان ظروف معقمة ، تم الاحتفاظ بالحيوانات داخل غرفة الحاجز في حظيرة البحث (Ce.S.A.L.) بجامعة فلورنسا. تم تنفيذ جميع الإجراءات في نفس المكان الذي تم فيه إيواء الفئران في منشأة LIGeMA بجامعة فلورنسا (إيطاليا).

1. إعداد الخلية

1. خلايا PCa المزروعة من خط خلايا PCa في طبق بتري 100 مم يحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 2٪ L-glutamine و 10٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS).
2. احتضان الخلايا في normoxia عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
3. افصل الخلايا بالتربسين. عد ، وأعد تعليق 1 × 10⁶ خلايا في 20 ميكرولتر من PBS ، 1 ساعة قبل التلقيح.

2. إعداد الماوس للحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية (US-GI)

ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات التالية تحت ظروف معقمة. يستغرق الإجراء الكامل للحقن الموجه من الولايات المتحدة ، من بداية التخدير حتى إزالة الماوس من منصة الحيوان ، حوالي 10-12 دقيقة بالإضافة إلى 5 دقائق لاستعادة الفئران بالكامل.

1. قبل التدخل مباشرة، يتم تطبيق كاربروفين (NSAID) تحت الجلد (s.c.) بجرعة نهائية مقدارها 5 ملغ/ كغ أو ترامادول بجرعة نهائية مقدارها 5 ملغ/ كغ باستخدام حقنة السل بإبرة عيار 27 غ.
   ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول الحالي ، تم استخدام 20 أنثى من أنثى Athymic Nude-Foxn^1nu . كان عمر الفئران 8 أسابيع ووزنها 20-22 جم.
2. قم بتشغيل جهاز التصوير وحدد الماوس (صغير) البطن في قائمة التطبيق من لوحة محول الطاقة. تأكد من ظهور نافذة التصوير B-Mode (وضع السطوع) ، وأن النظام جاهز للحصول على بيانات B-Mode.
   ملاحظة: B-Mode هو وضع التصوير الافتراضي للنظام. يعرض النظام الأصداء في عرض ثنائي الأبعاد (2D) من خلال تعيين مستوى سطوع بناء على سعة إشارة الصدى. B-Mode هو الوضع الأكثر فعالية لتحديد الهياكل التشريحية.
   1. انتقل إلى متصفح الدراسة.
   2. حدد دراسة جديدة واكتب اسم الدراسة ومعلوماتها ، أي تاريخ الدراسة ، إلخ.
   3. املأ جميع المعلومات الضرورية في اسم السلسلة ، أي سلالة الحيوان ، والمعرف ، وتاريخ الميلاد ، وما إلى ذلك.
   4. اضغط على تم; البرنامج جاهز للتصوير في الوضع B.
3. تخدير الفأر في غرفة التخدير الحثي باستخدام 4٪ إيزوفلوران مع تدفق غاز 2 لتر / دقيقة من O₂.
   ملاحظة: حوالي 4 دقائق كافية للتخدير المناسب (التنفس حوالي 50-60 نفسا في الدقيقة).
4. بمجرد تخدير الماوس ، قم بتغيير اتصال آلة التخدير لتوجيه الأيزوفلوران نحو طاولة مناولة الماوس.
5. ضع الفأر المخدر على جانبه الأيمن على طاولة المناولة (يتم تسخينه عند 37 درجة مئوية) مع خطمه في مخروط الأنف لضمان تخدير الماوس باستخدام 2٪ إيزوفلوران مع تدفق غاز 0.8 لتر / دقيقة من O₂ (الشكل 1 أ).
6. ضع قطرة من الدموع الاصطناعية على عيون الفأر لمنع الجفاف أثناء التخدير.
7. قم بلصق اليد اليمنى والقدم اليمنى والذيل بإحكام على وسادات القطب على منصة الحيوان بشاش لاصق.
   ملاحظة: يتم تسجيل معدل تنفس الماوس ومخطط كهربية القلب (ECG) من خلال وسادات القطب الكهربائي.

3. حقن خلايا PANC1 في البنكرياس بطريقة US-GI

1. تعقيم جلد الفأر مع 70 ٪ من الإيثانول والحفاظ على جلد الجناح الأيسر ممتدة باستخدام الشاش اللاصق.
   ملاحظة: الحفاظ على تمدد الجلد مهم لتقليل مقاومة إدخال الإبرة ومنع تشوهات الإبرة.
2. ضع جل الموجات فوق الصوتية على البطن والجناح الأيسر للفأر باستخدام حقنة سعة 20 مل (بدون الإبرة).
3. باستخدام مقبض التحكم في الارتفاع لمحول الطاقة الأمريكي ، قم بخفض محول الطاقة للمس الجانب الأيسر من الماوس ووضعه بشكل عرضي على جسم الحيوان.
4. حرك الترجام لتصور البنكرياس على شاشة الترجام باستخدام تصوير B-Mode (الشكل 1B).
5. قم بإعداد حقنة هاملتون سعة 50 ميكرولتر ، تحتوي على 1 × 10⁶ خلايا PANC1 معلقة في 20 ميكرولتر من PBS ، بإبرة 30 مم 28 جم ووضع المحقنة على الحامل المناسب (الشكل 1C).
   ملاحظة: قبل الاستخدام ، قم بتعقيم إبرة المحقنة بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 5-10 دقائق.
6. باستخدام الحامل micromanipulator ، قم بخفض المحقنة إلى جلد الماوس ، مع وجه شطبة الإبرة لأعلى وفي نفس مستوى محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية ، لتشكيل زاوية 45 درجة مع محول الطاقة (الشكل 1D).
   ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، تابع من خلال مراقبة صورة الولايات المتحدة على الشاشة.
7. باستخدام micromanipulator ، قم بثقب الجلد وأدخل إبرة المحقنة في البنكرياس ولاحظ الصورة الأمريكية على الشاشة ، لمتابعة مسارها (الشكل 1E).
   ملاحظة: قبل الحقن ، خذ ذيل البنكرياس كمرجع يقع خلف الطحال وقريب من الكلية اليسرى.
8. بمجرد إدخال الإبرة في البنكرياس ، قم بحقن بلعة 20 ميكرولتر تحتوي على الخلايا مباشرة في البنكرياس عن طريق الضغط المستمر على مكبس المحقنة (الشكل 1F).
   ملاحظة: يتم فحص إجراء الحقن الصحيح من خلال وجود فقاعة صغيرة في البنكرياس وتدفق السائل الناقص المنشأ ، والذي بالكاد يمكن رؤيته من طرف الإبرة.
9. اترك الإبرة في مكانها لمدة 5-10 ثوان بعد حقن البلعة بأكملها ، ثم اسحبها ببطء.
10. قم بإزالة محول الطاقة الأمريكي ، ونظف الجل من الجناح ، وضع الماوس بمفرده في قفص جديد. راقب الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.

4.3D التصوير الأمريكي لمراقبة أورام البنكرياس في الفئران

ملاحظة: تم إجراء تقييم تطور الورم بدءا من 8 أيام بعد حقن الخلايا ، باستخدام نفس الأداة المستخدمة في الحقن الموجه من الولايات المتحدة (المدرجة في جدول المواد). ومن ثم ، فإن بعض الإجراءات ، مثل اشتعال النظام (الخطوة 2.2) ، والتخدير (الخطوات 2.3. - 2.6) ، ووضع الماوس على منصة الحيوان (الخطوة 2.7.) ، تتطابق تماما مع ما تم وصفه أعلاه في البروتوكول.

1. قبل بدء التصوير في الولايات المتحدة ، قم بإعداد محطة العمل كما هو موضح في الشكل 2 أ.
2. إصلاح محول الطاقة على نظام المحرك 3D (الشكل 2A).
3. قم بتشغيل المصور وحدد دراسة جديدة على متصفح الدراسة.
4. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير (4٪ إيزوفلوران).
5. ضع الفأر المخدر على جانبه الأيمن على طاولة المناولة ساخنة عند 37 درجة مئوية مع خطمها في أنبوب التخدير وتقليل الأيزوفلوران إلى 2٪ (الشكل 2 ب).
   ملاحظة: من المهم أن يتم وضع الماوس في نفس وضع الحقن الموجه من الولايات المتحدة ، للحفاظ على نفس المراجع التشريحية.
6. ضع قطرة من مرهم الطبيب البيطري على عيون الماوس.
7. ضع طبقة من هلام الموجات فوق الصوتية على بطن الفأر والخاصرة اليسرى.
8. ضع محول الطاقة 55 ميجاهرتز في الاتجاه العرضي للمس جلد الجناح الأيسر بحيث يكون البنكرياس متمركزا تقريبا (الشكل 2C).
9. استخدم محرك 3D للحصول على صور للبنكرياس بأكمله في الاتجاه العرضي ، وجمع 90-100 إطار لكل عملية اكتساب (قد يختلف عدد الإطارات حسب الاختيار الشخصي).
   1. حدد موضع محرك 3D على لوحة اللمس الخاصة بالتصوير.
   2. أشر إلى مسافة المسح عن طريق تحريك المؤشر للحصول على صور للبنكرياس بأكمله من كلا الطرفين.
   3. حدد إطارات المسح الضوئي وابدأ اكتساب 3D.
10. بمجرد الانتهاء من التصوير 3D ، قم بإزالة محول الطاقة ، وتنظيف الجل من الجلد ، ووضع الماوس وحده في قفص جديد للتعافي. راقب الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.

النتائج

باتباع البروتوكول الموصوف أعلاه ، تم تخدير الفئران أولا في غرفة إيزوفلوران ، ووضعها على منصة الحيوان (الشكل 1 أ). تم تصوير البنكرياس بالتصوير بالموجات فوق الصوتية (الشكل 1 ب). تم تحميل حقنة هاملتون سعة 50 ميكرولتر بخلايا 1 × 10⁶ PANC1 معلقة في 20 ميكرولتر من PBS ?...

Discussion

على الرغم من أن استخدام التصوير الأمريكي منتشر على نطاق واسع في العيادة ، إلا أن تطور الورم في العديد من نماذج الفئران قبل السريرية يوصف عادة باستخدام التصوير الحيوي¹¹. هذا الأخير هو وسيلة غير مباشرة لتقييم التهاب الورم وتوسعه ، كما أنه لا يوفر حركية نمو الورم الموثوقة. في هذه ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157