استهداف الصفائح العصبية الفئرانية بواسطة حقن النانو في الرحم (NEPTUNE) في اليوم الجنيني 7.5

Summary

في هذا البروتوكول ، نصف كيفية حقن التجويف الأمنيوسي للفأر عند E7.5 مع lentivirus ، مما يؤدي إلى نقل موحد للصفيحة العصبية بأكملها ، مع الحد الأدنى من الآثار الضارة على البقاء على قيد الحياة أو التطور الجنيني.

Abstract

إن التلاعب بالتعبير الجيني في دماغ الفأر النامي في الرحم يحمل إمكانات كبيرة لدراسات علم الوراثة الوظيفية. ومع ذلك ، فقد اقتصر في السابق إلى حد كبير على التلاعب بالمراحل الجنينية بعد العصبية. تم تطوير بروتوكول لحقن التجويف الأمنيوسي في اليوم الجنيني (E)7.5 وتوصيل الفيروس lentivirus ، وترميز cDNA أو shRNA ، مستهدفا >95٪ من الصفيحة العصبية وخلايا القمة العصبية ، مما يساهم في الدماغ المستقبلي والحبل الشوكي والجهاز العصبي المحيطي. يصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لتحقيق نقل ناجح ، بما في ذلك طحن الإبر الشعرية الزجاجية ، والتحقق من الحمل ، والتدريج التنموي باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية ، وأحجام الحقن المثلى المطابقة للمراحل الجنينية.

باتباع هذا البروتوكول ، من الممكن تحقيق نقل >95٪ من الدماغ النامي مع فيروس lentivirus عالي العيار وبالتالي إجراء معالجة جينية للدماغ بأكمله. في المقابل ، من الممكن تحقيق نقل الفسيفساء باستخدام عيارات فيروسية أقل ، مما يسمح بالفحص الجيني أو تتبع الأنساب. يستهدف الحقن في E7.5 أيضا الأديم الخارجي والقمة العصبية التي تساهم في مقصورات مميزة من العين واللسان والجهاز العصبي المحيطي. وبالتالي توفر هذه التقنية إمكانية التعامل مع التعبير الجيني في الأنسجة المشتقة من الصفائح العصبية والأديم الظاهر للفئران من مراحل ما قبل ريادة الأعمال ، مع الاستفادة من تقليل عدد الفئران المستخدمة في التجارب.

Introduction

الدماغ والحبل الشوكي هي من بين الأعضاء الأولى التي تبدأ التكوين أثناء التكوين الجنيني ^1,2. على الرغم من أنه يتم تحديد الجينات المرتبطة باضطرابات النمو العصبي ، إلا أن الاستجواب الوظيفي للمتغيرات الجينية قد تخلف عن ^3,4. نظرا لأن توليد الفئران القاضية المشروطة يمكن أن يستغرق شهورا أو سنوات ، فإن تقنية بديلة للتحقيق بسرعة في وظيفة الجينات في الدماغ النامي أمر مثير للاهتمام. في أجنة الفئران ، يحدث العصب - العملية المورفوجينية التي تتحول من خلالها الصفيحة العصبية إلى الأنبوب العصبي لتؤدي إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) - بين الأيام 8 و 10 بعد الحمل⁵. قبل ظهور العصب ، تتكون الصفيحة العصبية ، كجزء من الأديم الخارجي ، من طبقة واحدة من الخلايا العمودية التي ستتكاثر وتتمايز إلى العديد من أنواع الخلايا العصبية والدبقية داخل الجهاز العصبي المركزي ^6,7. لذلك ، للحث تجريبيا على تعديلات طويلة الأمد في التعبير الجيني في الجهاز العصبي المركزي ، فإن استهداف الصفيحة العصبية يوفر مزايا واضحة ، بما في ذلك إمكانية الوصول إلى جميع الخلايا السلفية.

في علم الأعصاب ، في البويضة الكهربائية ^8,9 والنقل الفيروسي لأجنة الفئران تم استخدامها للتلاعب بالتعبير الجيني الجنيني CNS. كان جنين الفرخ النامي نموذجا مفضلا لدراسة وظيفة الجينات أثناء تطور الحبل الشوكي بسبب إمكانية الوصول إلى جنين الفرخ في البويضة وما ينتج عن ذلك من سهولة التلاعب بالتعبير الجيني. على وجه الخصوص ، في بلازميد البلازميد الكهربائي يولد الظروف التجريبية والتحكم في كل الحبل الشوكي الفرخ. يؤدي الكهربية إلى تخلل غشاء الخلية ويوجه الحمض النووي سالب الشحنة بعيدا عن الكاثود (السلبي) نحو الأنود (الإيجابي) عن طريق تطبيق نبضة كهربائية عبر قطبين كهربائيين على الجنين. في الفئران ، في الرحم ، اقتصر الكهربائي بشكل عام على المراحل الجنينية التي اكتمل فيها العصب ، ويتكون الدماغ أو الحبل الشوكي بالفعل من عدة طبقات خلوية ، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة الكهربية¹⁰. ينتج عن الكهربية البلازميدية تعبير جيني عابر ويستهدف عموما عددا قليلا من الخلايا.

تم استخدام الموجات فوق الصوتية الموجهة في الحقن المجهري للرحم للتلاعب بالهياكل الجنينية المختلفة مثل الجلد والدماغ¹¹،¹²،^13،14. ومع ذلك ، فقد أظهرت الحقن التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي الفئراني النامي فعالية منخفضة أو أثرت سلبا على البقاء الجنيني¹²،^13،14. لذلك ، تم تطوير بروتوكول محسن لتوصيل فيروس lentivirus عالي العيار إلى التجويف الأمنيوسي (AC) في E7.5 ، والذي أطلق عليه اسم NEPTUNE ل neural plate targeting with in uteronano-injection¹⁵. أدت الحقن إلى فعالية استهداف طويلة الأمد تبلغ >95٪ من الدماغ بأكمله عند E13.5. علاوة على ذلك ، تم إدخال خطوة تدريجية أثناء التحقق بالموجات فوق الصوتية من الحمل لفرز الإناث والحمل حسب مرحلة النمو لتقليل الإجراءات غير الضرورية على البحث وزيادة نجاح الحقن. ترتبط كفاءة الحقن والبقاء على قيد الحياة ارتباطا وثيقا بزيادة حجم التيار المتردد. لذلك ، تصف هذه الورقة كيفية قياس حجم التيار المتردد قبل الحقن لتوصيل حجم مناسب إلى التيار المتردد الذي لن يسبب ارتشاف الجنين. NEPTUNE هو بديل قوي للنهج الحالية في الرحم ويمكن تكييفه لعدة استخدامات ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، دراسات الكسب والخسارة في الوظائف ، أو تتبع النسب ، أو فحص^15,16. 

Protocol

تم إيواء الفئران من النوع البري CD1 وفقا للوائح الأوروبية ، مع دورة قياسية ليلا ونهارا مع الطعام والماء ad. تزاوجت إناث CD1 مع ذكور CD1 بين عشية وضحاها، وتم فحص السدادات المهبلية في الصباح (E0.3). تم استخدام الإناث الحوامل فقط للحقن. تم منح الموافقة الأخلاقية لجميع التجارب الموصوفة هنا من قبل مجلس الزراعة السويدي (Jordbruksverket).

1. إعداد الإبر الزجاجية: إبرة سحب وطحن

ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن شراء الإبر قبل الأرض ، إلا أن سحب الإبر داخل المنزل يسمح بإجراء تعديلات سهلة على طول الإبرة والتجويف وزاوية الشطب.

1. قم بتركيب شعيرات شعرية زجاجية في ماصة الدقيقة/مجتذب الشعيرات الدموية. استخدم الإعدادات التالية باستخدام المعدات المحددة (انظر جدول المواد): تسخين 580 وحدة; السرعة 140 وحدة ؛ الوقت 200 وحدة ؛ الضغط 500-800 وحدة.
   ملاحظة: يتم تعريف وحدات المعلمات المختلفة بواسطة مجتذب الشعيرات الدموية. يمكن أن تختلف الوحدات باختلاف المعدات.
2. اضغط على Pull لسحب الشعيرات الدموية التي تنتج شعيرتين شعريتين زجاجيتين بأطراف مدببة.
   ملاحظة: بعد السحب، يتم دمج أطراف الشعيرات الدموية الزجاجية بسبب ارتفاع درجة حرارة مجتذب الماصة الدقيقة.
3. اقطع الطرف بمقص جراحي للحصول على طول إبرة يبلغ ~ 7 مم (يتم قياسها من حيث تبدأ الإبرة في الاستدقاق) (الشكل 1A).
   ملاحظة: بالنسبة لحقن E7.5 ، تعد الإبرة الطويلة والدقيقة أمرا بالغ الأهمية لأن منطقة الحقن صغيرة جدا وحساسة. الإبر القصيرة وواسعة التجويف ستؤدي إلى وفيات جنينية.
4. طحن طرف الإبرة المقطوعة لإنشاء شطبة حادة (الشكل 1C-F).
   1. طحن الإبرة بزاوية 20 درجة بسرعة قصوى لمدة 30-45 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يضاف الماء فائق النقاء إلى صفيحة الطحن ليكون بمثابة مادة تشحيم ، ويقلل من الاحتكاك / درجة الحرارة ، ويغسل جزيئات الزجاج (الشكل 1B). ومع ذلك ، يمكن للسائل الزائد إبطاء المطحنة.
   2. تأكد من أن طرف الإبرة (الشكل 1C) يلامس سطح لوحة الطحن (الشكل 1D) ولكنه لا ينحني (الشكل 1E).
      ملاحظة: ينتج عن الطحن المنحني طرف إبرة طويل وهش بزاوية شطبة غير صحيحة ، والتي يمكن أن تنكسر بسهولة أثناء الحقن. يمكن أن تضر الإبر المكسورة بالجنين ويجب استبدالها بإبرة سليمة. يظهر طرف أرضي صحيح في الشكل 1F,G. بعد الطحن ، من المتوقع أن يكون لتجويف الإبرة الناتج قطر داخلي (ID) يبلغ ~ 15 ميكرومتر وقطر خارجي (OD) يبلغ ~ 35 ميكرومتر (الشكل 1G).
5. املأ حقنة 1 مل بالزيت المعدني وأرفق إبرة 27 جم.
6. قم بإزالة غطاء الإبرة وأدخل إبرة المحقنة في الشعيرات الدموية الزجاجية المطحونة حديثا. حقن الزيت المعدني حتى يقطر الزيت من الطرف الشعري. استمر في الحقن أثناء سحب إبرة 27 جم حتى تمتلئ الإبرة الشعرية بالزيوت المعدنية ، وبعد ذلك يمكن إزالة إبرة المحقنة.
7. قم بتخزين الإبر المملوءة بالزيوت الأرضية والمعدنية في بيئة مغلقة لمنع التلف وتراكم الغبار. للتخزين ، أدخل لفافتين من طين النمذجة في طبق بتري عادي ليكون بمثابة حاملات (الشكل 1H). ضع الإبر بلطف على الطين وافصلها عن بعضها البعض لسهولة استرجاع الإبر.
   ملاحظة: نظرا لأن تحضير الإبرة يستغرق وقتا طويلا ، فمن الأفضل تحضير الإبر قبل يوم واحد على الأقل من الحقن. تخلص من الإبر بعد اثنين من الفضلات كحد أقصى لأنها ستصبح حادة. قم دائما بإعداد إبر احتياطية في حالة تلف الإبرة أثناء التحضير أو الحقن.

الشكل 1: تحضير الإبرة لحقن التجويف الأمنيوسي E7.5. (أ) أمثلة تمثيلية لإبرة شعرية زجاجية مسحوبة ولكن غير مقطوعة (يسار) ، وإبرة شعرية مقطوعة بالطول الأمثل لحقن E7.5 (في الوسط) ، وقص شعري قصير جدا (يمين). (ب) المطحنة ذات التغطية الموحدة للماء ، وهي جاهزة لطحن الإبرة. (C-F) أمثلة تمثيلية لنصائح الإبرة المختلفة. (ج) طرف إبرة مقطوع ولكن غير مطحون مثبت في المطحنة ؛ (D) وضع طحن مثالي مع طرف الإبرة فقط لمس المطحنة ؛ (ه) خفض الإبرة بعيدا جدا والانحناء أثناء عملية الطحن ؛ (F) طرف إبرة أرضي مثالي لحقن E7.5 AC. (ز) طرف إبرة أرضي يوضح التجويف بقطر داخلي يبلغ ~ 15 ميكرومتر وقطر خارجي يبلغ ~ 35 ميكرومتر ، وهو مناسب لحقن E7.5 AC. يظهر تجويف الإبرة كخطوط متقطعة. القطر الخارجي يشار إليه برؤوس أسهم حمراء ؛ القطر الداخلي يشار إليه برؤوس أسهم زرقاء. (ح) تخزين الإبرة: طبق بتري مملوء بإبر مسحوبة ومطحونة. صفان من طين النمذجة بمثابة حاملين. ملاحظة: بالنسبة لميكرومتر العين في C و F و G ، ينقسم 1 سم إلى 100 ملعب. الهدف هو 3x ؛ لذلك ، 1 درجة = 10000 ميكرومتر / (100 × 3) ≈ 33.4 ميكرومتر. الاختصارات: AC = التجويف الأمنيوسي. معرف = القطر الداخلي; OD = القطر الخارجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. قبل يوم من الحقن: إعداد مقاعد البدلاء للتحقق بالموجات فوق الصوتية من الحمل

ملاحظة: ينبغي تنفيذ جميع الأعمال في مقعد من المستوى 2 (BSL 2) للسلامة الأحيائية جيد التهوية عند العمل مع فيروس lentivirus. يمكن إجراء التحقق بالموجات فوق الصوتية من الحمل على مقعد جيد التهوية.

1. قم بتشغيل جهاز الموجات فوق الصوتية وطاولة التدفئة وإمدادات O₂ لمضخة الأيزوفلوران (يمكن أن تختلف بين المعدات).
   ملاحظة: تحقق من نظام الايزوفلوران لضمان عدم تسرب الايزوفلوران في الهواء.
2. ضع كيس نفايات فارغا (مثبتا على الحائط الداخلي لسهولة الوصول إليه) ، وكريم إزالة الشعر ، ومسحات قطنية معقمة معبأة ، وماء ، ومناديل ورقية ، وشريط جراحي داخل مقعد BSL 2.
3. تحضير أربع قطع من الشريط الجراحي (~ 7 سم) لتأمين أطراف الماوس أثناء الفحص بالموجات فوق الصوتية للحمل.

3. فحص الموجات فوق الصوتية لتأكيد الحمل

ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في اليوم السابق لحقن E7.5، في E6.5. انظر المناقشة للحصول على تفاصيل حول التحقق من عمر الحمل.

1. ضع الفأر الأنثوي المتزاوج زمنيا في غرفة الحث.
2. قم بتشغيل تدفق الغاز بتدفق أكسجين يبلغ ~ 2.1 LPM وجرعة أولية من 3-4٪ isoflurane للحث على التخدير.
3. تحقق من أن الأنثى مخدرة تماما عن طريق التحقق من منعكس مخلب. إذا كان منعكس المخلب غائبا ، فقم بخفض الأيزوفلوران إلى 1.5-2٪.
   ملاحظة: يستغرق الأمر حوالي 3 دقائق للحث على التخدير.
4. قم بتبديل تدفق الغاز من غرفة الحث إلى مخروط أنف طاولة التسخين.
5. ضع الأنثى المخدرة في وضع ضعيف (البطن لأعلى) على طاولة التدفئة وضع الخطم في مخروط الأنف المرفق لضمان الحفاظ على التخدير أثناء الفحص بالموجات فوق الصوتية للحمل.
6. اربط جميع الكفوف الأربعة على الطاولة بالقطع المعدة من الشريط الجراحي دون تمديد جسم الأنثى أو محاصرة الشوارب.
7. ضع كمية بحجم حبة البازلاء من كريم إزالة الشعر على أسفل البطن. باستخدام قطعة قطن ، قم بتوزيع الكريم على أسفل البطن (مربع ~ 3 × 3 سم) وقم بتدليكه بلطف عن طريق لف قطعة القطن ذهابا وإيابا.
8. بمجرد أن يبدأ الفراء في الانفصال عن الجلد ، قم بترطيب المناديل الورقية وإزالة الكريم والفراء. نظف المنطقة المنزوعة الفراء بورق مناديل مبللة حتى يختفي كل الكريم والشعر. جفف الجلد.
9. ضع كمية بحجم البرقوق من هلام الموجات فوق الصوتية على المنطقة المحلوقة واستمر في تحديد الرحم باستخدام الموجات فوق الصوتية بأي من الطرق الثلاث التالية.
   1. للقيام بذلك يدويا ، أمسك مسبار الموجات فوق الصوتية في هلام الموجات فوق الصوتية وحرك المسبار للعثور على الرحم.
   2. بالنسبة للنهج شبه اليدوي رقم 1 ، ضع مسبار الموجات فوق الصوتية (المتصل بنظام الدرابزين) فوق بطن الأنثى عن طريق تخفيف وتحريك جزء من السكة الحديدية على طول المستوى x. اخفض مسبار الموجات فوق الصوتية إلى الجل (المستوى z) وامسح عبر أسفل البطن (المستوى y) (الشكل 2A).
   3. بالنسبة للنهج شبه اليدوي رقم 2 ، قم بخفض مسبار الموجات فوق الصوتية (المتصل بنظام الدرابزين) في الجل لتصوير أسفل البطن. حافظ على مسبار الموجات فوق الصوتية ثابتا أثناء العملية ، وحرك طاولة التسخين مع العجلات المرفقة على طول الطائرات x و / أو y (الشكل 2B).
      ملاحظة: في هذه المراحل الجنينية المبكرة، يمكن أن تظهر الأعضاء الداخلية، مثل الأمعاء، مشابهة للرحم في التصوير بالموجات فوق الصوتية. ومع ذلك ، في حين تظهر الأجنة و decidua كسلسلة من الكرات (أقرب إلى الخرز على طول قلادة) ، فإن الأمعاء لها مظهر أنبوب مستمر. يمكن تقييم اتصال المساحات المضيئة (المجالات المنفصلة مقابل الأنبوب المستمر) عن طريق المسح ذهابا وإيابا من خلال بنية الاهتمام لتحديد ما إذا كانت البنية عبارة عن كرة منفصلة (جنين / ديسيدوا) (الشكل 2C) أو أنبوب مستمر (الأمعاء) (الشكل 2D). في هذه المرحلة ، ليس من الضروري تسجيل عدد الأجنة ؛ يكفي تأكيد وجودهم أو غيابهم.
10. بمجرد تحديد حالة الحمل ، ارفع مسبار الموجات فوق الصوتية بعيدا عن البطن وامسح أسفل البطن نظيفا بورق مناديل رطب لإزالة هلام الموجات فوق الصوتية.
11. قم بإيقاف تشغيل مضخة الأيزوفلوران وإزالة الشريط الجراحي لإطلاق الكفوف.
12. ضع الأنثى في وضع الانبطاح (البطن لأسفل) في قفص نظيف على لوحة تسخين 40 درجة مئوية. أبق الأنثى تحت المراقبة الدقيقة حتى تستعيد وعيها ، الأمر الذي يستغرق 2-6 دقائق.
    ملاحظة: تأكد من أن فحص الموجات فوق الصوتية لأنثى واحدة هو <10 دقيقة لتقليل التعرض للأيزوفلوران.
13. إزالة جميع المواد والنفايات وتنظيف جميع الأسطح مع 70٪ من الإيثانول. امسح أي جل الموجات فوق الصوتية المتبقي من مسبار الموجات فوق الصوتية باستخدام منديل ورقي جاف وناعم وخالي من الوبر. قم بإيقاف تشغيل جهاز الموجات فوق الصوتية ، ومقعد التهوية / مقعد BSL2 ، وطاولة التدفئة ، وإمدادات O₂ .

4. فحص الموجات فوق الصوتية لتدريج الجنين

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة قبل الجراحة وتعمل على تقسيم الإناث الحوامل إلى طبقات وفقا لأحجام AC الخاصة بهن. هذه الخطوة حاسمة في E7.5 عندما يكون الهدف هو استهداف الجهاز العصبي المركزي النامي. في هذه المرحلة المبكرة من التطور ، يؤثر اختلاف بضع ساعات في التطور بشكل كبير على حجم التيار المتردد وتطور العصبية.

1. تخدير أول أنثى أنثى فأرة حامل باتباع الخطوات الواردة في الخطوات 3.1-3.5.
2. ضع الأنثى وقم بتثبيتها على الطاولة كما هو موضح في الخطوة 3.6.
3. ضع كمية بحجم البرقوق من هلام الموجات فوق الصوتية على البطن الحليق واخفض مسبار الموجات فوق الصوتية لتصوير أسفل البطن للأنثى.
   ملاحظة: تفترض هذه الخطوة أن الأنثى قد تم فحصها بالموجات فوق الصوتية في اليوم السابق للحمل وتمت إزالة الفراء بالفعل على البطن. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيجب إزالة الفراء قبل إضافة هلام الموجات فوق الصوتية باتباع الخطوات 3.7-3.8. في E7.5 ، يكون الرحم و deciduas أكبر وأسهل في التمييز عن الأعضاء الداخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التيار المتردد أكبر ويمكن تمييزه عن التجويف الخارجي (ExC).
4. مسح من خلال قرون الرحم اليسرى واليمنى على أكمل وجه ممكن.
   ملاحظة: بعض الأجنة تكمن أعمق داخل جسم الأنثى ويمكن تفويتها.
5. تسجيل عدد الأجنة ومراحلها. قم بتدوين عدد التجاويف الأمنيوسية ذات الحجم المثالي ، والتجاويف المقبولة ، و deciduas بدون تجويف (الشكل 2E-G).
6. مرحلة جميع حالات الحمل وترتيبها وفقا لذلك.
7. حقن الإناث بغالبية مكيفات الهواء ذات الحجم المثالي مباشرة بعد فحص الموجات فوق الصوتية (الخطوة 4.4) باتباع الإرشادات الواردة في الخطوات 4.5-4.7.
8. بالنسبة للإناث اللواتي لديهن أغلبية مقبولة (حيث لا يتم تقسيم التجاويف الخارجية والأمنيوسية بوضوح بعد إلى تجاويف) أو تجاويف غائبة ، قم بتأجيل الحقن وتنظيمها مرة أخرى بعد بضع ساعات. إذا كانت معظم التجاويف لا تزال صغيرة جدا ، فقم بتأجيل الحقن بمقدار 10-12 ساعة.

الشكل 2: فحص وتحديد مراحل التجاويف الأمنيوسية أثناء الفحص بالموجات فوق الصوتية. (أ) نظرة عامة على نظام السكك الحديدية مع مسبار الموجات فوق الصوتية المرفق ، حاقن النانو ، وطاولة التسخين. يمكن تحريك مسبار الموجات فوق الصوتية في طائرات x و y و z لتحقيق المحاذاة المثلى مع البطن الأنثوي أو ACs. (ب) يمكن تحريك طاولة التسخين عبر عجلتين في مستويين x و / أو y للسماح بمسح وتقييم دقيق للمكيفات ، في حين يمكن أن يظل مسبار الموجات فوق الصوتية ثابتا. (ج) صور تمثيلية بالموجات فوق الصوتية ل E6.5 deciduas داخل بطن الأنثى أثناء فحص الموجات فوق الصوتية لتأكيد الحمل (الخطوط العريضة البيضاء المنقطة). لم تتشكل أي تجاويف في هذه المرحلة. ومع ذلك ، في بعض الأحيان ، يكون المخروط المشيمي الخارجي (العلامات النجمية البيضاء) مرئيا. يمكن التعرف على Deciduas من خلال شكلها الكروي وتمييزها عن الأمعاء ، والتي تظهر كأنبوب واحد مستمر. (د) تسلسل الصورة التمثيلي للأمعاء الدقيقة (الخطوط العريضة المنقطة البيضاء) ، وهو مستمر في المسح الضوئي عبر أسفل البطن. (ه-ز) صور الموجات فوق الصوتية التمثيلية أثناء تدريج التجويف قبل حقن E7.5. تشكلت التجاويف الأمنيوسية والخارجية ويتم فصلها بواسطة السلى. يعمل المخروط المشيمي الخارجي كمصدر رئيسي للدم ويظهر كنقطة مضيئة في الموجات فوق الصوتية. التيار المتردد هو الأكثر بعدا عن المخروط المشيمي الخارجي. (ه) تظهر مكيفات التيار المتردد ذات الحجم المثالي أكبر من التجويف الخارجي، بينما تظهر التجاويف متوسطة الحجم أصغر (F). إذا لم تكن هناك تجاويف مرئية (G) ، فهذا يعني إما أن الجنين قد تم امتصاصه أو لم يصل إلى E7.5 بعد. أشرطة المقياس = 1 مم. الاختصارات: A = Amnion; AC = تجويف السلى; ExC = تجويف Exocelomic; EC = مخروط المشيمة الخارجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. يوم الحقن: إعداد مقعد BSL2 للجراحة

1. قم بلصق قطعة واحدة من الغشاء المرن على الفتحة الدائرية المركزية لطبق بتري المعدل والمتاح تجاريا. تأكد من أن الغشاء متصل جيدا بطبق بتري لمنع التسرب.
   ملاحظة: إذا أصبح الطبق متسربا أو لم يتم لصقه جيدا ، فيمكن تأمين حواف الغشاء المرن بشكل أكبر باستخدام شريط لاصق.
2. قم بعمل شق بطول 1-1.5 سم في وسط الغشاء المرن.
3. قم بتشغيل جهاز الموجات فوق الصوتية ، ومقعد BSL2 ، ولوحة التدفئة ، وإمدادات O₂ لمضخة الأيزوفلوران ، ومعقم الخرز الزجاجي (مضبوط على 300 درجة مئوية).
4. داخل مقعد BSL2 ، ضع كيس نفايات فارغا واحدا (مثبتا على الحائط الداخلي لسهولة الوصول إليه) ؛ مسحات القطن المعقمة المعبأة (استخدم واحدة جديدة لكل عملية جراحية / كل أنثى) ؛ الأدوات الجراحية (مقص ، ملاقط ، مشابك ، خياطة) ، وشريط جراحي ؛ زجاجة واحدة كاملة من المياه المالحة العازلة بالفوسفات في درجة حرارة الغرفة (PBS) ، وزجاجة فارغة واحدة لجمع النفايات ، وماصة واحدة سعة 25 مل ؛ طبق بتري واحد مع غشاء مرن للجراحة ؛ غطاء طبق بتري مع قطعة 2 × 2-3 × 3 سم من البارافيلم مثبتة على الغطاء مع قطرة ماء ؛ طين النمذجة: 4 كرات أو مكعبات أكبر (~ 3 × 3 × 3 سم 3 ) وقطعة أسطوانية واحدة (~ 4 × 1 سم) ؛ حقنة تحتوي على مسكن (على سبيل المثال ، البوبرينورفين ، 0.05-0.1 مجم / كجم من وزن الجسم) وهلام العينملاحظة: ستكون كرات (أو مكعبات) طين النمذجة بمثابة "أقدام" أو حوامل / حاملات لطبق بتري بمجرد وضع الطبق فوق بطن الأنثى. تؤمن القطعة الأسطوانية من الطين الأجنة داخل الطبق. إذا تم حقن أكثر من محلول واحد ، أو احتاجت الإبرة إلى إعادة تعبئتها أثناء الحقن ، فيمكن استخدام نفس القطعة من البارافيلم إذا كان من الممكن فصل المحاليل عن بعضها البعض.

6. تحميل الإبرة

1. امسح أي زيت معدني زائد بالمناديل الورقية للحصول على قبضة أفضل.
   ملاحظة: قم دائما بالتنظيف بعيدا عن الطرف لمنع التلف أو الإصابة.
2. تأكد من تثبيت جميع المكونات (حلقة O مانعة للتسرب واحدة ، وفاصل واحد ، وحشية أمامية واحدة - كلها موجودة تحت الكوليه ، الشكل 3A) في الاتجاه الصحيح (الشكل 3B ، تمت إزالة الكوليه للتصور) لتثبيت الإبرة الشعرية في مكانها وإنشاء اتصال محكم الإغلاق ، وتجنب تكوين الفقاعة عند التقدم أو سحب المكبس المعدني داخل الإبرة.
3. تأكد من سحب المكبس المعدني للحاقن النانوي بالكامل. تحقق من ذلك بالضغط على تعبئة وانتظر صوت صفير مزدوج يشير إلى أن المكبس قد تم سحبه بالكامل.
4. مع إرفاق كوليه ولكن خففت قليلا (فك 45-90 درجة) ، حرك الإبرة الزجاجية على المكبس المعدني وادفع الإبرة الشعرية مع المكبس المعدني من خلال الحشية الأمامية حتى تصل إلى الفاصل (الشكل 3C ، D ، تمت إزالة الكوليه للتصور).
   ملاحظة: تظهر بعض المقاومة عندما يمر المكبس عبر الحشية وينخفض عندما يصل إلى الفاصل. تأكد من إدخال الإبرة الشعرية بإحكام في الفاصل لإنشاء اتصال محكم الإغلاق (الشكل 3D).
5. قم بتأمين الإبرة عن طريق شد كوليه الحاقن النانوي (المسمار مرة أخرى بشكل آمن).
   ملاحظة: لا تفرط في الشد لأن هذا يمكن أن يسحق الإبرة.
6. اضغط على Empty (فارغ ) لدفع المكبس إلى داخل الإبرة وطرد الزيت من طرف الإبرة. إذا تحركت الإبرة الزجاجية ، فقم بسحب المكبس ، وإزالة الإبرة ، وإعادة التحميل. إذا تسبب ذلك في تكوين فقاعات هواء ، فقم بإزالة الإبرة وإعادة تعبئتها بالزيوت المعدنية.
   ملاحظة: يجب ألا تتحرك الإبرة المؤمنة بشكل صحيح مع المكبس.
7. ضع قطرة من الفيروس (~ 6 ميكرولتر) أو محلول حقن آخر على قطعة من البارافيلم¹ (الشكل 3E; تستخدم صبغة إيفانز الزرقاء لأغراض التصور).
   ملاحظة: الحد الأقصى لحجم الحاقن النانوي هو ~ 5 ميكرولتر.
8. اضغط على Fill لإنشاء فقاعة هواء لتكون بمثابة فاصل بين الزيت والمحلول (الشكل 3F).
   ملاحظة: يعمل هذا أيضا كعلامة تحديد المواقع عند ملء الإبرة أو إفراغها.
9. اخفض الإبرة ، واغمر الطرف في المحلول ، واضغط على Fill (الشكل 3F ، G).
10. راقب مستوى السائل أثناء تحميل المحلول بعد فقاعة الهواء. ادفع فارغ لطرد الانسداد وإعادة التحميل عن طريق الضغط على تعبئة إذا أصبحت فقاعة الهواء ممدودة دون دخول السائل إلى الإبرة. إذا لم يحل هذا المشكلة ، فقم بتغيير الإبرة.
11. عندما يتم تحميل الإبرة بالكامل (الشكل 3H) ، ارفع الإبرة في المستوى z ، واستنشق كمية صغيرة من الهواء عند الطرف لمنع تبخر المحلول عند طرف الإبرة وانسداد الإبرة.
12. أدر الحاقن النانوي بالإبرة المرفقة بعيدا عن المشغل، باتجاه الجزء الخلفي من المقعد، لمنع أي تلف أو إصابة عرضية.

الشكل 3: ربط الإبرة بالحاقن النانوي وتحميل المحلول. (أ) وضع البدء قبل تركيب الإبرة على الحاقن النانوي: مكبس معدني يتراجع تماما وكوليه متصل. (ب) تحت الكوليه ، تظهر جميع المكونات الثلاثة لتثبيت الإبرة وتأمينها بالترتيب الصحيح (من اليسار إلى اليمين): ختم الحلقة O (رقيقة وسوداء) ، فاصل (أبيض) ، حلقة O (أسود) مع ثقب كبير (يجب أن تمر الإبرة من خلاله). لضمان اتصال محكم الإغلاق ، تنزلق الإبرة الزجاجية فوق المكبس المعدني (C) وتدفع من خلال فتحة الحلقة O الأمامية حتى تصل إلى الفاصل (D). (ه-ح) تحميل الحل في الإبرة. (ه) توضع قطرة واحدة من المحلول على قطعة من البارافيلم على غطاء لوحة. (F) قم بإنشاء فقاعة هواء عن طريق الضغط على Fill قبل تحميل المحلول وغمر طرف الإبرة في المحلول. (ز) يتم تحميل المحلول في الإبرة. (ح) يتم تحميل المحلول في الإبرة. ملاحظة: تمت إزالة الكوليه في (B-D) للتصور ولكن يجب أن تظل متصلة أثناء التجارب. الخطوة الأخيرة لتأمين الإبرة هي تشديد الكوليه. تستخدم صبغة إيفانز الزرقاء للتصور في E-H. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. الحقن

ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات المستخدمة في هذا الإجراء قبل الجراحة وبين كل ماوس.

1. تخدير أول أنثى ذات تجاويف مثالية الحجم (انظر القسم 4).
2. ضع الأنثى وثقبها على الطاولة ، كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.6.
3. ضع جل العين على العينين لمنع جفاف القرنية وحقن مسكن الألم تحت الجلد.
   ملاحظة: المسكنات الموصى بها: البوبرينورفين (0.05-0.1 مغ/كغ من وزن الجسم) أو فلونيكسين (2.5 مغ/كغ) أو ما شابه ذلك وفقا للوائح المحلية للرفق بالحيوان. يتم الحفاظ على تسكين متعدد الوسائط حول الجراحة مع المسكنات عن طريق الحقن والأيزوفلوران.
4. قم بتحضير أسفل البطن عن طريق المسح بقطعة قماش مبللة بمحلول الكلورهيكسيدين 0.5 ملغ / مل (أو ما شابه ذلك) وتجفيف الجلد. استخدم المقص الجراحي لإجراء شق عمودي في خط الوسط 1.5-2.0 سم في أسفل البطن.
   ملاحظة: قم بإعداد المنطقة الجراحية باتباع إجراءات التطهير المعتمدة محليا.
5. ارفع الجلد بلطف وحرر الجلد من طبقة العضلات الأساسية ، حوالي 1 سم حول نقطة الشق ، لتسهيل الخياطة بعد الجراحة.
6. قم بعمل شق عمودي في خط الوسط يبلغ طوله 1 سم في طبقة العضلات.
7. مع زوج من الملقط ، ارفع جانبا واحدا من الجلد وطبقة العضلات ومع الزوج الآخر ، ابحث عن قرون الرحم.
   ملاحظة: يتم ترتيب الديسيدات مثل الخرز على قلادة ، في حين أن الأمعاء عبارة عن أنبوب واحد طويل ومستمر (الشكل 4A).
8. باستخدام الملقط ، اسحب بعناية كل من قرون الرحم من البطن. عقد الأنسجة بين الأجنة; لا تضغط عليهم مباشرة (الشكل 4B).
   ملاحظة: يتم ربط الرحم بالجسم في عنق الرحم ، ويتم ربط المبيضين / قنوات البيض عبر الأربطة. لا تسحبي / تفصلي الرحم عن نقاط الربط هذه.
9. عد وسجل عدد الأجنة على الجانبين الأيسر والأيمن.
10. عدد الأجنة إما من المبيض إلى عنق الرحم أو من عنق الرحم إلى المبيض.
    ملاحظة: هذا مهم بشكل خاص إذا تم جمع الأجنة المحقونة في المراحل الجنينية.
11. باستخدام قطعة قطن رطبة ، ادفع جميع الأجنة بلطف إلى تجويف البطن ، باستثناء الثلاثة الأولى التي يتم حقنها.
12. ضع قطرة من PBS على المرونة في طبق Petri وأمسكها مباشرة فوق الأجنة.
13. أدخل ملقطا مغلقا في شق المرونة وحرر الملقط لفتح الشق المرن بحيث يسقط السائل على الأجنة.
    ملاحظة: هذا يضمن إماهة الأجنة وأن الغشاء المرن يلتصق بالجلد الرطب للأنثى ، مما يمنع تسرب PBS في الخطوات التالية.
14. اسحب قسما من الرحم ، يتوافق مع ثلاثة أجنة ، من خلال المرونة مع ملقط ، وجثم بلطف طبق بتري على بطن الأنثى.
15. باستخدام الملقط وقطعة القطن الرطبة ، اضبط موضع الرحم والمرونة لضمان إغلاق المرونة على جلد الأنثى لمنع تسرب PBS.
16. استخدم الأقدام الطينية الأربعة لتثبيت وربط طبق بتري مباشرة فوق البطن ، مما يقلل الضغط على الأنثى وحساسية التصوير لتنفس ونبضات قلب الأنثى.
17. اضغط على أسطوانة الطين للنمذجة لأسفل على يمين الأجنة / الرحم لتثبيت الرحم (الشكل 4C).
    ملاحظة: تفترض تعليمات التوجيه هذه أن الإبرة تقع على يسار الأنثى وأن أجنة قرن الرحم الأيسر للأنثى مكشوفة. جانب الرحم (قرن الرحم الأيسر أو الأيمن) أمر بالغ الأهمية لأن AC إما يواجه الإبرة (القرن الأيسر; الشكل 4 دال) أو يواجه اسطوانة الطين المثبتة (القرن الأيمن. الشكل 4 هاء).
18. لحقن الأجنة من قرن الرحم الأيمن، ضع أسطوانة الطين على الجانب الأيسر من الأجنة (الشكل 4F) وأدر طاولة التسخين 180 درجة (الشكل 4G) لتحقيق الاتجاه الصحيح. إذا كان من الممكن تحريك الإبرة بدلا من ذلك، فقم بالتكيف حسب الاقتضاء مع الإعداد ذي الصلة.
19. أضف PBS إلى طبق Petri حتى يتم تغطية الأجنة والرحم ب PBS.
20. خفض مسبار الموجات فوق الصوتية في PBS وضبط جدول الماوس / الجراحة بحيث يتم محاذاة الجنين الأول مع مسبار الموجات فوق الصوتية لتسهيل تسجيل الحقن.
    ملاحظة: يشير مصطلح "أولا" إلى ترقيم الأجنة من المبيض إلى عنق الرحم.
21. افحص الأجنة الثلاثة وافحص المكيفات. حدد حجم الحقن على النحو التالي:
    1. قياس قطر التيار المتردد باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية. حقن 69 نانولتر إذا كان قطر التيار المتردد ≤0.2 مم ؛ حقن 2 × 69 نانولتر (= 138 نانولتر) إذا كان قطر التيار المتردد >0.2 مم و ≤0.29 مم ؛ وحقن 3 × 69 نانولتر (= 207 نانولتر) إذا كان قطر التيار المتردد > 0.29 مم (الشكل 4H).
       ملاحظة: أظهرت التجارب السابقة أن ما يصل إلى 207 أحجام حقن نانولتر جيدة التحمل في E7.5¹⁵. يتم تحقيق الحقن الناجحة مع الحد الأدنى من التأثير على البقاء على قيد الحياة عندما لا تتجاوز الزيادة النسبية في حجم التيار المتردد 90٪ ¹⁵. التباين في حجم التيار المتردد بين القمامة أو سلالات الماوس أمر شائع وقد يتطلب المزيد من التحسين.
22. اضبط أحجام الحقن باستخدام وحدة التحكم في الحقن.
23. اضبط سرعة الحقن على أن تتباطأ بمعدل حقن 23 نانولتر / ثانية.
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي طرازات المعدات المختلفة إلى قوى حقن مختلفة.
24. اخفض الإبرة إلى PBS باستخدام العجلات الرئيسية على نظام السكك الحديدية (الطائرات x و z ، الشكل 4I) واضغط على Empty على وحدة التحكم في الحاقن النانوي حتى يصل السائل إلى طرف الإبرة.
    ملاحظة: إذا انسدادت الإبرة، يمكن أن يؤدي الضغط على Empty إلى إذابة الانسداد و/أو طرد الانسداد.
25. ارفع الإبرة من PBS واضغط على حقن. تحقق من تفريغ قطرة من الحجم التقريبي المطلوب.
26. اخفض الإبرة في PBS وقم بمحاذاتها مع مسبار الموجات فوق الصوتية والجنين عن طريق تحريك الحاقن النانوي مع عجلة المستوى y على المتلاعب الدقيق (الشكل 4J).
    ملاحظة: يتم محاذاة طرف الإبرة تماما عندما يظهر كنقطة مضيئة على صورة الموجات فوق الصوتية (الشكل 4K ، L). يمكن تحريك الإبرة في جميع مستويات الاتجاه الثلاثة باستخدام المتلاعب الدقيق.
27. اضبط زاوية الإبرة باستخدام عجلة زاوية الحقن لضمان زاوية حقن شبه عمودية بالنسبة لجدار الرحم. أدخل الإبرة في التيار المتردد بحركة واحدة باستخدام عجلة الحقن على المتلاعب الدقيق (الشكل 4J-M). راقب سطوع طرف الإبرة. إذا اختفى طرف الإبرة من صورة الموجات فوق الصوتية، فحرك مسبار الموجات فوق الصوتية إلى الأمام أو الخلف لإعادة الإبرة إلى التركيز البؤري.
    ملاحظة: بمجرد أن تكون الإبرة داخل التيار المتردد ، يمكن إجراء تعديلات طفيفة على موضع الإبرة والتركيز دون الإضرار بالجنين (التعديلات في حدود ~ 0.3 مم). لا تقم بضبط موضع الإبرة أكثر من هذا.
28. اضغط على حقن (ل 207 nL ، اضبط مستوى الصوت على 69 nL وحقن ثلاث مرات). بعد الحقن ، انتظر 5-10 ثوان إضافية قبل سحب الإبرة في حركة واحدة لطيفة.

الشكل 4: الحجم الأمثل والاتجاه الأمثل للتجويف الأمنيوسي للحقن الناجحة . (أ) قرن الرحم مع العديد من الديسيدوات E7.5 ، على شكل سلسلة من الكرات (أسفل) مقارنة بالأمعاء الغليظة (أعلى). (ب) الإمساك بأنسجة الرحم (الخطوط البيضاء المنقطة) بين الديسيدوا. تجنب الضغط على الديسيدوات (رؤوس الأسهم البيضاء) مباشرة باستخدام الملقط لأن الديسيدات والأجنة النامية هشة في هذه المرحلة المبكرة وعرضة للارتشاف عند القوة الخارجية المفرطة. (ج) أنثى في وضع ضعيف مع نفضيات مكشوفة في طبق بتري مملوء ب PBS ومثبتة على أربعة أقدام من طين النمذجة. يتم تثبيت الديسيدات بواسطة قطعة إضافية من طين النمذجة ، على شكل أسطوانة. (دال، هاء) يتأثر اتجاه التيار المتردد بجانب قرن الرحم المكشوف. إذا تم استخدام deciduas من قرن الرحم الأيسر ، فسيواجه التيار المتردد بعيدا عن مثبت الطين وسيكون من السهل الوصول إليه من الإبرة الموجودة على اليسار (D). ومع ذلك ، إذا تم استخدام قرن الرحم الأيمن ، فسيواجه المخروط المشيمي الخارجي بدلا من ذلك الإبرة ، مما يجعل من الصعب الوصول إلى AC (E). لذلك ، عند الحقن في قرن الرحم الأيمن ، يتم وضع مثبت الطين نحو الجانب المواجه للإبرة (F) ، ويتم تدوير طاولة التسخين بأكملها 180 درجة (G). (ح) أحجام الحقن الموصى بها وفقا لأحجام التيار المتردد. بشكل عام ، يمكن حقن التجاويف التي يبلغ قطرها ≤ 0.2 مم بحد أقصى 69 نانولتر. يمكن حقن الأقطار > 0.2 مم و ≤ 0.29 مم حتى 2 × 69 نانولتر (138 نانولتر) والتجاويف > 0.29 مم مع 3 × 69 نانولتر (207 نانولتر). قضبان المقياس = 1 مم. (I، J) يتم توصيل حاقن النانو بنظام السكك الحديدية ويمكن تحريكه في طائرات x و / أو z. يمكن ضبط زاوية الإبرة باستخدام عجلة زاوية الحقن . (K، L) يتم محاذاة طرف الإبرة (رأس السهم الأبيض) مع التيار المتردد عند ظهوره بشكل أكثر سطوعا في الموجات فوق الصوتية (L). (M) صورة بالموجات فوق الصوتية تظهر عملية الحقن ، حيث يكون طرف الإبرة في التيار المتردد ومحاذاة بشكل جيد (رأس السهم الأبيض). الاختصارات: A = Amnion; AC = تجويف السلى; ExC = تجويف Exocelomic; EC = مخروط المشيمة الخارجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

29. انقل المرحلة إلى الجنين التالي وكرر الخطوات 7.22-7.26 للجنينين الآخرين إذا كان لديهما أحجام تكييف مناسبة.
30. ارفع مسبار الموجات فوق الصوتية والإبرة من PBS باستخدام المتلاعب الدقيق. أدر الإبرة بعيدا عن المشغل لتجنب التلف والإصابة.
31. باستخدام الملقط ، قم بتوجيه^{الأجنة 1 و 2} مرة أخرى إلى بطن الأنثى عن طريق دفعها بلطف من خلال المرنة. أمسك بلطف الأنسجة المجاورة للجنين³ وسحب الرحم نحو الطرف العلوي من الشق المرن. اسحب بلطف الأجنة^{4-6 ث} باستخدام ملقط واسمح للجنين^الثالث بإعادة دخول البطن.
    ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة دون تغيير PBS أو إزالة طبق Petri.
32. كرر ذلك حسب الحاجة حتى يتم حقن جميع الأجنة التي تحتوي على مكيفات هواء مثالية أو يتم الوصول إلى الحد الزمني.
33. ادفع الأجنة / الرحم بلطف مرة أخرى إلى بطن الأنثى.
34. استنشق PBS وأزل طبق بيتري. إذا تم استخدام فيروس ، فتعامل معه كنفايات معدية.
35. خياطة الطبقة العضلية معا مع Vicryl (USP 6-0 ، طول الإبرة 13 مم ، 3/8 دائرة) في خيوط بسيطة مستمرة أو متقطعة وإغلاق الجلد ب 1-2 مقاطع (انظر جدول المواد).
36. قم بإيقاف تشغيل مضخة الأيزوفلوران.
37. قم بإزالة الشريط الجراحي ووضع الأنثى في وضع الانبطاح (البطن لأسفل) في قفص نظيف على لوحة تسخين 40 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المتوقع أن تستعيد الأنثى وعيها وأن تكون متحركة في غضون 10 دقائق. تأكد من اكتمال الإجراء في غضون 30 دقيقة. قد تؤثر الخلفية الوراثية والعمر والوزن للأنثى على الحساسية للتخدير. راقب الفئران أثناء الجراحة بحثا عن علامات التنفس البطيء (التنفس البطيء يعني أن التخدير عميق جدا) أو الحركة (التخدير خفيف جدا). يمكن توفير البوبرينورفين (0.05-0.1 ملغم / كغم من وزن الجسم) أو فلونيكسين (2.5 مغ / كغ) أو ما شابه ذلك وفقا للوائح رعاية الحيوان المحلية ، بعد 8 ساعات من الحقن الأول إذا لزم الأمر.
38. إذا تم حقن أنثى أخرى ، فقم بإعداد المنطقة الجراحية أثناء مراقبة استيقاظ الأنثى الأولى.
    1. امسح الأدوات الجراحية بالإيثانول بنسبة 70٪ لإزالة أي دم أو أنسجة متبقية وتعقيمها في معقم الخرز الزجاجي المسخن مسبقا لمدة 10 ثوان. تخلص من مسحات القطن والمناديل الورقية المستخدمة. امسح طبق بتري وقطع الطين الجافة بالمناديل الورقية.
39. كرر الخطوات 7.1-7.35 حتى يتم حقن جميع الإناث.
40. أفرغ الإبرة وتخلص منها.
    1. إذا كان هناك فيروس أو محلول حقن متبق في الإبرة، فاضغط على إفراغ على الحاقن النانوي وإفراغ محتوى الإبرة على المناديل الورقية.
    2. اسحب المكبس المعدني تماما عن طريق الضغط على Fill حتى يكون هناك صفير مزدوج من وحدة التحكم ، مما يشير إلى أن المكبس قد تم سحبه بالكامل.
    3. قم بفك الكوليه وحرك الإبرة عن المكبس المعدني. تخلص من الإبرة في حاوية نفايات الأدوات الحادة.
41. نظف مقعد BSL-2.
    1. إذا تم استخدام فيروس ، فقم برش المجال الجراحي بأكمله بمطهر (انظر جدول المواد). بعد 15 دقيقة ، امسح المطهر ونظف المجال الجراحي بأكمله باستخدام 70٪ من الإيثانول. إذا لم يتم استخدام أي فيروس ، فقم بتنظيف جميع الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    2. امسح أي PBS متبقي من مسبار الموجات فوق الصوتية باستخدام ورق مناديل جاف وناعم وخالي من الوبر.
42. تخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية.
43. قم بإيقاف تشغيل جهاز الموجات فوق الصوتية وطاولة التدفئة ومقعد BSL2 وتوريد O₂ .

النتائج

تم جمع الأجنة التي تم حقنها في E7.5^{باستخدام فيروس} hPGK-H2B-GFP lentivirus ^11,12 في E13.5 وفحصها تحت مجهر تشريح الفلورسنت (الشكل 5A). ينتج عن النقل الناجح للصفيحة العصبية أجنة ذات تعبير قوي عن مراسل الفلورسنت في الدماغ بشكل رئيسي وفي الأنسجة الأخرى المشتقة من الأديم الخارجي ، على سبيل المثال ، الجلد (الشكل 5A ، B). إن حقن حجم كبير بشكل مفرط (أكبر من الأحجام الموصى بها هنا ، على سبيل المثال ، ≥500 نانولتر) يزيد من الضغط في التيار المتردد ويمكن أن يؤدي إما إلى ارتشاف كامل (البيانات غير معروضة) أو عيوب الأنبوب العصبي مثل exencephaly (الشكل 5A). تؤدي الحقن الناجحة في E7.5 إلى نقل منتظم من الدماغ الأمامي إلى الدماغ الخلفي (الشكل 5C-J).

تحقق عيارات Lentiviral حوالي 2 × 10 10 وحدات معدية (IFU) أكثر من 95٪ من الاستهداف ، في حين أن عيارات ~ 1 ×^{10 9} IFU تحقق 15٪ من كفاءة الاستهداف¹⁵. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا استهداف الهياكل التي كان من الصعب استهدافها سابقا باستخدام الكهربية ، مثل الضفيرة المشيمية ^17,18 ، (الشكل 5 E ، F). يمكن تعديل فعالية النقل عن طريق ضبط العيار الفيروسي الذي يتم تسليمه إلى AC. تؤدي حقن العيار المنخفض إلى نقل المستنسخات أحادية الخلية (الشكل 5C والشكل 5E والشكل 5G وH) في حين أن استخدام الفيروس عالي العيار ينقل ما يقرب من 100٪ من الدماغ بأكمله (الشكل 5D والشكل 5F والشكل 5H والشكل 5J ). لذلك ، يمكن استخدام NEPTUNE إما للنقل النسيلي ، وتتبع النسب ، ونهج الفحص الجيني أو دراسة الآثار العالمية للإفراط في التعبير الجيني أو خفض التنظيم في الدماغ بأكمله.

تطور عين الثدييات هو نتيجة للاتصال المنظم جيدا بين ثلاثة مشتقات من الأديم الخارجي الجنيني: الشبكية العصبية (NR) وظهارة صبغة الشبكية (RPE) مشتقة من الظهارة العصبية للدماغ الأمامي البطني ، في حين أن الأديم الخارجي السطحي يؤدي إلى العدسة المستقبلية وظهارة القرنية. ومع ذلك ، فإن السدى المركزية والبطانة الخلفية ، وهما الطبقتان الأخريان من القرنية ، مشتقتان من خلايا القمة العصبية في اللحمة المتوسطة حول العين^19,20. أظهرت المقاطع الإكليلية من خلال أجنة E13.5 ، التي تم حقنها في E7.5 مع فيروس lentivirus عالي العيار ، على غرار الدماغ ، انتقالا عاليا وموحدا للأنسجة العصبية للعين ، وكذلك العدسة والقرنية واللحمة المتوسطة (الشكل 5K). مع تقدم العصاب ، تؤدي الحقن عند E8.5 و E9.5 إلى استمرار استهداف العدسة وظهارة القرنية (الشكل 5L والشكل 5N) ، في حين أن نقل الأنسجة المشتقة من الأديم العصبي في العين أقل كفاءة عند E8.5 (الشكل 5L ، M) أو لا يستهدف E9.5 (الشكل 5N).

في حين أن معظم الجسيمات الفيروسية تصيب الأنسجة المكشوفة عند الحقن ، فإن بعض الجسيمات تنقل الأنسجة المشتقة غير الخارجية التي تتطور لاحقا (الشكل 6A). تتطور الغدد والقنوات اللعابية حول E11.5 من الظهارة الفموية²¹ ويتم استهدافها باستخدام NEPTUNE (الشكل 6B). بعد الحقن في E9.5 ، يتم نقل الظهارة اللسانية للسان بشكل جيد. ومع ذلك ، فإن اللحمة المتوسطة الأساسية سالبة (الشكل 6C ؛ تشير الأقواس إلى الخلايا المحولة ؛ تشير العلامات النجمية إلى إشارة التألق الذاتي وليس الخلايا المحولة). بالإضافة إلى ذلك ، هناك مجموعات إيجابية داخل الظهارة اللسانية ، مفصولة بأقسام سالبة (الشكل 6C ، رؤوس الأسهم البيضاء) ، مما يشير إلى نقل سطح الحليمة. تم وصف خلايا القمة العصبية في اللحمة المتوسطة للسان الأساسية وداخل الظهارة اللسانية ، حيث تشارك في تطوير حليمات التذوق وبراعم التذوق²². في الواقع ، تؤدي الحقن في E7.5 إلى نقل واسع النطاق لحامة اللسان المتوسطة عند E13.5 (الشكل 6D) ، مما يشير إلى أن الحقن المبكرة تستهدف خلايا القمة العصبية ، مما يساهم في اللحمة المتوسطة في اللسان.

في الفقاريات ، تعد العقد الجذرية الظهرية (DRGs) مكونا مركزيا للجهاز العصبي المحيطي (PNS) ، حيث تنتقل جميع المدخلات الحسية الجسدية من محيط الجسم (درجة الحرارة والألم والضغط) إلى الدماغ عن طريق تنشيط الخلايا العصبية DRG²³. يتم اشتقاق كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في DRG من خلايا القمة العصبية الجذعية²⁴. يؤدي الحقن الفيروسي اللئيم ، الذي يتحكم فيه مروج hPGK في كل مكان في التعبير عن مراسل الفلورسنت ، إلى استهداف واسع النطاق للجهاز العصبي المركزي والمحيطي (الشكل 7A) ، مما يؤدي إلى نقل كل من الخلايا العصبية والأسلاف في الحبل الشوكي (الشكل 7B) ، وكذلك DRG (الشكل 7C). إن استخدام MiniPromoter ل doublecortin²⁵ يجعل من الممكن قصر تعبير GFP على الخلايا العصبية فقط (¹⁵ والشكل 7D ، E).

الشكل 5: كفاءة عالية أو نقل نسيلي مع نبتون. (أ) أجنة E13.5 تحت مجهر تشريح مضاء بإضاءة قياسية (اللوحة اليسرى) ونفس الأجنة مضاءة ل GFP (اللوحة اليمنى). الجنين غير المحقون في أقصى اليسار ، حقن الجنين بنجاح في أقصى اليمين ، مما أدى إلى إشارة إيجابية في الدماغ (الجنين في أقصى اليمين). الجنين الخارجي بسبب الحجم الزائد الذي يتم حقنه (الجنين الأوسط). (ب) استهداف الجلد والدماغ بحقن E7.5. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (C، D) E13.5 صور متحدة البؤرة للدماغ الأمامي مع نقل نسيلي منخفض (C) أو نقل عالي الكفاءة (D). (ج، هاء، ز، ط) النقل الاستنساخي لمناطق مختلفة في الدماغ. (د، و، و، ح، ي) نقل عالي الكفاءة لمناطق مختلفة في الدماغ. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. تمثل فعالية النقل المختلفة مناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي. (هاء، واو) استهداف الضفيرة المشيمية ، استنساخيا (E) أو بكفاءة عالية (F). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (G، H) الاستهداف النسيلي (G) والاستهداف عالي الكفاءة (H) للدماغ الخلفي، مكبرة في (I، J). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (K) تعبير مراسل GFP في العين عند E13.5 بعد حقن الرحم عند E7.5 (L ، M) تعبير مراسل GFP في العين عند E15.5 بعد حقن الرحم عند E8.5 (L) ، المنطقة المربعة المكبرة في (M) ، أو عند E9.5 (N). يتم تمييز الأوعية الدموية ذاتية الفلورسنت بنجوم بيضاء. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: NEPTUNE = neural plate targeting with in uteronano-injection; C = القرنية; LE = عدسة الظهارة; LF = ألياف العدسة; M = اللحمة المتوسطة; NR = شبكية العين العصبية; ON = العصب البصري; RPE = صبغة شبكية العين الظهارة; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; الجهاز العصبي المركزي = الجهاز العصبي المركزي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

الشكل 6: نقل الأنسجة غير العصبية في الرحم. (أ) صورة متحدة البؤرة لتجويف الفم E15.5. تم حقن الجنين بفيروس lentivirus المراسل الفلورسنت في E9.5. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (B, C) (B) تكبير اللوحة المضمنة; ظهارة القناة اللعابية المنقولة بالفيروس. (ج) تكبير اللوحة الداخلية؛ الظهارة اللسانية الظهرية المحولة مع فيروس مراسل GFP (قوس أبيض). اللحمة المتوسطة الكامنة المشتقة من خلايا القمة العصبية سلبية. تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى الحليمات ذات الخلايا العصبية السلبية المحاطة بالخلايا الظهارية المنقولة بالفيروسات (يتم تمييز خلايا / أوعية الدم ذاتية الفلورسنت بنجوم بيضاء). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (D) صورة تخطيطية ومتحدة البؤرة للحمة اللسان المتوسطة E13.5 بعد الحقن بفيروس مراسل الفلورسنت عند E7.5. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: D = الظهرية; M = اللحمة المتوسطة; N = البلعوم الأنفي; SLD = القناة تحت اللسان; SMD = القناة تحت الفك السفلي; T = اللسان; V = البطني; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: نقل خلايا العقدة الجذرية الظهرية المشتقة من القمة العصبية. (A) يسمح استهداف NEPTUNE عند E7.5 باستهداف كل من الجهاز العصبي المركزي و PNS. (ب) تظهر الصورة البؤرية للحبل الشوكي E13.5 و DRGs التي تم حقنها بمراسل hPGK-H2B-GFP lentivirus في E7.5 نقل كل من السلف العصبي SOX2+ والخلايا العصبية NeuN⁺. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (C) منطقة مربعة من B تظهر DRG مع تعبير GFP في مجموعات خلايا SOX2+ (الأسهم البيضاء) و NeuN⁺ (رؤوس الأسهم البيضاء). شريط المقياس = 20 ميكرومتر (D) صورة متحدة البؤرة للحبل الشوكي E13.5 و DRG المحقونة بفيروس DCX-H2B-GFP lentivirus عند E7.5 ، مستهدفة خلايا DCX ⁺ فقط. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (E) منطقة مربعة من D تظهر DRG مع تعبير GFP يقتصر على الخلايا العصبية DCX⁺ (رؤوس الأسهم البيضاء). خلايا ^DCX سالبة GFP (الأسهم البيضاء). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; الجهاز العصبي المركزي = الجهاز العصبي المركزي; PNS = الجهاز العصبي المحيطي; DRGs = العقد الجذرية الظهرية. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول التي تؤثر على البقاء الجنيني ، وجودة الحقن ، والقراءة. يتم تعريف عمر الحمل للأجنة على أنه E0.5 عند الظهر في يوم القابس المهبلي بعد التزاوج بين عشية وضحاها. يضمن إجراء فحص الموجات فوق الصوتية للحمل في E6.5 في وقت متأخر من بعد الظهر / المساء تطوير الأجنة بما يكفي ليتم تحديدها بواسطة الموجات فوق الصوتية. يسمح الفحص (1) بإجراء فحص مسبق لعدد الفئران الإيجابية للقابس الحامل بالفعل ، (2) يضمن عدم إذابة أي فيروس دون داع وإهداره في حالة عدم حمل الفئران الإيجابية للقابس ، و (3) يقلل من التدخلات غير الضرورية على الفئران (يتجنب الجراحة على الإناث غير الحوامل).

في E7.5 ، تكون الأجنة حساسة للقوى الخارجية ويجب التعامل معها بعناية. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي سحب قرون الرحم أو الضغط على الديسيدوات إلى ارتشاف الجنين. يجب دائما إبقاء أنسجة الرحم رطبة عندما تكون خارج بطن الأنثى لمنع الأنسجة من الجفاف. يجب أن تبقى غالبية الديسيدات داخل بطن الأنثى ، مع تعرض 3-4 فقط للحقن. حدة الإبرة هي محدد حاسم آخر للحقن الناجحة. تؤدي أطراف الإبرة الحادة أو المكسورة إلى تكرار دس الديسيدوات أو الضغط على طين النمذجة قبل الدخول إلى التيار المتردد ، مما قد يزيد من معدل الارتشاف. لذلك ، يجب دائما تخزين الإبر الأرضية والحادة بأمان واستبدالها بعد 2 أنثى كحد أقصى.

يصف هذا البروتوكول كيفية استهداف الصفيحة العصبية بحقنة واحدة من فيروس lentivirus. علاوة على ذلك ، فإنه يوضح كيف يمكن تكييف فعالية النقل من استنساخ خلية واحدة إلى الدماغ بأكمله. ومع ذلك ، يتم استهداف الأنسجة غير العصبية الأخرى ، بما في ذلك الجلد والظهارة الفموية ، أيضا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم نقل جميع أنواع الخلايا (السلف والخلايا المتباينة) ، مما يجعل هذا النهج فعالا ولكنه غير محدد. يؤدي استخدام MiniPromoters في البنية الفيروسية إلى التعبير المحدد عن الجين المحور في الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية¹⁵. هذا له ميزة تجنب استخدام Cre المعدلة وراثيا المخصصة ، وبالتالي يقلل من كمية العمالة (صيانة الإجهاد والتنميط الجيني) والتكاليف.

وتشمل القيود المفروضة على نبتون صعوبته التقنية، والتحديات التي تواجه الحصول على إناث حوامل بمعدل ثابت يمكن التنبؤ به، وتكاليف الحصول على أجهزة متخصصة. علاوة على ذلك ، يمكن اعتبار الاستهداف غير الانتقائي للخلايا بواسطة الفيروس اللئيم بمثابة فائدة وقيود على هذه التقنية. يؤدي حقن كميات أكبر في التيار المتردد إلى ظهور¹³ دماغيا ، على الرغم من تجنب تشوهات الدماغ والدماغ الخارجي مع الأحجام الموضحة هنا¹⁵. وبالتالي فإن التأثير السلبي على نمو الدماغ هو خطر مع حقن النانو في الرحم التي يجب تجنبها بعناية عن طريق حقن كميات صحيحة تتكيف مع المرحلة الجنينية وحجم التيار المتردد.

قد تركز التعديلات المستقبلية لهذه التقنية على المدارية الفيروسية. الفيروسات المرتبطة بالأدينو (AAVs) لها أنماط مصلية مختلفة ، والتي ثبت أنها تستهدف بقوة أنواع الخلايا المختلفة في الجهاز العصبي المركزي^17,26. ومع ذلك ، لا تندمج AAVs في جينوم الخلية المضيفة ، وبالتالي قد تضيع في الخلايا ذات معدل الانقسام المرتفع. على الرغم من وجود عدة طرق لزيادة خصوصية NEPTUNE ، إلا أن الحيوانات المعدلة وراثيا لا تزال المعيار الذهبي عندما يتعلق الأمر بالتلاعب الجيني في الجسم الحي. تم استخدام الفئران Cas9 وفيروس lentivirus المشفر sgRNA للفحص الجيني في البشرة الجنينية²⁷ ويمكن أيضا تكييفها مع الجهاز العصبي المركزي النامي.

الحقن في AC في E7.5 يستهدف بكفاءة خلايا الأديم العصبي قبل بدء العصب ويستهدف الدماغ النامي بشكل أكثر كفاءة من كهربية الرحم . هذا يسمح بدراسة الإشارات الجينية المهمة لنمو الدماغ من نقطة زمنية سابقة. على النقيض من نماذج الفئران الجينية الكلاسيكية ، يقدم NEPTUNE نهجا مرنا لإجراء تحليل الجينات الوظيفي. يمكن دراسة الأنماط الظاهرية بعد الإفراط في التعبير أو حذف الجينات في غضون أيام إلى أسابيع مقارنة بالأشهر أو السنوات. تسمح حقن تركيبات فيروسية متعددة بالتلاعب بالعديد من الجينات داخل جنين واحد وتجنب توليد بالضربة القاضية المزدوجة أو الثلاثية. لذلك ، لا يوفر NEPTUNE الوقت فحسب ، بل يمكنه أيضا تقليل عدد الحيوانات المستخدمة في البحث.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD Bioscience	309628
27 G Needle	BD Bioscience	300635
3.5 inches capillaries	Drummond Scientific	3000203G/X	Were used to pull in house needles
70 MHz MS Series transducer	Visual Sonics	MS700
Aquasonic clear ultrasound gel	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 mice	Charles River, Germany	Crl:CD1(ICR)	Females: from age of 8 weeks old Males: from the age of 12 weeks old
Cotton Swab	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Dressing forceps delicate straight 13 cm	Agnthos	08-032-130
EG-400 Narishige Micropipette Grinder	Narishige	NA
EZ clips 9 mm	Angthos	59027	clips
Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm	Agnthos	307-336-090
Isofluorane	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	Purchased from Swedish Pharmacy
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Membrane Tape	Visual Sonics	SA-11053
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Modeling Clay	Sense AB	10209
Mouse Handling Table	Visual Sonics	50249
Nanoject II Auto Injector Kit	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
Petri dish with central opening (low wall)	Visual Sonics	SA-11620
Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	130000132037	disinfectant
Silicone membrane	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, hot bead sterilizer	Angthos	31100
Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Imaging Station 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament	Agnthos	J384H