JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعد المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) أداة قوية في أبحاث السرطان الانتقالية ، مما يعكس عدم التجانس الجيني والمظهري للمرض والاستجابة للعلاجات الشخصية المضادة للسرطان. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول موحد لتوليد PDOs لسرطان المثانة الأولية البشرية استعدادا لتقييم تحليلات النمط الظاهري والاستجابات الدوائية.

Abstract

تفتقر منصات الاختبار العلاجي الحالية في المختبر إلى الصلة بالفيزيولوجيا المرضية للورم ، وعادة ما تستخدم خطوط الخلايا السرطانية التي تم إنشاؤها كثقافات ثنائية الأبعاد (2D) على بلاستيك زراعة الأنسجة. هناك حاجة ماسة إلى نماذج أكثر تمثيلا لتعقيد الورم يمكنها التنبؤ بدقة بالاستجابة العلاجية والحساسية. يهدف تطوير ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي من المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) ، المستمدة من أنسجة الورم الطازجة ، إلى معالجة أوجه القصور هذه. يمكن استخدام الثقافات العضوية كبدائل للورم بالتوازي مع الإدارة السريرية الروتينية لإبلاغ القرارات العلاجية من خلال تحديد التدخلات الفعالة المحتملة والإشارة إلى العلاجات التي قد تكون غير مجدية. هنا ، يهدف هذا الإجراء إلى وصف الاستراتيجيات وبروتوكول مفصل خطوة بخطوة لإنشاء PDOs لسرطان المثانة من الأنسجة السريرية الجديدة والقابلة للحياة. بروتوكولاتنا الراسخة والمحسنة عملية لإعداد ثقافات 3D للتجارب باستخدام مواد أولية محدودة ومتنوعة مباشرة من المرضى أو مواد الورم xenograft (PDX) المشتقة من المريض. يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء من قبل معظم المختبرات المجهزة بمعدات زراعة الأنسجة القياسية. يمكن استخدام المواد العضوية التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول كبدائل خارج الجسم الحي لفهم كل من الآليات الجزيئية التي تقوم عليها أمراض سرطان المسالك البولية وتقييم العلاجات لإبلاغ الإدارة السريرية.

Introduction

سرطان المثانة هو سرطان المسالك البولية الأكثر انتشارا وعاشر أكثر الأورام الخبيثة البشرية شيوعا في جميع أنحاء العالم1. وهو يشمل طيفا متنوعا وراثيا ومعقدا ظاهريا من المرض2. تعد الأشكال غير الغازية للعضلات غير الغازية لسرطان المثانة (NMIBC) هي أكثر تشخيصات سرطان المثانة شيوعا (70٪ -80٪) ، وتظهر هذه السرطانات عدم تجانس بيولوجي كبير ونتائج سريرية متغيرة2،3،4. عادة ما يعاني المرضى الذين يعانون من NMIBC من خطر كبير لتكرار المرض (50-70٪) ، وسوف يتطور ثلث السرطانات ويتطور إلى سرطان المثانة الغازي للعضلات (MIBC) الأكثر عدوانية2. على الرغم من أن معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات ل NMIBC مرتفعة (>90٪) ، يجب على هؤلاء المرضى الخضوع لإدارة سريرية طويلة الأجل5. من ناحية أخرى ، يعتبر MIBC المتقدم محليا (غير القابل للاستئصال) أو النقيلي غير قابل للشفاءبشكل عام 6. وبالتالي ، فإن سرطان المثانة لديه واحدة من أعلى تكاليف العلاج مدى الحياة داخل رعاية السرطان وهو عبء كبير على كل من الفرد ونظام الرعاية الصحية 3,7. الانحرافات الجينية الكامنة في الأمراض المتقدمة تجعل الإدارة العلاجية لسرطان المثانة تحديا سريريا ، ولم تتحسن الخيارات العلاجية للأورام البولية الغازية إلا مؤخرا منذ الموافقة على العلاجات المناعية لكل من NMIBC 8,9 المتقدم وعالي الخطورة. في الوقت الحالي ، تسترشد عملية صنع القرار السريري بالسمات السريرية والنسيجية المرضية التقليدية ، على الرغم من أن أورام سرطان المثانة الفردية تظهر اختلافات كبيرة في عدوانية المرض والاستجابة للعلاج10. هناك حاجة ملحة لتسريع البحث في نماذج مفيدة سريريا لتحسين التنبؤ بتشخيص المريض الفردي وتحديد العلاجات الفعالة.

تظهر المواد العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) إمكانات كبيرة كنماذج للورم بسبب قدرتها على التنظيم الذاتي وتلخيص الورم الأصلي الجوهري في بنية الجسم الحي والملف الدوائي الجيني ، وقدرتها على عكس الوظيفة الخلوية الأصلية للنسيج الأصلي الذي اشتقت منه 11،12،13 . على الرغم من أن خطوط خلايا سرطان المثانة الراسخة متاحة بسهولة ، وفعالة نسبيا من حيث التكلفة ، وقابلة للتطوير ، وسهلة التلاعب ، إلا أن خطوط الخلايا في المختبر تفشل إلى حد كبير في محاكاة طيف التغيرات الجينية والجينية المتنوعة التي لوحظت في سرطانات المثانة السريرية 12,14 وتم إنشاؤها جميعا وصيانتها في ظل ظروف ثقافة 2D ، الالتصاق. بالإضافة إلى ذلك، فإن خطوط الخلايا المشتقة من أورام المثانة الأولية والنقيلية تؤوي اختلافا وراثيا كبيرا عن مادة الورم الأصلية. 8,15.

وهناك نهج بديل يتمثل في استخدام نماذج الفئران المهندسة وراثيا والمسرطنة. ومع ذلك ، في حين أن هذه النماذج تلخص بعض الشلالات الطبيعية الورمية المشاركة في الأورام البشرية (تمت مراجعتها في المراجع16،17،18) ، فإنها تفتقر إلى عدم تجانس الورم ، وهي مكلفة ، وتمثل سرطان المثانة الغازي والنقيلي بشكل سيئ ، وغير قابلة للتطبيق لاختبار المخدرات السريع على المدى الطويل لأن الأورام يمكن أن تستغرق عدة أشهر لتطوير14،19 . توفر النماذج المشتقة من المريض من السرطان (بما في ذلك المواد العضوية ، وزراعة الخلايا الأولية المعاد برمجتها بشكل مشروط ، و xenografts) فرصا لا تقدر بثمن لفهم آثار العلاج الدوائي قبل العلاج السريري20. على الرغم من ذلك ، فإن عددا قليلا من المجموعات تستخدم بشكل روتيني هذه النماذج القريبة من المريض بسبب محدودية الوصول إلى أنسجة المريض الأولية الطازجة والتحسين الشامل المطلوب لتوليد ظروف زراعة العضوية المشتقة من المريض (PDO) بشكل متكرر. في بيئة الجسم الحي ، يمكن للخلايا السرطانية أن تتفاعل وتتواصل مع تركيبات مختلفة من المكونات المحيطة ، بما في ذلك الخلايا اللحمية ، والأنسجة التي تتسلل إلى الخلايا المناعية ، والمصفوفة12. وبالمثل ، بالنسبة لشركة تنمية نفط عمان المزروعة بتنسيق 3D ، يمكن تخصيص تعقيد الخلايا / المصفوفة لتشمل المكونات الأخرى ذات الصلة. يمكن إنشاء PDOs بسرعة وغالبا ما تكون قادرة على المرور على نطاق واسع أو حفظها بالتجميد لاستخدامها لاحقا ، على الرغم من أن عمرها محدود21،22،23. يمكن تقييم الديناميكا الدوائية (أي الاستجابة للدواء) باستخدام قراءات متعددة ، بما في ذلك الجدوى العضوية والمورفولوجيا ، وتوصيف أهداف الكيمياء النسيجية المناعية أو تغييرات النسخ.

هنا ، يتم وصف إجراءات إنشاء المواد العضوية لسرطان المثانة من مواد المريض التي تم جمعها من استئصال ورم المثانة عبر الإحليل (TURBT) أو الاستئصال الجراحي للمثانة (استئصال المثانة الجذري). يتم توضيح طريقة توليد PDOs ، باستخدام المواد والأدوات المختبرية الرطبة المتاحة بسهولة. تتضمن نقاط النهاية تغيرات في الخصائص المورفولوجية للخلية وقابليتها للحياة. تم قياس هذه باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، واختبارات الجدوى في المختبر (سلامة الأيض وغشاء الخلية) ، والتحليل النسيجي المرضي. يوضح الشكل 1 سير العمل لإنشاء PDOs لسرطان المثانة البشرية من المواد السريرية التي تم الحصول عليها أثناء الجراحة الاختيارية.

Protocol

وافق المرضى على هذه الدراسة بعد قبولهم تحت إشراف فريق المسالك البولية في مستشفى الأميرة ألكسندرا ، بريسبان ، أستراليا. أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي وضمن المبادئ التوجيهية الأخلاقية والمؤسسية (رقم الأخلاقيات HREC/05/QPAH/95، QUT 1000001165).

ملاحظة: كمعايير للأهلية ، كان عمر المرضى ≥ 18 عاما مصابا بالسرطان ، وقادرين على فهم وتقديم الموافقة. واستبعد أولئك الذين لم يتمكنوا من إعطاء الموافقة المستنيرة. واستبعد أولئك الذين لديهم لغة أساسية غير الانكليزية لأن توفير مترجمين شفويين لم يكن ممكنا بسبب اعتبارات لوجستية وتتعلق بالميزانية. كما تم استبعاد المرضى الذين لم تكن أورامهم متاحة للخزعة أو من غير المرجح أن تكون متاحة بكمية كافية بعد علم الأمراض الروتيني.

1. إعداد العضوية المتوسطة

ملاحظة: يتطلب الوسط العضوي لسرطان المثانة البشرية عوامل نمو تساعد في البقاء على قيد الحياة والنمو والتوسع المستمر للمواد العضوية المشتقة من المواد السريرية المنفصلة (الجدول 1). للحصول على تفاصيل كاملة عن كل ملحق مستخدم في هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى جدول المواد.

  1. تذوب المكونات المجمدة على الجليد أو في الثلاجة عند 2-8 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة والعمل من الأليكوتات المجمدة (المخزنة في -20 درجة مئوية).
  2. الوسط القاعدي: تحضير الوسط القاعدي عن طريق استكمال متوسط النسر المعدل المتقدم من دولبيكو / F-12 من لحم الخنزير (adDMEM / F12) مع HEPES (10 mM) والجلوتامين (2 mM). يستخدم هذا أيضا كوسيلة نقل ، وخلال خطوات الغسيل العضوي.
    ملاحظة: يستخدم DMEM/F-12 المتقدم كوسيط قاعدي للمساعدة في توسيع المواد العضوية في وجود مصل محدود؛ ومع ذلك ، فإنه يتطلب مكملات مع HEPES و L-الجلوتامين.
  3. لفترة وجيزة عامل نمو الخلايا الليفية بالطرد المركزي 10 (FGF-10) ، عامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF-2) ، عامل النمو الظهاري (EGF) ، SB202190 ، البروستاجلاندين E2 (PGE2) ، و A 83-01 قبل الفتح لضمان وجود المكونات في أسفل القارورة.
  4. وسط عضوي كامل: يكمل الوسط القاعدي بوسائط مشروطة بوسائط مشروطة ب noggin و R-spondin البشري بتركيز نهائي قدره 5٪ v / v ، EGF البشري (50 نانوغرام / مل) ، FGF-2 البشري (5 نانوغرام / مل) ، FGF-10 البشري (20 نانوغرام / مل) ، A 83-01 (500 نانومتر) ، SB202190 (10 ميكرومتر) ، B27 (1x) ، نيكوتيناميد (10 ملليمتر) ، N-acetylcysteine (1.25 mM) ، Y-27632 (10 μM) ، PGE2 (1 μM) وتكوين مضاد حيوي واسع الطيف بالتركيز الذي أشارت إليه الشركة المصنعة.
  5. تخزين الوسائط العضوية في 4 درجة مئوية في الظلام واستخدامها في غضون 2 أسابيع (1 شهر على الأكثر). لا تجمد. تجنب التعرض الطويل لمصادر الضوء.
    ملاحظة: يتم تحضير الوسط العضوي الخالي من المصل. ومع ذلك ، يمكن استكمال المصل والبنسلين / الستربتومايسين على أساس المستخدم إلى المستخدم حسب الاقتضاء.

2. قبل يوم من الإجراء الموضح في 3

  1. عامل نمو ذوبان الغشاء السفلي المنخفض (BME؛ انظر جدول المواد) بين عشية وضحاها لمدة 12 ساعة على الأقل قبل الاستخدام في ثلاجة 4 درجات مئوية أو غرفة باردة. إذا لزم الأمر، قم بتوزيع BME في 1 مل من الأليكوتات في أنبوب 1.5 مل من البولي بروبيلين أحادي الاستخدام لتجنب دورات التجميد والذوبان.
  2. ضع أطراف الماصة المصفاة في ثلاجة 4 درجات مئوية أو غرفة باردة.
    ملاحظة: يشير هذا القسم إلى أطراف الماصة التي سيتم استخدامها عند التعامل مع BME لمنع البلمرة المبكرة وتقليل طلاء BME على سطح الأطراف.
  3. تعقيم جميع المعدات الجراحية اللازمة لهذا الإجراء.

3. توليد ورم المثانة العضوي

ملاحظة: هذه خطوة أولية لإنشاء شركة تنمية نفط عمان من أورام المرضى الأساسيين. يتم تكييف هذا الإجراء لأنسجة سرطان المثانة من الطرق التي وضعها Gao et al.24.

  1. استخدم غطاء محرك السيارة من الفئة الثانية للمخاطر البيولوجية لإعداد العينة. استرجع الثلج الجاف والرطب واطبع ورقة معالجة عينات المريض (ملف تكميلي).
  2. اتصل بموظفي الأبحاث إلى غرفة العمليات عندما يكون الاستئصال الجراحي على وشك الانتهاء.
    ملاحظة: تأكد من أن المريض يستوفي معايير الأهلية ووقع على نموذج موافقة المشارك. يتم توفير الأنسجة للبحث فقط إذا كانت فائضة عن متطلبات التقييم النسيجي المرضي السريري.
  3. جمع عينة جديدة من الورم قابلة للحياة بالمنظار العياني من الجراحة. تأكد من غمر العينة في وسط النقل (إما 1x adDMEM/F12 أو 1x Dulbecco الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS)) في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل أو جرة عينة بول أثناء النقل.
    ملاحظة: في بعض المراكز السريرية، قد تحتاج الأنسجة إلى نقلها إلى مختبر علم الأمراض ليتم تخصيصها للبحث. في ظل هذه الظروف ، يوصى بإضافة المضادات الحيوية ومضادات الفطريات إلى وسيط النقل. يمكن تخزين الأنسجة عند 4 درجات مئوية في الوسط القاعدي لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد الجراحة ولا تزال تولد ثقافات عضوية قابلة للحياة.
  4. سجل تفاصيل العينة، بما في ذلك وزن الأنسجة (جم أو ملغ)، ووصف العينة، والتفاصيل المتعلقة بأي عينات دم وبول على ورقة معالجة عينات المريض (الملف التكميلي).
  5. قم بإزالة وسيط النقل بعناية واستبدله ب 10 مل من الوسائط القاعدية. اسمح لأنسجة الورم بالاستقرار عن طريق الجاذبية.
    ملاحظة: تعتبر وسيلة النقل نفايات سريرية ويجب جمعها في حاوية نفايات تحمل علامة مناسبة في كمية مناسبة من محلول إزالة التلوث. بمجرد تطهير السائل كيميائيا ، يمكن التخلص منه وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للنفايات الخطرة.
  6. قم بإزالة أنسجة الورم باستخدام الملقط وضعه في طبق بتري معقم 90 مم (الشكل 2A). سجل وزن الأنسجة بالمغ أو الغرام على ورقة معالجة العينات السريرية وشبكة التشريح (الشكل 2B).
  7. قم بإزالة الأنسجة غير السرطانية (بما في ذلك الأنسجة الدهنية) والمناطق الميتة المرئية عيانا باستخدام ملقط معقم وشفرة مشرط يمكن التخلص منها مثبتة على مقبض المشرط (الشكل 2C). اغسل قطع الورم 1-2 مرات مع DPBS الباردة 1x. جمع قطع الورم ونقلها إلى طبق بتري جديد معقم 90 ملم.
    ملاحظة: نظرا لأن شفرات المشرط حادة، توخ الحذر عند التقطيع يدويا. يمكن تحديد الأنسجة الدهنية المجاورة للورم من خلال المناطق الناعمة والجيلاتينية والشاحبة المجاورة مباشرة لمحيط الورم البصري. تتطلب الأنسجة الدهنية العيانية ، والمناطق المظلمة التي تمثل مناطق النخر حكما شخصيا عند تشريح خزعة ورم المثانة الاستئصالية.
  8. التقط صورة فوتوغرافية وارسم رسما تخطيطيا للأنسجة وخطط لتشريح الأنسجة على شبكة معالجة سريرية (الشكل 2B والشكل 2C).
    ملاحظة: من المهم الاحتفاظ بسجل مرئي ورسم تقريبي لخصائص الورم العياني الفردية وتشريحها لكل حالة محددة.
  9. تشريح قطع أنسجة الورم وتخصيصها للأمراض النسيجية (الشكل 2D) والتحليلات الجزيئية (الشكل 2E).
    1. للتحليلات النسيجية: ضع ما يقرب من 50 ملغ من أنسجة الورم في كاسيت الأنسجة البلاستيكية التي يمكن التخلص منها (الشكل 2D). قم بغمر كاسيت الأنسجة في حاوية بحجم 5x إلى 10x من الفورمالين المخزن مؤقتا المحايد بنسبة 10٪ (NBF). احتضان بين عشية وضحاها في RT.
    2. إزالة 10٪ NBF واستبدالها ب 70٪ (ث / ث) الإيثانول في اليوم التالي للتخزين في 4 درجات مئوية حتى يمكن معالجة الأنسجة باستخدام بروتوكول معالجة الأنسجة الروتيني
    3. للتحليلات الجزيئية: قم بتجميد قطعة ورم واحدة على الأقل 1-3 مم3 في قطعة مبردة خالية من RNase / DNase 1.5 مل باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية (الشكل 2E).
  10. وزع 5 مل من الوسط العضوي (الجدول 1) في طبق بتري 90 مم الذي يحتوي على قطعة (قطع) الورم المتبقية.
  11. قم بفرم الأنسجة ميكانيكيا بأكبر قدر ممكن من الدقة (0.5-1 مم3 قطع أو أصغر) باستخدام شفرة مشرط معقمة # 10.
    ملاحظة: ستستغرق الشظايا الأكبر أو أجزاء كاملة من الأنسجة (>3 مم3) وقتا أطول بكثير للهضم وستقلل من صلاحية العينة. احذف الخطوة المذكورة أعلاه إذا كانت الأنسجة مصنفة وكانت الشظايا صغيرة بما يكفي للماصة بطرف ماصة مصلية 5 مل.
  12. انقل الأنسجة المفرومة ناعما إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وأضف 4 مل من الوسط العضوي ، و 1 مل من 10x كولاجيناز / هيالورونيداز ، و 0.1 مجم / مل ديوكسي ريبونوكلياز 1 (DNase 1) لتجنب تكتل الخلايا.
    ملاحظة: يجب تحضير محلول الإنزيم طازجا في كل مرة. زيادة حجم الوسط ليكون حوالي 10 أضعاف الكمية المرئية من شظايا الورم للعينات الكبيرة.
  13. احتضن نسيج الورم المفروم ومحلول الإنزيم لمدة 1-2 ساعة على شاكر مداري أو دوار (150 دورة في الدقيقة) في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لفصل الشظايا إلى تعليق خلوي وتحطيم الكولاجين. يمكن التحقق من ذلك من خلال التحليل النسيجي (الشكل 3A).
    ملاحظة: إذا كانت كمية الأنسجة كبيرة أو لم يلاحظ أي تفكك واضح بعد 1-1.5 ساعة ، فقم بزيادة وقت الحضانة للتحقق من مستوى التفكك كل 30 دقيقة. يعتمد توقيت هذه الخطوة على العينة ويجب تحديده تجريبيا في كل مرة. يشير الحل الأكثر وضوحا بشكل ملحوظ مع شظايا الأنسجة التي لا يمكن تمييزها للعين (أو عدد قليل جدا من الشظايا) إلى الهضم الناجح.
  14. إنهاء عملية الهضم بإضافة حجم 2x (20 مل) من الوسط القاعدي إلى العينة.
  15. قم بطرد العينة مركزيا بسرعة 261 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ، وقم بالشفط ، وتخلص من supernatant.
  16. لتحليل خلايا الدم الحمراء الملوثة (RBCs) ، أعد تعليق الكريات التي تم الحصول عليها من الخطوة المذكورة أعلاه في 5 مل من المخزن المؤقت للأمونيوم وكلوريد والبوتاسيوم (ACK). احتضن الأنبوب في RT لمدة 3 دقائق أو حتى يتم رؤية التحلل الكامل ل RBCs (يصبح التعليق واضحا).
    ملاحظة: إذا لم يتم ملاحظة كرات الدم الحمراء ككتلة حمراء صغيرة في الكرية، فقد يتم حذف هذه الخطوة.
  17. أضف 20 مل من الوسط القاعدي في الأنبوب. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 261 × g لمدة 5 دقائق في RT وشفط السوبرناتان.
  18. في هذه الخطوة ، ضع أليكوت 10 مل من وسط عضوي 2x و 1x في حمام مائي 37 درجة مئوية للتدفئة.
  19. قم بتصفية العينة من خلال مصفاة 100 ميكرومتر قابلة للعكس قبل الرطب في أنبوب جديد سعة 50 مل لإزالة المواد الكبيرة غير القابلة للذوبان.
    ملاحظة: قد تحتوي المواد الكبيرة غير المهضومة (>100 ميكرومتر) التي يجمعها المرشح على خلايا ذات أهمية ويمكن استزراعها في طبق بتري 90 مم أو صفيحة زراعة خلايا 6 آبار في وسط عضوي لاشتقاق مزارع ثنائية الأبعاد (الشكل 1 (الخطوة 5) والشكل 3B).
  20. قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة 37 ميكرومتر قابلة للعكس قبل الرطب لجمع الخلايا المفردة والمجموعات الصغيرة لعزل الخلايا الأحادية والخلايا المناعية (أنبوب 37-1; الشكل 1 (الخطوة 6) والشكل 3 باء).
    ملاحظة: يمكن زيادة إنتاجية الخلايا السرطانية خلال هذه الخطوة عن طريق تمرير تعليق الخلايا المفلترة عبر المصفاة مرة أخرى.
  21. عكس مصفاة 37 ميكرومتر واستخدام 10 مل من الوسائط القاعدية لجمع مجموعات صغيرة ومتوسطة الحجم (37-100 ميكرومتر) (أنبوب 70-1 ؛ الشكل 3 باء).
  22. قم بتعبئة كل من الأنابيب الجديدة سعة 50 مل (الأنابيب 70-1 و 37-1) باستخدام DPBS إلى 40 مل. قم بطرد مركزي للتعليق عند 261 × g لمدة 5 دقائق في RT. قم بشفط والتخلص من supernatant.
  23. أضف 10 مل من الوسائط القاعدية إلى الأنبوب 37-1 واحسب الخلايا باستخدام صبغة استبعاد التربان الزرقاء وعداد الخلايا الآلي (وفقا لمواصفات الشركة المصنعة). تحديد عدد الخلايا وصلاحية الخلايا.
  24. الطرد المركزي لبقية العينة عند 261 × g لمدة 5 دقائق في RT. استنشاق الوسط واستبدله بمحلول تجميد الخلايا أو الوسائط القاعدية التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
  25. ضع العينات في 1.5 مل من الكريوفيات وخزنها في حاوية لتجميد الخلايا. انقل الحاوية على الفور إلى ثلاجة -80 درجة مئوية للحصول على معدل تبريد مثالي. بعد تخزين الفريزر بين عشية وضحاها عند -80 درجة مئوية، انقل الكريوفيالات إلى سائل مبرد أو تخزين في مرحلة الهواء (-196 درجة مئوية) للتخزين على المدى الطويل.
  26. إعادة تعليق الخلايا من أنبوب 70-1 مع 500 ميكرولتر من وسط عضوي 2x مسخن مسبقا.
    ملاحظة: يجب أن تكون كثافة البذر عالية لنجاح الانتشار العضوي. يجب تغيير حجم الوسط العضوي ، وبالتالي BME ، تجريبيا على عدد الخلايا المعزولة من خطوة الترشيح. توفر هذه الخطوة نقطة انطلاق ذات صلة بناء على الدراسات التي أجريت في مختبرنا.
  27. أضف BME إلى الخلايا (بنسبة 1: 1 مع وسط عضوي 2x) مع أطراف ماصة مرشح معقمة P1000 باردة وتخلط بلطف لتعليق الخلايا. قم بسرعة وبعناية بماصة 100 ميكرولتر من الخلايا المعاد تشكيلها / خليط BME إلى آبار ذات لوحة مسطحة القاع ذات قاع مسطح منخفض للغاية من 96 بئرا. ضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 20-30 دقيقة للتصلب.
  28. أضف نسبة 1: 2 من 1x وسط عضوي فوق تعليق خلية BME اعتمادا على الحجم الذي تم تقييمه تجريبيا. في نقطة البداية ذات الصلة ، أضف 50 ميكرولتر من 1x وسائط متوسطة عضوية فوق 100 ميكرولتر من الخلايا المعاد تشكيلها / خليط BME.
  29. ضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 20 دقيقة لتحقيق التوازن.
  30. أخرج لوحة زراعة الخلايا من الحاضنة وقم بتجميعها على حامل عينة على مسرح المجهر. قم بتقييم المواد العضوية بصريا تحت تباين الطور أو إعدادات brightfield.
    ملاحظة: من الأفضل الحصول على الصور بواسطة مجهر تباين الطور المقلوب المجهز ببصريات التداخل التفاضلي (DIC) والكاميرا الرقمية والبرامج المرتبطة بها لمراقبة تكوين PDOs كروية استعدادا لتحليل نقطة النهاية.
    1. إذا كانت المجموعات المتميزة مرئية، ضع لوحة زراعة الخلايا في غرفة مجهر مسخنة إلكترونيا على خشبة المسرح (37 درجة مئوية، 5٪ CO2) لتصوير الخلايا الحية على مدار أول 24-72 ساعة.
    2. تأكد من توصيل طوق التسخين المرن بالعدسة لتقليل الانجراف الحراري وملء جهاز الترطيب ب dH2O.
    3. قم بإجراء التصوير الأولي باستخدام عدسة موضوعية 4x أو 10x (N.A. 0.30 ، W.D. 15.2 mm). الفاصل الزمني كل 5-10 دقائق على إعداد تباين الطور.
    4. تحقق من العزل الناجح كما يتميز بظهور >10 عضويات ذاتية التنظيم لكل بئر بعد فترة 24-72 ساعة.
    5. اسمح للمزارع بالاستمرار لمدة تصل إلى أسبوعين إذا كانت الأعداد العضوية منخفضة (الشكل 3C).
  31. قم بتعبئة الوسط كل 2-3 أيام باستخدام 50 ميكرولتر من الوسط العضوي المسخن مسبقا لتجديد عوامل النمو المستنفدة والحجم الكلي.
  32. احصل على صور (كما هو موضح في الخطوة 3.30) في الأيام 1 و2 و3 (سلسلة الفاصل الزمني)، وفي الأيام 5 و7 و10 قبل المرور (إن وجد).
    ملاحظة: عادة ما يتم تمرير المواد العضوية (التي يتم ملاحظتها كهياكل مستديرة بشكل عام حيث لا يمكنك رؤية حواف الخلايا الفردية) بعد 7-10 أيام من الإعداد ، اعتمادا على نجاح العزلة. قبل أو بعد المرور ، يمكن علاج المواد العضوية بالسموم الخلوية أو العوامل العلاجية لمدة تصل إلى 6 أيام وقياس الاستجابة الدوائية باستخدام اختبارات صلاحية الخلايا والسمية الخلوية. بدلا من ذلك ، يمكن استرداد المواد العضوية من BME (باستخدام 1 mg / mL dispase) والمحفوظة بالتجميد (المصارف الحيوية) ، أو إعدادها للاختبار الجزيئي ، أو تضمينها وتقييمها نسيجيا (الشكل 4).

النتائج

تم تأسيس 3D العضوية بنجاح من مريض سرطان المثانة البشري TURBT وأنسجة استئصال المثانة. باختصار ، تسلط هذه التقنية الضوء على التكوين السريع للهياكل متعددة الخلايا 3D التي هي قابلة للحياة ومناسبة لتحليلات نقطة النهاية الأخرى مثل التقييم النسيجي ، والتوصيف الجزيئي (عن طريق الكيمياء النسيجية المن?...

Discussion

في حين أن بروتوكولات 3D العضوية المشتقة من أنسجة سرطان المثانة لا تزال في مهدها ، فهي مجال للبحث النشط والتحقيق السريري. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول محسن لإنشاء PDOs لسرطان المثانة بنجاح والتي هي مناسبة لكل من عينات NMIBC و MIBC. يتكامل سير العمل هذا بالتوازي مع التجارب السريرية القائمة على المستشفي?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ونعرب عن تقديرنا للمساعدة التقنية التي يقدمها معهد البحوث الانتقالية لعلم الأنسجة الأساسي ومرفق الموارد البيولوجية. تم دعم هذا البحث بتمويل من جائزة مؤسسة الأميرة ألكسندرا للأبحاث (I.V., E.D.W.) ، وبرنامج ترجمة البحوث التطبيقية السريعة التابع لصندوق مستقبل البحوث الطبية (MRFF) (مركز التحليل الشخصي للسرطانات (CPAC; E.D.W., I.V.). ويتلقى معهد البحوث الانتقالية الدعم من الحكومة الأسترالية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.2 mL cryogenic vialCorning430487
1.5 mL Eppendorf tubesSigma-AldrichT9661-500EApolypropylene single-use tube
100 µM reversible strainerSTEMCELL Technologies#27270
100 mm Petri dishCorning430167
10x Collagenase/ HyaluronidaseSTEMCELL Technologies#07912
37 µM reversible strainerSTEMCELL Technologies#27250
37°C incubator
37°C water bath
50 mL falcon tubeCorningCLS430829-500EA
6-well plateCorningCLS3516
70% (w/w) ethanol
-80°C freezer
96 well ultra low attachment plate (Black)Sigma-AldrichCLS3474-24EA
A 83-01BioScientific2939Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β
ACK lysis bufferSTEMCELL Technologies#07850
adDMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634028Base medium
Animal-free recombinant EGFSigma-Aldrich518179Growth factor
Automated cell counter (TC20)Bio-rad1450102
B27 additiveGibco17504044Increases sphere-forming efficiency
Cell Counting SlidesBio-rad1450015
CentrifugeEppendorfEP022628188
Computer system
CryoStor CS10STEMCELL Technologies#07930Cell freezing solution
Dispase II, powderThermofisher17105041To enzymatically disrupt Matrigel
DNAse 1STEMCELL Technologies#07900
DPBSThermofisher14190144
Dry and wet ice
Esky
Farmdyne (Iodine 16g/L)Ecolab
Formalin solution, neutral buffered, 10%SigmaHT501128Histological tissue fixative
Glutamax (L-alanine-L-glutamine)Invitrogen35050061Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids
HEPESGibco15630-080All-purpose buffer
Histology cassetteProSciTechRCH44-W
Human FGF-10Peprotech100-26-25Growth factor
Human FGF-2Peprotech100-18B-50Growth factor
Liquid nitrogen
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)In Vitro Technologies356231Basement membrane extract (BME)
Mr. Frosty freezing containerThermoFisher5100-0001cell freezing container
N-acetyl-L-cysteine (NAC)SigmaA7250Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity
NicotinamideSigmaN0636-100GSIRT-1 inhibitor
NikonTs2U inverted microscopeNikonMFA510BB
NIS-Elements Advanced ResearchNikonMQS31000
Noggin conditioned mediaIn-houseBMP inhibitor
Pipetboy acu 2Integra155000
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips
PrimocinJomar Bioscienceant-pm2Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations
Prostaglandin E2 (PGE2)Tocris2296support proliferation of cells
Rotary tube mixerRatekRSM7DC
R-spondin 1 conditioned mediaIn-houseWNT signalling regulator
SB202190Jomar Biosciences1077-25mgSelective p38 MAP kinase inhibitor
Scale
Scalpel handleLivingstoneWBLDHDL03
Scalpels, #11 bladeMedical and Surgical RequisitesEU-211-1
Serological pipettes (5, 10, 25 mL)
Specimen Waste BagsMedical SearchSU09125X16
Urine specimen jar
Y27632Jomar Biosciences1049-10mgSelective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells

References

  1. Saginala, K., et al. Epidemiology of bladder cancer. Medical Sciences. 8 (1), 15 (2020).
  2. Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
  3. Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
  4. Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
  5. Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
  6. Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
  7. Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
  8. Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
  9. lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
  10. Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
  11. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  12. Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
  13. Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
  14. Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
  15. Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
  16. Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
  17. Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
  18. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  19. Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
  20. Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
  21. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
  22. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  23. Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
  24. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  25. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  26. Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
  27. Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
  28. Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
  29. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
  30. Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
  31. Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
  32. Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
  33. Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
  34. Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved