تصور وقياس المركبات الصيدلانية داخل الجلد باستخدام التصوير المتماسك لتشتت رامان

Summary

يتم وصف منهجية تصوير رامان المتناثرة المتماسكة لتصور وقياس المركبات الصيدلانية داخل الجلد. تصف هذه الورقة إعداد أنسجة الجلد (الإنسان والفأر) وتطبيق التركيبة الموضعية ، والحصول على الصور لتحديد ملامح التركيز الزماني المكاني ، والتحليل الدوائي الأولي لتقييم توصيل الأدوية الموضعية.

Abstract

كانت الحرائك الدوائية الجلدية (cPK) بعد تطبيق التركيبة الموضعية مجالا بحثيا ذا أهمية خاصة للعلماء التنظيميين وتطوير الأدوية لفهم التوافر البيولوجي الموضعي (BA) ميكانيكيا. التقنيات شبه الغازية ، مثل تجريد الشريط ، أو غسيل الكلى المجهري الجلدي ، أو التروية الدقيقة الجلدية مفتوحة التدفق ، كلها تحدد كمية cPK على نطاق كبير. في حين أن هذه التقنيات قد وفرت معرفة واسعة ب cPK ، إلا أن المجتمع يفتقر إلى فهم ميكانيكي لاختراق المكونات الصيدلانية النشطة (API) ونفاذيتها على المستوى الخلوي.

أحد الأساليب غير الباضعة لمعالجة cPK المجهري هو تصوير رامان المتماسك (CRI) ، والذي يستهدف بشكل انتقائي الاهتزازات الجزيئية الجوهرية دون الحاجة إلى ملصقات خارجية أو تعديل كيميائي. لدى CRI طريقتان رئيسيتان - تشتت رامان المضاد ل Stokes (CARS) وتشتت Raman المحفز (SRS) - اللذان يمكنان من تحديد كمي حساس وانتقائي لواجهات برمجة التطبيقات أو المكونات غير النشطة. يستخدم CARS عادة لاشتقاق معلومات الجلد الهيكلية أو تصور التباين الكيميائي. في المقابل ، يتم استخدام إشارة SRS ، وهي خطية ذات تركيز جزيئي ، لتحديد واجهات برمجة التطبيقات أو المكونات غير النشطة داخل طبقات الجلد.

على الرغم من أن أنسجة الفئران قد استخدمت عادة ل cPK مع CRI ، إلا أنه يجب في نهاية المطاف تقييم BA الموضعي والتكافؤ الحيوي (BE) في الأنسجة البشرية قبل الموافقة التنظيمية. تقدم هذه الورقة منهجية لإعداد وتصوير الجلد خارج الجسم الحي لاستخدامها في دراسات CRI الحركية الدوائية الكمية في تقييم BA و BE الموضعية. تتيح هذه المنهجية تحديد كمية API الموثوقة والقابلة للتكرار داخل جلد الإنسان والفأر بمرور الوقت. يتم تحديد التركيزات داخل المقصورات الغنية بالدهون والفقيرة بالدهون ، وكذلك تركيز API الكلي بمرور الوقت ؛ وتستخدم هذه لتقديرات بكالوريوس الجزئي والكلي، وربما BE.

Introduction

وقد توسعت منهجيات تقييم cPK بعد تطبيق منتج الدواء الموضعي من الدراسات الكلاسيكية لاختبار النفاذية في المختبر (IVPT)¹،²،³،⁴،⁵ وتجريد الشريط⁶،^7،8 إلى منهجيات إضافية مثل التروية الدقيقة مفتوحة التدفق أو غسيل الكلى المجهري الجلدي⁹،¹⁰،^{11 ، 12,13,14}. من المحتمل أن تكون هناك مواقع محلية مختلفة للعمل العلاجي اعتمادا على المرض محل الاهتمام. وبالتالي ، قد يكون هناك عدد مماثل من المنهجيات لتقييم معدل ومدى وصول واجهة برمجة التطبيقات إلى موقع العمل المحلي المقصود. في حين أن كل منهجية من المنهجيات المذكورة أعلاه لها مزاياها ، فإن العيب الرئيسي هو عدم وجود معلومات cPK على نطاق دقيق (أي عدم القدرة على تصور أين تذهب واجهة برمجة التطبيقات وكيف تتغلغل).

إحدى المنهجيات غير الباضعة التي تهم تقدير BA و BE الموضعية هي CRI ، والتي يمكن تقسيمها إلى طريقتين للتصوير: CARS و SRS microscopy. تتيح طرق رامان المتماسكة هذه تصويرا كيميائيا محددا للجزيئات عبر تأثيرات رامان غير الخطية. في CRI ، يتم تركيز اثنين من قطارات نبض الليزر ومسحها ضوئيا داخل عينة. يتم تعيين الفرق في الطاقة بين ترددات الليزر لاستهداف أوضاع الاهتزاز الخاصة بالهياكل الكيميائية ذات الاهتمام. نظرا لأن عمليات CRI غير خطية ، يتم إنشاء إشارة فقط عند تركيز المجهر ، مما يسمح بالتصوير المقطعي الدوائي ثلاثي الأبعاد للأنسجة. في سياق cPK ، تم استخدام CARS للحصول على معلومات هيكلية للأنسجة ، مثل موقع هياكل الجلد الغنية بالدهون¹⁵. في المقابل ، تم استخدام SRS لتحديد التركيز الجزيئي كميا لأن إشارته خطية مع تركيز. بالنسبة لعينات الجلد خارج الجسم الحي ، من المفيد تنفيذ CARS في الاتجاه epi-direction¹⁶ و SRS في وضع الإرسال¹⁷. لذلك ، فإن عينات الأنسجة الرقيقة ستسمح باكتشاف إشارة SRS وتحديدها كميا.

كنسيج نموذجي ، تقدم أذن الفأر العارية العديد من المزايا مع عيوب طفيفة. إحدى المزايا هي أن الأنسجة هي بالفعل ~ 200-300 ميكرومتر في السمك ولا تتطلب المزيد من إعداد العينات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم رؤية العديد من الطبقات الجلدية من خلال التركيز المحوري من خلال مجال رؤية واحد (على سبيل المثال ، الطبقة القرنية ، الغدد الدهنية (SGs) ، الخلايا الشحمية ، والدهون تحت الجلد) ^16،18. وهذا يسمح بالتقدير الأولي قبل السريري لمسارات النفاذية الجلدية وتقديرات BA الموضعية قبل الانتقال إلى عينات الجلد البشري. ومع ذلك ، فإن نموذج الماوس العاري يقدم قيودا مثل صعوبة الاستقراء إلى سيناريوهات في الجسم الحي بسبب الاختلافات في بنية الجلد¹⁹. في حين أن أذن الفأر العارية هي نموذج ممتاز للحصول على نتائج أولية ، فإن نموذج الجلد البشري هو المعيار الذهبي. على الرغم من وجود العديد من التعليقات حول مدى ملاءمة وقابلية تطبيق الجلد البشري المتجمد لتلخيص حركية نفاذية الجسم الحي بدقة 20،²¹،²² ، فإن استخدام الجلد البشري المتجمد هو طريقة مقبولة لتقييم حركية نفاذية API في المختبر ²³،^24،25 . يتصور هذا البروتوكول طبقات الجلد المختلفة في جلد الفأر والإنسان مع تحديد تركيزات API داخل الهياكل الغنية بالدهون والفقيرة بالدهون.

في حين تم استخدام CRI عبر العديد من المجالات لتصور المركبات داخل الأنسجة على وجه التحديد ، كانت هناك جهود محدودة للتحقيق في cPK للمنتجات الدوائية المطبقة موضعيا. لتقييم BA/BE الموضعي للمنتجات الموضعية باستخدام CRI، من الضروري أولا وجود بروتوكول موحد لإجراء مقارنات دقيقة. وقد أظهرت الجهود السابقة باستخدام CRI لتوصيل الأدوية إلى الجلد تباينا داخل البيانات. نظرا لأن هذا تطبيق جديد نسبيا ل CRI ، فإن إنشاء بروتوكول أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج موثوقة¹⁸،^26،27. يستهدف هذا النهج رقما موجيا محددا واحدا فقط في المنطقة الصامتة بيولوجيا من طيف رامان. ومع ذلك ، فإن معظم واجهات برمجة التطبيقات والمكونات غير النشطة لها تحولات رامان داخل منطقة بصمات الأصابع. وقد شكل هذا في السابق تحديات بسبب الإشارة المتأصلة الناشئة عن الأنسجة في منطقة بصمات الأصابع. وقد أزالت التطورات الحديثة في الليزر والحوسبة هذا الحاجز ، والذي يمكن استخدامه أيضا بالاقتران مع النهج المعروض هنا²⁸. يسمح هذا النهج المعروض هنا بالتحديد الكمي لواجهة برمجة التطبيقات ، والتي لديها تحول رامان في المنطقة الصامتة (2000-2300 سم ^{- 1}). هذا لا يقتصر على الخصائص الفيزيائية الكيميائية للدواء ، والتي قد يكون هذا هو الحال بالنسبة لبعض منهجيات مراقبة cPK المذكورة سابقا²⁹.

يجب أن يقلل البروتوكول من التباين من عينة إلى عينة في سمك الجلد لمختلف المستحضرات ، حيث أن عينات الجلد البشري السميك ستنتج الحد الأدنى من الإشارة بعد تطبيق منتج الدواء بسبب تشتت الضوء بواسطة العينة السميكة. الهدف من هذه المخطوطة هو تقديم منهجية لإعداد الأنسجة تضمن معايير التصوير القابلة للتكرار. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إعداد نظام CRI كما هو موضح لتقليل مصادر الخطأ المحتملة وكذلك تقليل الإشارة إلى الضوضاء. ومع ذلك ، لن تناقش هذه الورقة المبادئ التوجيهية والمزايا التقنية لمجهر CRI حيث تم تغطية ذلك سابقا³⁰. وأخيرا، يتم استكشاف إجراء تحليل البيانات الشامل للسماح بتفسير النتائج لتحديد نجاح التجربة أو فشلها.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام أنسجة أذن الفئران العارية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مستشفى ماساتشوستس العام (IACUC) ، في حين تمت الموافقة على استخدام أنسجة الجلد البشري من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى ماساتشوستس العام (IRB). وفقا لبروتوكولات IACUC ، تم الحصول على الفئران الرحيمة الطازجة من المتعاونين مع مستعمرات الفئران العارية. تم شراء الأنسجة البشرية من إجراءات شد البطن الاختيارية في مستشفى ماساتشوستس العام عبر بروتوكول معتمد. بالإضافة إلى ذلك ، تم الحصول على أنواع محددة من الأنسجة بخلاف جلد البطن عن طريق سلطة التبرع بالجسم ، وأيضا من خلال بروتوكول معتمد من IRB.

1. إعداد الأنسجة

1. إعداد أنسجة جلد أذن الفأر عارية
   1. بعد الحصول على أجسام الفئران العارية التي تم حصادها حديثا ، قم بإزالة الأذنين باستخدام الملقط والمقص المجهري. ضع أذنا واحدة في طبق بتري صغير (أي 35 مم × 10 مم). ضع جسم الفأر العاري في كيس خطر بيولوجي للتخلص منه وفقا لبروتوكولات IACUC المحلية.
   2. اشطف كل أذن ماوس بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وجففه بلطف باستخدام ممسحة المهام. كرر مرتين لإزالة أي أوساخ أو حطام متبقي على الأذن قد يؤثر على جودة التصوير (انظر الشكل 1).
   3. إذا كان من المقرر استخدام الأذن في غضون 24 ساعة ، فضعها في طبق بتري صغير (أي 35 مم × 10 مم) مع PBS طازج في الثلاجة (2-8 درجة مئوية). إذا تم استخدام الأذن بعد 24 ساعة من الحصاد ، فضعها في طبق بتري (35 مم × 10 مم) بدون PBS ، وقم بتغطية الطبق بالبارافيلم ، وضعه في ثلاجة -20 درجة مئوية.
2. تحضير أنسجة الجلد البشري
   1. بعد شراء الأنسجة البشرية ، ضعها في طبق بتري كبير (أي 60 مم × 15 مم) في غطاء بيولوجي للسماح بمساحة كافية لإعداد العينة.
   2. ضع جانب الطبقة القرنية متجها لأسفل بحيث يمكن الوصول إلى الدهون تحت الجلد.
   3. باستخدام الملقط والمقص المجهري ، ابدأ في إزالة الدهون تحت الجلد بعناية. بمجرد أن لا يمكن إزالة الدهون تحت الجلد باستخدام المقص ، قم بالتبديل إلى مشرط يمكن التخلص منه من 10 شفرات (أو ما يعادله) لإزالة الدهون المتبقية تحت الجلد. استخدم المشرط بزاوية 45 درجة على الجلد مع إبقاء الجلد ثابتا بالملقط (انظر الشكل 1).
      ملاحظة: للحصول على صور SRS عالية الجودة للإرسال، يجب أن تكون العينات رقيقة قدر الإمكان دون ثقبها.

الشكل 1: صور ذات سمك مثالي لتصوير جلد الفأر والإنسان . (أ) جلد أذن الفأر يحمل الضوء ، والذي يمكن أن يسمح للضوء بالمرور بشكل واضح. (ب) بشرة الإنسان المثالية التي تحمل الضوء بعد التحضير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. قسم جلد الإنسان إلى قطع 1 سم × 1 سم.
   ملاحظة: يمكن استخدام البشرة المنعشة لمدة تصل إلى 24 ساعة دون استخدام سرير هلام الأغاروز ، كما هو موضح سابقا³¹. ومع ذلك ، يمكن استخدام البشرة النضرة لفترة أطول إذا تم الاحتفاظ بها على سرير جل الأغاروز. إذا كان سيتم استخدام الجلد لاحقا ، يتم وضع الجلد في كيس نقل العينات ثم وضعه في ثلاجة -20 درجة مئوية. يجب إذابة الجلد المجمد باستخدام الإجراء أدناه للحصول على أفضل النتائج (انظر الخطوة 3.1.2).

2. إعداد الليزر والمجهر

1. قبل حوالي 30 دقيقة من التصوير ، قم بتشغيل الليزر فائق السرعة القابل للضبط على نطاق واسع (يشار إليه فيما يلي باسم الليزر) واسمح له بالإحماء. تمكين نظام إشارة / قفل التحذير بالليزر من إخطار الموظفين خارج المخاطر المحتملة عند الدخول.
   ملاحظة: يجب دائما ارتداء النظارات المناسبة عند العمل مع ليزر الفئة الرابعة. بالنسبة لليزر المحدد المستخدم هنا ، فإن النظارات المناسبة الموصى بها هي OD ≥ 6 لنطاق عمل الليزر 800-1300 نانومتر.
2. أثناء تسخين الليزر ، قم بتمكين الأجهزة المتبقية للتحكم في المجهر واكتشاف CARS واكتشاف SRS.
3. محاذاة المجهر بشكل صحيح لضمان التصوير الأمثل. في نافذة التحكم في الحصول على الصور في برنامج التحكم في المجهر (فيما يلي برنامج MC) ، انقر فوق مصباح الإرسال للسماح للضوء بالقدوم من مصباح الإضاءة المجهري.
4. تأكد من إضاءة كوهلر الصحيحة لمحاذاة المجهر على طول المحور الرأسي: أغلق القزحية لأسفل حتى يتم رؤية الحد الأدنى من الضوء من خلال قطعة العين³².
5. أثناء النظر من خلال العدسة ، افتح القزحية لمعرفة ما إذا كان المضلع يلمس جميع الجوانب في وقت واحد. اضبط ارتفاع المكثف إذا تعذر رؤية شكل مضلع قبل فتح القزحية.
6. إذا لم يلمس شكل المضلع جميع الجوانب في نفس الوقت، فاضبط موضع محاذاة الفتحة باستخدام مقابض الضبط.
   ملاحظة: انظر Sanderson et ^al.33 للحصول على إعداد مجهري متعمق.
7. ضع شريحة مجهرية مع غطاء وفاصل لاصق على الوجهين يحتوي على عينة زيت (على سبيل المثال ، زيت الزيتون ، حيث يوجد العديد من الروابط -CH₂- داخل الزيوت) على حامل مرحلة المجهر.
8. في نافذة إعدادات الاستحواذ في برنامج MC ، ابحث عن القائمة المنسدلة للمجهر واضبط هدف المجهر على 20x.
9. تحقق من أن مرشح الكشف عن CARS (645 نانومتر / 50 نانومتر) في وضع يمكنه من تصور وقياس إشارة epiCARS على طول أنبوب المضاعف الضوئي لمنفذ المجهر الجانبي.
   ملاحظة: يتم اختيار هذا المرشح المحدد لتصوير الدهون كإشارة مضادة ل Stokes CARS يتم إنشاؤها عند 652 نانومتر لطول موجي للمضخة يبلغ 803 نانومتر وطول موجة ستوكس يبلغ 1040 نانومتر (انظر Eq. (1)).
   (1)
   حيث تحتوي المتغيرات λ على وحدات نانومترية ؛ مضخة_{λ هي الطول} الموجي لشعاع المضخة. و λ ستوكس هو الطول الموجي لشعاع_ستوكس .
10. انظر من خلال العدسة للعثور على حافة عينة الزيت ، والتي سيتم استخدامها للتحقق من محاذاة النظام.
11. تأكد من أن الحافة في التركيز البؤري Z باستخدام مقابض التركيز البؤري على المجهر واضبط وحدة التحكم في المرحلة للحصول على تركيز XY.
12. بعد تسخين الليزر ، اضبط شعاع المضخة على 803 نانومتر مع ضبط ضبط المحرك الدقيق على 50.0 في واجهة المستخدم الرسومية لليزر. قد يختلف ضبط دقة المحرك الدقيق المستخدم من إعداد إلى آخر.
    ملاحظة: شعاع المضخة هو الشعاع الوحيد الذي له طول موجي قابل للتعديل على هذا الليزر حيث يتم تثبيت الطول الموجي لشعاع ستوكس عند 1040 نانومتر. يستهدف هذا التكوين اهتزاز CH عند 2850 ^سم-1 (انظر Eq. (2) لحساب الطول الموجي للمضخة لاستهداف الرقم الموجي).
    (2)
    حيث يحتوي على وحدات من العدد الموجي النسبي (cm⁻¹) ، ومتغيرات λ لها وحدات بالسنتيمتر.
13. تحقق من محاذاة الليزر في المجهر قبل التصوير ؛ انظر الشكل 2 لتصوير مسار الليزر. أثناء الإعداد الأولي للمجهر ، قم بتثبيت قزحية العين في مسار الشعاع كأدلة للمحاذاة الصحيحة في المجهر. نظرا لأن المسار البصري لليزر يمكن أن ينجرف بمرور الوقت ، تأكد من أن مسارات شعاع الليزر تجتاز مركز القزحية بحيث تدخل المجهر بشكل صحيح.
14. باستخدام عارض الأشعة تحت الحمراء ، أغلق جميع القزحية تماما وتأكد من أن الشعاع يتمركز على حد سواء: أولا على القزحية الأقرب إلى الليزر وأخيرا في منفذ دخول المجهر.
15. أولا ، تحقق من شعاع المضخة للتأكد من أن الشعاع يذهب إلى المجهر بشكل مستقيم. بمجرد محاذاة المضخة ، تحقق للتأكد من أن شعاع ستوكس يذهب أيضا إلى المجهر بشكل صحيح.
    1. إذا لم تتم محاذاة الحزم من خلال القزحية ، فقم بالسير بشكل متكرر الحزم عبر القزحية باستخدام مقابض الضبط x و y لاثنين من حوامل المرآة للمضخة ومسارات الحزم ستوكس.
16. بمجرد أن تتداخل بقع الحزم قبل دخول المجهر ، تحقق للتأكد من أنها تجتاز المجهر بشكل صحيح.
    1. في نافذة التحكم في اكتساب الصور الخاصة ببرنامج MC، انقر فوق قناة TD للإرسال، وALG1 (القناة التناظرية 1) لقناة Raman المتماسكة المضادة لستوكس، وALG2 (القناة التناظرية 2) لقناة تشتت Raman المحفزة. استخدم الإعدادات التالية (كما هو الحال في هذا البروتوكول): كسب 1 وإزاحة -1 ل ALG1 ، كسب 1.25 وإزاحة -2 ل ALG2.
       ملاحظة: اعتمادا على تكوين النظام، قد يكون للقنوات التناظرية ترقيم مختلف لقنوات التصوير الفردية. إذا كان كاشف SRS في مكانه ، فلن تكون هناك إشارة إرسال حيث لا يمكن لأي ضوء المرور (أي أنه لا يمكن للمرء تصور الصور باستخدام TD و ALG2 في وقت واحد في هذا الإعداد).

الشكل 2: التخطيط التخطيطي لمسار التصوير بالليزر رامان المتماسك. يتم تكييف الحزم بشكل مستقل لحجم البقعة ومطابقتها عبر مرحلة تأخير الوقت لتوليد تشتت رامان متماسك في العينات لتردد الضبط المطلوب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

17. قم بتشغيل عداد الطاقة ، وباستخدام مستشعر طاقة حرارية عالي الطاقة ، قم بقياس قوة المضخة وحزم Stokes بشكل فردي للتجربة.
    ملاحظة: في هذا المثال المحدد، كانت طاقة شعاع المضخة 80 ميجاوات، بينما كانت طاقة شعاع ستوكس 180 ميجاوات قبل دخول المجهر.
18. في نافذة التحكم في الحصول على الصور ، انقر فوق الزر Focus x2 لعرض الصورة في برنامج MC.
19. في نافذة إعدادات الاستحواذ ، تأكد من تعيين نسبة البكسل ووقت الإقامة على المعلمات المطلوبة للتجربة.
    ملاحظة: تم استخدام نسبة 1,024 × 1,024 بكسل ووقت سكن قدره 2 ميكروثانية/بكسل في هذا البروتوكول.
20. تأكد من محاذاة الليزر فيما يتعلق بالمجهر عن طريق إلغاء حجب شعاع المضخة والنظر إلى قناة TD .
    ملاحظة: تتم محاذاة الليزر بشكل صحيح إذا شوهد الشعاع متمركزا في الصورة باستخدام إعدادات الكاشف الصحيحة.
21. وإلا، استخدم مقابض ضبط X وY على المنظار لتغيير موضع الشعاع إلى مركز الصورة.
22. تأكد من محاذاة الليزر والمجهر من خلال رؤية نفس الصورة في كل من قناتي CARS و SRS.
23. للحصول على صورة المحاذاة، انقر فوق زر المسح الضوئي XY في نافذة التحكم في اكتساب الصورة مع مجموعة وضع المرشح المناسبة (على سبيل المثال، Kalman Line 3).
24. احفظ هذه المجموعة من الصور باسم ملف وصفي لمقارنته بمرور الوقت وتأكيد أداء / محاذاة النظام.

3. تصوير الدهون

1. أذن الفأر والأنسجة البشرية
   1. في حالة استخدام أنسجة جديدة، تخطى الخطوة 3.1.2.
   2. قم بإزالة جلد أذن الماوس من الفريزر -20 درجة مئوية وضعه في غرفة حضانة (32 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق. قم بإزالة أذن الماوس من غرفة الحضانة.
      ملاحظة: راجع الخطوة 1.1.2. لإعداد جلد أذن الماوس. يمكن أن يؤدي التعامل الخشن أو كشط الأنسجة إلى تدهور ميكانيكي أو تدمير أو تعطيل الأنسجة ، وخاصة الطبقة القرنية.
   3. إذا كنت تستخدم أذن ماوس عارية ، فضع الجزء الأمامي من الأذن المواجه للقاع الزجاجي لطبق 35 مم رقم 0. إذا كنت تستخدم جلد الإنسان ، ضعه مع الطبقة القرنية وجها لأسفل لأن هذا سيسمح بتحديد كمية الدواء من الطبقات السطحية إلى الطبقات العميقة (الشكل 1).
      ملاحظة: الجزء الخلفي من أذن الفأر العارية أكثر عرضة للعيوب من السكن. إذا لم يتم وضع جلد الإنسان مع جانب الطبقة القرنية المواجه لأسفل على المجهر المقلوب ، فلن يتمكن المرء من رؤية ما وراء الأدمة حيث توجد كمية لا بأس بها من الضوء المبعثر ، ولا يمكن رؤية الدواء الذي يتخلل الطبقة القرنية.
   4. بمجرد تركيز الأنسجة على القاع الزجاجي ، استخدم قضيب ذو رأس قطني للتأكد من أن الجلد مسطح وملامسة تماما لسطح الغطاء في الطبق ذي القاع الزجاجي.
      ملاحظة: هذه خطوة يمكن أن تسبب صعوبة أثناء تصوير الجلد إذا لم يكن مسطحا تماما.
   5. ضع غسالة على الجزء العلوي من الجلد لمنع أي حركة أثناء التصوير. تأكد من أن الأنسجة مرئية من خلال الفتحة المركزية للغسالة للكشف عن انتقال SRS.
   6. قم بإزالة إدراج مرحلة الشريحة واستبدله بغرفة الحضانة ، التي تحتوي على إدراج طبق واحد.
   7. ضع الطبق ذو القاع الزجاجي مع أنسجة الجلد في ملحق الطبق الواحد لغرفة الحضانة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم صفيحة من 6 آبار لتصوير عينات وتركيبات جلدية متعددة في وقت واحد.
   8. قلل نسبة البكسل في نافذة إعدادات الاكتساب الخاصة ببرنامج MC (على سبيل المثال، من 1,024 × 1,024 إلى 512 × 512) للحصول على سرعة مسح غالفو أسرع بينما يتم تغيير عمق Z للعثور على الطبقة القرنية (انظر الشكل 3A للماوس أو الشكل 3E للإنسان).
   9. بعد العثور على الطبقة القرنية، سجل هذا الموضع المحوري ليكون موضع الصفر في نافذة إعدادات الاكتساب وقم بتغيير نسبة البكسل لكل تجربة محددة (على سبيل المثال، 1,024 × 1,024).

الشكل 3: مثال على أعماق الجلد التي تم الحصول عليها باستخدام SRS. المجموعة العليا من الصور هي من جلد أذن الفأر عارية تصور ما يلي: (أ) الطبقة القرنية ، (ب) الغدد الدهنية ، (ج) الخلايا الشحمية ، (د) الدهون تحت الجلد. يتم الحصول على المجموعة السفلية من الصور من جلد الإنسان التي تصور ما يلي: (E) الطبقة القرنية ، (F) الأدمة الحليمية ، و (G) الغدة الدهنية. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. تم الحصول على كل من صور الماوس وجلد الإنسان باستخدام هدف 20x عند 1024 بكسل × 1024 بكسل. تم أخذ SG البشري في 512 × 512 بكسل. الاختصارات: SRS = تحفيز تشتت رامان. SG = الغدة الدهنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تطبيق الصياغة الموضعية

1. ماصة جرعة التركيبة المحددة مسبقا على الجلد (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر / سم²).
   ملاحظة: ستلعب لزوجة التركيبة دورا في اختيار الماصة. يوصى باستخدام ماصة إزاحة إيجابية للتركيبات اللزجة ، مثل الكريمات أو المواد الهلامية ، وماصة إزاحة الهواء للحلول. في هذه التجربة ، كان روكسوليتينيب هو المركب النموذجي في محلول بسيط من البروبيلين غليكول (البروبان-1,2-ديول).
2. باستخدام طرف المكبس من حقنة ، أو إصبع قفاز ، افرك التركيبة في حركة في اتجاه عقارب الساعة لمدة 30 ثانية. لاحظ الوقت الذي يتم فيه تطبيق الصيغة لتحليل cPK لاحقا (انظر الخطوات 6.15-6.17 أدناه).
   ملاحظة: تعتمد مدة التطبيق على التجربة؛ كل واحد قد يكون مختلفا.
3. بعد انقضاء الوقت المخصص لتخلل التركيبة ، قم بإزالة التركيبة الزائدة ووضع الجلد مع جانب التركيبة المواجه للطبق ذي القاع الزجاجي.
   ملاحظة: تتم إزالة التركيبة باستخدام ممسحة مهام حساسة أو ممسحة صغيرة مطبوعة 3-D (~ 1 بوصة) في اتجاه واحد (على سبيل المثال، من الشمال إلى الجنوب).

5. الإعداد التجريبي لتحديد كمية الدواء

1. اضبط شعاع المضخة على 803 نانومتر. تحقق من قوة المضخة وشعاع ستوكس باستخدام الصمام الثنائي الضوئي للتأكد من أنها القوى المطلوبة للتجربة. قم بإلغاء حظر كل شعاع على حدة لقياس الطاقة وإعادة حظر الحزم.
   ملاحظة: في هذا المثال المحدد، كانت طاقة شعاع المضخة 100 ميجاوات، بينما كانت طاقة شعاع ستوكس 180 ميجاوات.
2. ضع الطبق ذو القاع الزجاجي في غرفة حضانة مع إدراج لطبق واحد من أسفل الزجاج. قم بتأمين الطبق بمشابك لمنع الحركة أثناء التصوير.
3. قم بتشغيل مصباح الإرسال في برنامج MC. بالنظر إلى العدسة ، اضبط التركيز البؤري المحوري باستخدام مقبض الضبط للتأكد من أن الأنسجة ضمن نطاق التركيز البؤري.
4. قم بإلغاء حظر كل من المضخة وعوارض ستوكس. تأكد من تمكين قناتي ALG1 وALG2 ثم انقر فوق التركيز x2 على برنامج MC لتصور الجلد في قناتي CARS وSRS. تأكد من أن الصمام الثنائي الضوئي SRS في موضعه فوق المكثف.
5. في القائمة المنسدلة الجهاز، انقر فوق الفاصل الزمني متعدد المناطق (MATL). ابحث عن تحذير مرحلة XY ليظهر ؛ عندما تتحرك المرحلة للعثور على أصلها الميكانيكي، انقر فوق موافق.
6. في الوحدة النمطية MATL، انتقل إلى عرض ثم انقر فوق قائمة النقاط المسجلة داخل برنامج MC. ابدأ في إضافة إما 1) أعماق محددة داخل الجلد (أي الطبقة القرنية ، SGs ، الخلايا الشحمية ، الدهون تحت الجلد كما هو محدد أثناء التصوير الحي مع تباين مضبوط بالدهون) أو 2) مواضع XY إذا كان سيتم أخذ مكدسات عمق كاملة. انظر الشكل 3 للحصول على أمثلة.
   1. بمجرد تحديد الطبقة القرنية ، قم بالتمرير عبر التركيز المحوري (أو z-focus) لتحديد طبقات الأنسجة المحددة المذكورة أعلاه. انظر الشكل 3 للحصول على أمثلة داخل جلد الإنسان والفأر.
   2. في حالة تصوير أعماق محددة بدلا من مكدسات عمق Z الكاملة ، لكل تقسيم طبقي للجلد ، انقر فوق تسجيل نقطة لإضافتها إلى قائمة انتظار MATL. بالنسبة إلى المكدسات كاملة العمق، انقر فوق تسجيل نقطة لكل موضع XY مع تحديد العمق في نافذة معلمات الاستحواذ .
   3. بمجرد تسجيل جميع مواضع XY (مكدسات عمق Z الكاملة) أو XYZ (طبقات جلدية محددة) المطلوبة داخل برنامج MATL ، قم بتغيير دليل الملف واسمه بطريقة تكون متسقة طوال التجارب لتحليلات الصور و cPK (انظر الخطوات 6.15 - 6.17).
7. اضبط عدد التكرارات على 1 في الوحدة النمطية MATL وانقر فوق جاهز. انتظر حتى يتغير Play من سهم رمادي إلى سهم أسود، مما يشير إلى أن البرنامج جاهز. اضغط على تشغيل لبدء تصوير مكدس الدهون الأولي (يشار إليه فيما يلي باسم صور الدهون).
   ملاحظة: سيتم استخدام هذا لفصل المناطق الغنية بالدهون والفقيرة بالدهون من التقسيمات الطبقية للأنسجة الفردية أثناء التحليل. يشار إلى الدورة والوقت الإجمالي في أسفل يمين قائمة النقاط المسجلة.
8. بمجرد اكتمال الدورة ، قم بحظر كل من المضخة وعوارض ستوكس. قم بتغيير الطول الموجي على واجهة المستخدم الرسومية بالليزر إلى الطول الموجي المطلوب بناء على الرقم الموجي المستهدف أو اهتزاز رامان.
   ملاحظة: على سبيل المثال، يتم استخدام 843 نانومتر لشعاع المضخة لاستهداف 2250 ^سم-1 باستخدام Eq. (2)، ويتم تغيير الضبط الدقيق للمحرك إلى 50.1. يحتوي الدواء المثال المعروض هنا ، ruxolitinib ، على نتريل يمكن استهدافه ب 2250 سم ^{- 1}. سيكون الرقم الموجي المستهدف لبنية الجلد هو نفسه دائما (2,850 ^cm-1) ؛ ومع ذلك ، يمكن أن يكون الرقم الموجي لواجهة برمجة التطبيقات أي رقم موجي ولكن يجب أن يكون معروفا أو محسوبا مسبقا.
9. اضبط مرحلة تأخير الوقت اليدوي (الشكل 2) لضمان التداخل في الوقت المناسب للطول الموجي الجديد وطاقة شعاع المضخة. تأكد من استخدام نفس الصلاحيات لكل من تصوير الدهون وواجهة برمجة التطبيقات ، والتي يتم إنشاؤها مسبقا.
10. استخدم المدة لكل دورة لحساب إجمالي عدد مرات التكرار المطلوبة لكل تجربة. ما عليك سوى تقسيم إجمالي الوقت المطلوب للتجربة على مدة الدورة.
    ملاحظة: مدة الدورة هي دالة لحجم الصورة، ووقت بقاء البكسل، ومتوسط كالمان، وعدد الصور لكل دورة. سيؤدي تحسين هذه المعلمات إلى تقصير وقت الدورة ، وبالتالي زيادة الدقة الزمنية.
11. بمجرد اختيار العدد الإجمالي لتكرار الدورة ، قم بإلغاء حظر شعاع المضخة ، وتحقق من الطاقة باستخدام الصمام الثنائي الضوئي ، وتأكد من مطابقتها للطاقة المطلوبة. أخيرا ، قم بإلغاء حظر شعاع Stokes للسماح بالتصوير.
12. اضغط على تشغيل لبدء التصوير التلقائي لنقاط الضبط.
13. بعد الانتهاء من تصوير MATL ، قم بتبديل شعاع المضخة مرة أخرى إلى 803 نانومتر واضبط الطاقة مرة أخرى على طاقة تصوير الدهون الأصلية المستخدمة في الخطوة 5.1.
14. كما هو الحال في الخطوات السابقة، قم بتغيير اسم الملف ليكون متسقا مع صور ما بعد التجربة طوال فترة الدراسة.
15. اضبط عدد مرات التكرار على 1.
16. انقر على جاهز | زر التشغيل للحصول على مكدس دهون بعد الدورة الزمنية والتأكد من عدم وجود حركة للأنسجة أثناء التصوير (الشكل 4).

الشكل 4: حركة الأنسجة في جلد أذن الفأر العاري التي تظهر من خلال تصور الغدد الدهنية. يتم تصوير مثال على حركة الأنسجة المحدودة في A و B ، في حين يتم تصوير حركة الأنسجة الكبيرة في C و D. (أ) يظهر الغدد الدهنية في وقت تطبيق التركيبة و (ب) نفس العمق عند 120 دقيقة بعد التطبيق. (ج) الغدد الدهنية للفئران في وقت تطبيق الصياغة و (د) 120 دقيقة بعد تطبيق الصياغة؛ الغدد الدهنية بالكاد مرئية ، وهذا مؤشر على أن هذه التجربة لم تكن تقيس الامتصاص في الغدد الدهنية طوال المدة التجريبية. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الصور هي 1024 بكسل × 1024 بكسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. تحليل البيانات

1. الحصول على الصور ك . OIB (أو . OIR اعتمادا على المجهر وبرنامج MC) أنواع الملفات مع كل موقف XYZ وجود مجلد فرعي منفصل.
2. قم بتجميع صور الدهون مع صور قناة API عن طريق إعادة تسمية صور الدهون مع النهاية التالية _lipid.oib.
3. نفذ الخطوات التالية مع كل تقسيم طبقي للجلد (موضح هنا باستخدام التقسيم الطبقي SG فقط من أجل البساطة ؛ انظر الشكل 3B).
   1. قم باستيراد صورة دهون SG إلى ImageJ (أو فيجي)³⁴ وحدد المربع المسمى قنوات الانقسام لتقسيم الملف إلى قنوات CARS و SRS.
      ملاحظة: ستقوم فيجي بتقسيم الملف إلى عدد الصور التي تم الحصول عليها أثناء التجربة عبر عدد القنوات.
   2. افتح مدير منطقة الاهتمام (ROI) بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار.
   3. باستخدام قناة SRS (على سبيل المثال ، C = 1) ، قم بترسيم SG في الصورة.
      ملاحظة: SGs هي المواقع الساطعة بسبب الاهتزاز المستهدف -CH₂- .
   4. أضف هذا إلى مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق إضافة [t] في مدير عائد الاستثمار أو الضغط على t على لوحة المفاتيح. كرر هذه العملية لكل SG داخل الصورة.
   5. لإخفاء المناطق الغنية بالدهون، حدد كل عائد استثمار وانقر فوق علامة التبويب المزيد | OR (دمج) | أضف إلى مدير عائد الاستثمار.
   6. لإخفاء المناطق الفقيرة بالدهون ، استخدم أداة المستطيل في قائمة FIJI وارسم مربعا حول الصورة بأكملها. أضف هذا إلى مدير عائد الاستثمار.
   7. انقر على عائد الاستثمار المربع المضاف حديثا بالإضافة إلى عائد الاستثمار الذي يحدد جميع المناطق الغنية بالدهون في مدير عائد الاستثمار. ضمن المزيد، حدد XOR لإنشاء قناع للمناطق الفقيرة بالدهون وإضافته إلى مدير عائد الاستثمار.
4. قم بتحميل صور واجهة برمجة التطبيقات في فيجي.
5. قم بتسلسل الصور بترتيب رقمي (أي Image0001 و Image0002 و Image0003 وما إلى ذلك) باستخدام تسلسل القائمة التالي: Image | مكدسات | أدوات | تسلسل.
   1. بدلا من ذلك، قم باستيراد هذه الصور عن طريق تحميل إحدى الصور إلى فيجي ثم تحديد خيار يسمى تجميع الملفات ذات الأسماء المتشابهة في صفحة الإعداد .
      ملاحظة: يوفر هذا القدرة على استيراد كافة الصور باسم ملف مماثل وتسلسلها تلقائيا.
6. أثناء تنشيط الصورة المتسلسلة ، انتقل إلى مدير عائد الاستثمار ، وحدد المناطق الغنية بالدهون (أي SG) ، وانقر فوق المزيد ، وحدد متعدد القياسات. انتظر حتى تظهر نافذة النتائج.
7. ابحث عن المساحة والمتوسط والحد الأدنى والحد الأقصى والوسيط في إعدادات القياس الافتراضية. إذا كانت هناك حاجة إلى مقاييس أخرى للتحليل، فقم بتمكين هذه الخيارات عن طريق تحديد خانة الاختيار ذات الصلة في نافذة تعيين القياسات (تحليل | تعيين القياسات ...).
8. تصدير البيانات من نافذة النتائج إلى جدول بيانات وإضافة عمود بعنوان المنطقة.
9. أضف الدهون الغنية إلى كل صف من البيانات للمناطق الغنية بالدهون. أضف الدهون الفقيرة إلى المناطق التي كانت خارج الدهون.
10. أضف عمودا بعنوان الطبقة وأضف الطبقة المعنية التي تم تحليلها (الجدول التكميلي S1).
11. كرر الخطوات من 6.5 إلى 6.7 للمناطق الفقيرة بالدهون أثناء تحديد عائد الاستثمار المناسب.
12. لتصور البيانات، احفظ جدول البيانات واستورده إما إلى JupyterLab (package matplotlib)³⁵ أو في R (package ggplot2)³⁶. ارسم البيانات كدالة لرقم الصورة مقابل متوسط الكثافة لتقدير بيانات وقت التركيز. (الشكل 5).
13. استيراد جدول البيانات إلى RStudio لإجراء تحليل غير مجزأ (NCA) للتحليل الدوائي لبيانات CRI.
14. أضف عمودا بعنوان الوقت.
15. بالنسبة إلى Image0001، احسب المدة بين تطبيق الصيغة والصورة الأولى.
    ملاحظة: هذه هي النقطة الزمنية الأولى. يتم استخدام مدة الدورة لحساب الصور المتبقية (وبالتالي النقاط الزمنية) التي تزداد بمرور الوقت. على سبيل المثال ، إذا كان الوقت منذ التطبيق هو 30 دقيقة ، فسيكون ل Image0001 نقطة زمنية مدتها 30 دقيقة ومدة دورة تبلغ 8 دقائق ، وسيكون ل Image0002 نقطة زمنية مدتها 38 دقيقة ، وسيكون ل Image0003 نقطة زمنية مدتها 46 دقيقة وما إلى ذلك.
16. قم بتشغيل NCA في RStudio (باستخدام حزمة NonCompart)³⁷ على بيانات وقت الكثافة المستوردة من جدول البيانات، مع الاستدعاء التالي لطبقة/منطقة واحدة:
    sNCA (x = الوقت ، y = المتوسط ، الجرعة = 1 ، timeUnit = "s" ، الجرعة = "mg")
    حيث يشير x إلى النقاط الزمنية ، يشير y إلى الشدة ، ويمكن ترك الجرعة كجرعة واحدة ، محسوبة على أنها جرعة mM من الدواء في التركيبة أو جرعة المنتج.
    ملاحظة: سيوفر إخراج NCA معلمات مثل C_max و AUC_جميعها. ومع ذلك ، نظرا لأن هذا هو الجلد خارج الجسم الحي ، فإن هذه المعلمات هي ، في الواقع ، J_max و AUC_flux-all.
17. قارن بين مقاييس J_max و AUC_flux-all بصريا عن طريق رسمها (الشكل 6) بالإضافة إلى المقارنات الإحصائية عبر الظروف التجريبية. انظر الشكل 6 للحصول على مثال على تحليل دراسات CRI خارج الجسم الحي .
    ملاحظة: يتوقف الاختبار (الاختبارات) الإحصائية المناسبة على كل مجموعة بيانات محددة. من المهم أيضا ملاحظة أن جميع معلمات الحرائك الدوائية يتم توزيعها بشكل طبيعي ، ويجب أن تستخدم أي مقارنات بيانات السجل المحولة (السجل الطبيعي أو log10).

الشكل 5: الكثافة مقابل ملامح الوقت. (أ) مثال على ملامح التدفق التي وصلت إلى التشبع وبالتالي لا يرى سوى انخفاض في الكثافة. يحتوي كل عائد استثمار على ملف تعريف تدفق مختلف لإثبات عدم التجانس في البيانات التي قد يكتسبها المرء. (ب) مثال على التركيزات التي تزداد بعد بدء التصوير. كل عائد استثمار هو مجال رؤية مختلف (يشار إليه بآثار الألوان المختلفة) داخل نفس النسيج لنفس التجربة. وبالإضافة إلى التركيزات العالمية، هناك القدرة على توضيح البيئة المحلية التي تفضلها واجهة برمجة التطبيقات/التركيبة على النحو المبين في المناطق الغنية بالدهون والفقيرة بالدهون. تشير الملفات الشخصية المقدمة في A إلى أنه لا يوجد امتصاص للدواء في الأنسجة لأن واجهة برمجة التطبيقات قد تغلغلت بالفعل وبدأت في مغادرة الأنسجة بمجرد بدء التصوير. ومع ذلك ، في B ، لم يصل النسيج إلى التشبع ، ولا يزال هناك امتصاص لواجهة برمجة التطبيقات متبوعا بالإزالة. سيساعد تقسيم الصور إلى غنية بالدهون وخالية من الدهون في توضيح توطين واجهة برمجة التطبيقات (أو غير النشطة) ومسارات النفاذية في الجلد (أي الطبقة القرنية). يشير التركيز العالي داخل المناطق الغنية بالدهون إلى أن API يتمركز داخل بنية الدهون للطبقة قيد التحقيق ، مما يساعد في معلومات توصيل الأدوية المستهدفة. الاختصارات: عائد الاستثمار = منطقة الاهتمام; API = العنصر الصيدلاني النشط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

يعتبر التصوير ناجحا إذا لم يتحرك النسيج بشكل كبير في الاتجاه المحوري (<10 ميكرومتر) أو الجانبي عند الانتهاء من التجربة (الشكل 4). هذا مؤشر فوري إذا كان قياس SRS لواجهة برمجة التطبيقات ذات الأهمية لا يمثل العمق الأولي ، والذي يكون القياس الكمي خاصا بطبقته. يتم تخفيف ذلك عن طريق ت?...

Discussion

تقييم BA/BE الموضعي هو مجال للبحث يتطلب نهجا متعدد الأوجه حيث لا يمكن لأي طريقة واحدة أن تميز بشكل كامل في الجسم الحي cPK. يقدم هذا البروتوكول منهجية لتقييم BA/BE لمنتج دوائي موضعي استنادا إلى تصوير رامان المتماسك. واحدة من النقاط الأولى التي يمكن تجاهلها هي مدى رقة عينات الجلد ، خاصة بالنسب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Preparation
Autoclavable Biohazard Bags	FisherBrand	22-044562	As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	MT21030CV	As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv
Disposable Scalpels	Exel International	14-840-00	As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps	Fisherbrand	12-000-132	As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Kimberly-Clark Professional Kimtech Science	06-666	As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Bemis	13-374-12	As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Dish (35 mm x 10 mm)	Fisherbrand	FB0875711YZ	As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petri Dish (60 mm x 15 mm)	Fisherbrand	FB0875713A	As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Surgical Scissors	Roboz	NC9411473	As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC
Laser/microscope
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock		As refered to in text: CARS filter - CH2 vibrations (645nm/60nm filter)
Control box IX2-UCB	Olympus		As refered to in text: Control Box
D700/30m	Chroma		As refered to in text: CARS filter - deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight	Spectra-Physics		As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console	ThorLabs	PM100D	As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software	Olympus		As refered to in text: Microscope Control software
Frosted Microscope Slides	FisherBrand		As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000	Olympus		As refered to in text: Microscope
Incubation Chamber	Tokai Hit	GM-800	As refered to in text: incubation chamber
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S142C	As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Power supply FV31-PSU	Olympus		As refered to in text: Power Supply
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator	BK Precision		As refered to in text: function generator
ProScan – Precision Microscope Automation	Prior Scientific Instruments		As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Imaging Spacers	Grace Biolabs	654004	As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS Detection Kit	APE		As refered to in text: SRS detector
UPLSAPO 20X NA:0.75	Olympus		As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Drug Imaging
35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter	MatTek Corporation	NC9711297	As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Cotton-tipped applicators	FisherBrand		As refered to in text: Cotton-tipped applicator
Distriman Postive Displacement Pipette	Gilson		As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Postive Displacement Pipette Tips	Gilson		As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI	Open-source		As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab	open-source		As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/
Rstudio	Open-source		As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/