JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول منصة الموائع الدقيقة الهوائية التي يمكن استخدامها لتركيز الجسيمات الدقيقة بكفاءة.

Abstract

تقدم هذه المقالة طريقة لتصنيع وتشغيل صمام هوائي للتحكم في تركيز الجسيمات باستخدام منصة الموائع الدقيقة. تحتوي هذه المنصة على شبكة ثلاثية الأبعاد (3D) مع قنوات سائلة منحنية وثلاثة صمامات هوائية ، والتي تخلق شبكات وقنوات ومساحات من خلال النسخ المتماثل المزدوج مع polydimethylsiloxane (PDMS). يعمل الجهاز بناء على الاستجابة العابرة لمعدل تدفق السوائل الذي يتحكم فيه صمام هوائي بالترتيب التالي: (1) تحميل العينة ، (2) حجب العينة ، (3) تركيز العينة ، و (4) إطلاق العينة. يتم حظر الجسيمات عن طريق تشوه طبقة الحجاب الحاجز الرقيق لصفيحة صمام الغربال (Vs) وتتراكم في قناة الموائع الدقيقة المنحنية. يتم تفريغ سائل العمل عن طريق تشغيل صمامين للتشغيل / الإيقاف. نتيجة للعملية ، تم اعتراض جميع الجسيمات ذات التكبيرات المختلفة بنجاح وفك ارتباطها. عند تطبيق هذه التقنية ، قد يختلف ضغط التشغيل والوقت اللازم للتركيز ومعدل التركيز اعتمادا على أبعاد الجهاز وتكبير حجم الجسيمات.

Introduction

نظرا لأهمية التحليل البيولوجي ، يتم استخدام تقنيات الأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة الدقيقة والطبية الحيوية (BioMEMS)1,2 لتطوير ودراسة أجهزة لتنقية وجمع المواد الدقيقة2,3,4. يتم تصنيف التقاط الجسيمات على أنها نشطة أو سلبية. تم استخدام الفخاخ النشطة للقوى الخارجية العازلة5 أو المغناطيسية6 أو السمعية7 أوالبصرية 8 أو الحرارية9 التي تعمل على الجسيمات المستقلة ، مما يتيح التحكم الدقيق في تحركاتها. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تفاعل بين الجسيم والقوة الخارجية ؛ وبالتالي ، فإن الإنتاجية منخفضة. في أنظمة الموائع الدقيقة ، يعد التحكم في معدل التدفق مهما جدا لأن القوى الخارجية تنتقل إلى الجسيمات المستهدفة.

بشكل عام ، تحتوي أجهزة الموائع الدقيقة السلبية على أعمدة دقيقة في القنوات الدقيقة10,11. يتم ترشيح الجسيمات من خلال التفاعل مع سائل متدفق ، وهذه الأجهزة سهلة التصميم وغير مكلفة للتصنيع. ومع ذلك ، فإنها تسبب انسداد الجسيمات في الأعمدة الدقيقة ، لذلك تم تطوير أجهزة أكثر تعقيدا لمنع انسداد الجسيمات12. أجهزة الموائع الدقيقة ذات الهياكل المعقدة مناسبة بشكل عام لإدارة عدد محدود من الجسيمات 13،14،15،16،17،18.

توضح هذه المقالة طريقة لتصنيع وتشغيل منصة ميكروفلويديك تعمل بالهواء المضغوط لتركيزات الجسيمات الكبيرة التي تتغلب على أوجه القصور18 كما هو مذكور أعلاه. يمكن لهذه المنصة منع الجسيمات وتركيزها عن طريق تشوه وتشغيل طبقة الحجاب الحاجز الرقيقة لصفيحة صمام الغربال (Vs) التي تتراكم في قنوات الموائع الدقيقة المنحنية. تتراكم الجسيمات في قنوات ميكروفلويديك منحنية ، ويمكن للجسيمات المركزة أن تنفصل عن طريق تفريغ سائل العمل عن طريق تشغيل اثنين من سدادات PDMS على / إيقاف الصمامات18. هذه الطريقة تجعل من الممكن معالجة عدد محدود من الجسيمات أو تركيز عدد كبير من الجسيمات الصغيرة. يمكن لظروف التشغيل مثل حجم معدل التدفق وضغط الهواء المضغوط أن تمنع تلف الخلايا غير المرغوب فيه وتزيد من كفاءة احتجاز الخلايا.

Protocol

1. تصميم منصة الموائع الدقيقة لتركيز الجسيمات

  1. تصميم منصة الموائع الدقيقة الهوائية التي تتكون من صمام هوائي واحد لتدفق السوائل في شبكة التدفق 3D وثلاثة صمامات هوائية لتشغيل صمام الغربال (Vs) والسائل (Vf) والجسيمات (Vp) (الشكل 1).
    ملاحظة: كتل Vs تركز الجسيمات من السائل ، و Vf و Vp يسمحان بإطلاق السوائل والجسيمات بعد التركيز. توفر ثلاثة منافذ هوائية هواء مضغوطا من طبقة إمداد السوائل / الهوائية (مفتوحة عادة) ومنفذ ضوء الصمام الهوائي لتشغيل الصمام. تم تصميم شبكة قنوات الموائع الدقيقة مع برنامج CAD18,19.
  2. صمم القناة لتكون طبقة إمداد هوائية وطبقة شبكة قناة ثلاثية الأبعاد (الشكل 2).
    ملاحظة: شبكة السوائل مترابطة مع القنوات المنحنية في الجزء الأمامي والغرفة المستطيلة في المنطقة الخلفية. Vs كتلة المدخل ، وتتراكم الجسيمات في منطقة تجميع قناة السائل المنحنية. يتم إخراج السوائل الخالية من الجسيمات (السوائل الخالية من الجسيمات) من خلال منفذ Qf والجسيمات المركزة من خلال مخرج Qp (الشكل 3).
  3. وفقا للشروط المذكورة أعلاه ، قم بإعداد أربعة أنواع من قوالب SU-8.
    ملاحظة: تتضمن القوالب الأربعة قالبا يسمح بالتحكم في الصمام عبر الهواء المضغوط ، وقالبين ينشئان قنوات سائلة ، وقالبا نظيفا بدون شكل (الشكل 4 والجدول 1). يتم تصنيع الأنواع الأربعة من القوالب المذكورة باستخدام عمليات الطباعة الحجرية الضوئية القياسية. يتكون صنع القالب هذا من قالب SU-8 على رقاقة سيليكون وفقا للتقارير المنشورة سابقا18,19. يصور الشكل 5 شريحة الجهاز.

2. تصنيع منصة الموائع الدقيقة لتركيز الجسيمات

ملاحظة: يوضح الشكل 6 تصنيع منصة الموائع الدقيقة التي تركز الجسيمات.

  1. قم بتكرار طبقة PDMS باستخدام قالب SU-8 لقناة الصمام الهوائية المحضر (الخطوة 1.3) للتحكم الهوائي في الصمام.
    1. صب 10 مل من PDMS السائل و 1 مل من عامل المعالجة (انظر جدول المواد) في قالب قناة صمام هوائي معد (الخطوة 1.3) وتنشيط الحرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. بعد علاج هياكل PDMS ، افصل قالب SU-8 للخطوة 2.1.1.
    3. قم بثقب ثلاثة منافذ هوائية مقاس 1.5 مم (Vs، Vf، وVp) في قناة الصمام الهوائي المصنعة وفقا للخطوة 2.1.2 باستخدام ثقب 1.5 مم (انظر جدول المواد).
    4. صب 10 مل من PDMS السائل و 1 مل من عامل المعالجة في قالب SU-8 نظيف معد تم إعداده في الخطوة 1.3 ومعطف مغزلي عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية باستخدام معطف دوار (انظر جدول المواد). ثم قم بالتنشيط الحراري عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. بعد شفاء هياكل PDMS ، افصل قالب SU-8 للخطوة 2.1.4.
      ملاحظة: تتحكم طبقة الحجاب الحاجز للصمام في تدفق السوائل وفقا للضغط الهوائي.
    6. عالج بلازما الغلاف الجوي (انظر جدول المواد) بهياكل PDMS المعدة في الخطوتين 2.1.3 و 2.1.5 لمدة 20 ثانية.
    7. قم بمحاذاة هياكل PDMS المعالجة بالبلازما مباشرة من الخطوة 2.1.6 وفقا لبنية القناة عن طريق التحقق باستخدام المجهر.
    8. قم بربط هياكل PDMS المحاذاة المعدة في الخطوة 2.1.7 عن طريق التسخين عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    9. ثقب ثقبا قطره 1.5 مم في مدخل قناة السائل (Qfp) ومنافذ قناة السائل (Qf وQp) داخل جزء القناة الهوائية الذي ترتبط به طبقة الحجاب الحاجز الرقيقة، باستخدام ثقب 1.5 مم.
  2. قم بتكرار جانبي طبقة PDMS باستخدام قالبين SU-8 لإنشاء قناة ميكروفلويدية. استخدم قالب قناة ميكروفلويديك منحني ومستطيل الشكل في الأمام وقالب قناة ربط ميكروفلويديك في الخلف.
    1. صب 10 مل من PDMS السائل و 1 مل من عامل المعالجة في قالب قناة microfluidic المنحنية والمستطيلة ومعطف الدوران عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية. ثم قم بإنشاء قوالب لغرفة السائل المنحنية وقنوات السوائل عن طريق التنشيط الحراري عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الشكل 6A).
    2. افصل طبقة PDMS التي تتشكل عليها قناة الموائع الدقيقة ، ثم اصنع قالبا منشطا بالحرارة يغطي جدار التهوية المختوم عن طريق الارتباط بالرقاقة الزجاجية عن طريق معالجة البلازما الجوية لمدة 20 ثانية (الشكل 6B).
    3. صب 3 مل من PDMS السائل في قناة التوصيل البيني لقالب SU-8 (الشكل 6C).
    4. رتب الهيكل المصنع في الخطوة 2.2.2 باستخدام قالب قناة التوصيل البيني في PDMS السائل على قالب قناة التوصيل البيني الموائع الدقيقة ، وجفف الهيكل المتراكب عند 130 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الشكل 6D).
      ملاحظة: أثناء معالجة الهيكل الخلفي، يتم تضخيم قالب PDMS المصنع في الخطوة 2.2.2 بواسطة الضغط الحراري لطبقة الهواء، ويتم تنشيط طبقة PDMS المشوهة حراريا (الشكل 6E)16.
    5. بعد المعالجة ، قم بإزالة قالب SU-8 الأمامي من طبقة شبكة قناة الموائع الدقيقة وقم بتقشير قالب PDMS الخلفي بعناية (الشكل 6F).
      ملاحظة: تسمح طبقة الشبكة الموائعة 3D بإنشاء غرفة سائل منحنية أمامية وقنوات ميكروفلويدية.
    6. صب 10 مل من PDMS السائل و 1 مل من عامل المعالجة في قالب SU-8 نظيف. ثم قم بالتنشيط الحراري عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    7. بعد شفاء هياكل PDMS ، افصل قالب SU-8.
      ملاحظة: تقوم هذه الخطوة بإنشاء طبقة الختم الإضافية.
    8. عالج البلازما الجوية بهياكل PDMS المحضرة في الخطوتين 2.2.3 و 2.2.7 لمدة 20 ثانية.
    9. قم بمحاذاة هياكل PDMS المعالجة بالبلازما مباشرة وفقا لبنية القناة عن طريق التحقق باستخدام المجهر.
    10. قم بربط هياكل PDMS المحاذاة عن طريق التسخين عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. قم بمحاذاة هياكل PDMS المعدة في الخطوتين 2.1 و 2.2 وفقا لبنية القناة وربطها عن طريق معالجة البلازما الجوية لمدة 20 ثانية.

3. إعداد الجهاز

ملاحظة: يوضح الشكل 7 تصنيع منصة الموائع الدقيقة التي تركز الجسيمات.

  1. املأ قناة الموائع الدقيقة يدويا بالماء الخالي من الفقاعات باستخدام حقنة 10 مل.
  2. للتحكم في P_Qfp والصمامات الهوائية الثلاثة (P_Vs P_Vf P_Vp) التي تتحكم في تدفق الميكروبيد، أدخل وحدة تحكم في الضغط الدقيق مع أربع قنوات إخراج أو أكثر (انظر جدول المواد) لسائل العمل (Qfp) في منصة الموائع الدقيقة.
    ملاحظة: يمكن استبدال وحدة التحكم في الضغط الدقيق مع أربع قنوات إخراج بوحدات تحكم متعددة في الضغط الدقيق. في هذه التجربة ، كان ضغط التشغيل P_Qfp 10 كيلوباسكال ، وكان P_Vs 15 كيلوباسكال ، وكان P_Vf P_Vp 18 كيلوباسكال (الشكل 8 والجدول 2). ويبين الشكل 8 معدل تدفق سوائل العمل مع مرور الوقت حيث تتركز الجسيمات بواسطة منصة الموائع الدقيقة P_Vs 15 كيلوباسكال، ويبين الجدول 2 نتائج التشغيل وفقا للصمامات الهوائية.
  3. تحضير جزيئات اختبار الكربوكسيل البوليسترين من مختلف الأحجام في الماء المقطر (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: كانت أحجام الجسيمات المستخدمة في هذه التجربة 24.9 و 8.49 و 4.16 ميكرومتر. يمكن استخدام جزيئات من مختلف الأحجام اعتمادا على ضغط P_Vs.
  4. للتحكم في معدل تدفق سائل العمل ، املأ زجاجة زجاجية نصف ممتلئة بالماء (سائل العمل) وقم بتوصيل غطاء الزجاجة الزجاجية بقناة إخراج وحدة التحكم والصمام الدقيق.
    ملاحظة: قم بتوصيل أنبوب واحد بالصمام الدقيق لتلقي الهواء المضغوط من وحدة التحكم والأنبوب الآخر لحقن الماء.
  5. راقب تشغيل المنصة من خلال مجهر مقلوب لجميع عمليات المنصة وقياس معدل تدفق التشغيل بمرور الوقت عند المخرج بواسطة مقياس تدفق السائل (انظر جدول المواد).

4. تشغيل الجهاز

  1. حقن خليط الجسيمات / السائل تحت الضغط عند المدخل (Qfp) مع Vp (الشكل 9A).
    ملاحظة: يتم التحكم في تدفق الجسيمات والسوائل النظيفة من المخرج عبر القنوات المترابطة عبر Vp و Vf ، على التوالي (الجدول 2).
  2. اضغط على Vs عند 15 كيلو باسكال و Vp عند 18 كيلو باسكال لتشغيل الصمام.
    ملاحظة: في هذا الوقت ، يتم تشويه الحجاب الحاجز ، ويتم حظر جزيئات السائل Qfp في مساحة التلامس بين قناة السائل المنحنية وكانتيليف السائل المنحني ، ويتم إطلاق سائل Qfp غير المرغوب فيه من خلال Qf المفتوح (الشكل 9B ، C).
  3. عندما تتركز الجسيمات ، اضغط فقط على Vf.
    ملاحظة: في هذا الوقت ، عندما يتم تطبيق الضغط فقط على Vf ، يتم إطلاق الجسيمات المسدودة من خلال Qp (الشكل 9D).

النتائج

ويبين الشكل 8 معدل تدفق معدلات السوائل لعملية منصة من أربع مراحل، كما هو مذكور في الجدول 2. المرحلة الأولى هي حالة التحميل (حالة). تم تزويد المنصة بسائل مع فتح جميع الصمامات ، والسائل العامل (Qf) والجسيمات (Qp) متطابقة تقريبا حيث تظهر شبكة قنوات الموائع الدقيقة تناظرا ه...

Discussion

توفر هذه المنصة طريقة بسيطة لتنقية وتركيز الجسيمات من مختلف الأحجام. تتراكم الجسيمات وتطلق من خلال التحكم في الصمام الهوائي ، ولا يلاحظ أي انسداد لأنه لا يوجد هيكل سلبي. باستخدام هذا الجهاز ، يتم تقديم تركيز الجسيمات ذات الثلاثة أحجام. ومع ذلك ، قد يختلف ضغط التشغيل ، والوقت اللازم للتركيز...

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) التي تمولها الحكومة الكورية (وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات). (لا. NRF-2021R1A2C1011380).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mm punctureSelf procductionSelf procductionThis puncture was made by requesting a mold maker based on the Miltex® Biopsy Punch with Plunger (15110-15) product.
4 inch Silicon Wafer/SU-8 mold4science29-03573-014 inch (100) Ptype silicon wafer/SU-8 mold
Carboxyl Polystyrene Crosslinked Particle(24.9 μm)SpherotechCPX-200-10Concentrated bead sample1
Flow meterSensirionSLI-1000Flow measurement
High-speed cameraPhotronFASTCAM MiniObservation of concentration
Hot plateAs oneHI-1000heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL/SyringeKoreavaccine22G-10MLFill the microfluidic channel with bubble-free demineralized water.
Laboratory Conona treater/Atmospheric plasmaElectro-TechnicBD-20ACChip bonding/atmospheric plasma
Liquid polydimethylsiloxane, PDMSDow Corning Inc.Sylgard 184Components of chip
MicroscopeOlympusIX-81Observation of concentration
PEEK TubesSAINT-GOBAIN PPL CORP.AAD04103Inject or collect particles
Polystyrene Particle(4.16 μm)SpherotechPP-40-10Concentrated bead sample3
Polystyrene Particle(8.49 μm)SpherotechPP-100-10Concentrated bead sample2
Pressure controller/μfluconAMEDμfluconControl of air pressure
Spin coateriNexusACE-200spread the liquid PDMS on SU-8 mold

References

  1. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7107), 368-373 (2006).
  2. Desitter, I., et al. A new device for rapid isolation by size and characterization of rare circulating tumor cells. Anticancer Research. 31 (2), 427-441 (2011).
  3. Hayes, D. F., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clinical Cancer Research. 12 (14), 4218-4224 (2016).
  4. Choi, S., Park, J. K. Microfluidic system for dielectrophoretic separation based on a trapezoidal electrode array. Lab on a Chip. 5 (10), 1161-1167 (2005).
  5. Jung, Y., et al. Six-stage cascade paramagnetic mode magnetophoretic separation system for human blood samples. Biomedical Microdevices. 12 (4), 637-645 (2010).
  6. Li, P., et al. Acoustic separation of circulating tumor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 4970-4975 (2015).
  7. Lin, Y. H., Lee, G. B. Optically induced flow cytometry for continuous microparticle counting and sorting. Biosensors and Bioelectronics. 24 (4), 572-578 (2008).
  8. Gramotnev, D. K., et al. Thermal tweezers for surface manipulation with nanoscale resolution. Applied Physics Letters. 90 (5), 054108 (2007).
  9. Huang, L. R., et al. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
  10. Yin, D., et al. Multi-stage particle separation based on microstructure filtration and dielectrophoresis. Micromachines. 10 (2), 103 (2019).
  11. Yoon, Y., et al. Clogging-free microfluidics for continuous size-based separation of microparticles. Scientific Reports. 6 (1), 1-8 (2016).
  12. Alvankarian, J., Majlis, B. Y. Tunable microfluidic devices for hydrodynamic fractionation of cells and beads: a review. Sensors. 15 (11), 29685-29701 (2015).
  13. Irimia, D., Toner, M. Cell handling using microstructured membranes. Lab on a Chip. 6 (3), 345-352 (2006).
  14. Huang, S. B., et al. A tunable micro filter modulated by pneumatic pressure for cell separation. Sensors and Actuators B: Chemical. 142 (1), 389-399 (2009).
  15. Chang, Y. H., et al. A tunable microfluidic-based filter modulated by pneumatic pressure for separation of blood cells. Microfluidics and Nanofluidics. 12 (1-4), 85-94 (2012).
  16. Oh, C. K., et al. Fabrication of pneumatic valves with spherical dome-shape fluid chambers. Microfluidics and Nanofluidics. 19 (5), 1091-1099 (2015).
  17. Liu, W., et al. Dynamic trapping and high-throughput patterning of cells using pneumatic microstructures in an integrated microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (9), 1702-1709 (2012).
  18. Jang, J. H., Jeong, O. C. Fabrication of a pneumatic microparticle concentrator. Micromachines. 11 (1), 40 (2020).
  19. McDonald, J. C., et al. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic device. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
  20. Brivio, M., et al. A MALDI-chip integrated system with a monitoring window. Lab on a Chip. 5 (4), 378-381 (2005).
  21. Jeong, O. C., Konishi, S. The self-generated peristaltic motion of cascaded pneumatic actuators for micro pumps. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (8), 085017 (2008).
  22. Taff, B. M., Voldman, J. A scalable addressable positive dielectrophoretic cell-sorting array. Analytical Chemistry. 77 (24), 7976-7983 (2005).
  23. Pamme, N., et al. On-chip free-flow magnetophoresis: Separation and detection of mixtures of magnetic particles in continuous flow. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 307 (2), 237-244 (2006).
  24. Harris, N. R., et al. Performance of a micro-engineered ultrasonic particle manipulator. Sensors and Actuators B: Chemical. 111, 481-486 (2005).
  25. Yoon, Y., et al. Clogging-free microfluidics for continuous size-based separation of microparticles. Scientific Reports. 6 (1), 1-18 (2016).
  26. Beattie, W., et al. Clog-free cell filtration using resettable cell traps. Lab on a Chip. 14 (15), 2657-2665 (2014).
  27. Cheng, Y., et al. A bubble- and clogging-free microfluidic particle separation platform with multi-filtration. Lab on a Chip. 16 (23), 4517-4526 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved