توليد وتوسيع خطوط ورم المتوسطة الجنبي الأولي الخبيث

Summary

الهدف من ورقة هذه الطريقة هو إظهار منهجية قوية وقابلة للتكرار لإثراء وتوليد وتوسيع خطوط الخلايا السرطانية الأولية من ورم المتوسطة الجنبي المستأصل جراحيا.

Abstract

المنهجيات الحالية لتوسيع خطوط الخلايا السرطانية الأولية من أنواع الأورام النادرة غير موجودة. يصف هذا البروتوكول طرق توسيع الخلايا السرطانية الأولية من ورم المتوسطة الجنبي الخبيث المقطوع جراحيا (MPM) من خلال تقديم نظرة عامة كاملة على العملية من الهضم إلى التخصيب والتوسع والحفظ بالتبريد والتوصيف الظاهري. بالإضافة إلى ذلك ، يقدم هذا البروتوكول مفاهيم لتوليد الورم قد تكون مفيدة لأنواع متعددة من الأورام مثل التربسينات التفاضلية وتأثير طرق التفكك على اكتشاف علامات سطح الخلية للتوصيف المظهري. القيد الرئيسي لهذه الدراسة هو اختيار الخلايا السرطانية التي ستتوسع في نظام ثقافة ثنائي الأبعاد (2D). يمكن أن تؤدي الاختلافات في هذا البروتوكول ، بما في ذلك أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد (3D) ، ومكملات الوسائط ، وطلاء الألواح لتحسين الالتصاق ، وطرق التصنيف البديلة ، إلى تحسين هذه التقنية ومعدل النجاح الإجمالي لإنشاء خط ورم. بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول طريقة أساسية لإنشاء وتوصيف الخلايا السرطانية من هذا الورم النادر.

Introduction

ورم المتوسطة الجنبي الخبيث (MPM) هو ورم نادر يرتبط ارتباطا وثيقا بالتعرض للأسبستوس. على الرغم من أن النهج القائمة على العلاج المناعي قد أظهرت نتائج مشجعة ، إلا أن هناك ندرة في خيارات العلاج المتاحة للمرضى الذين يصابون بهذا المرض ، ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات منخفض ^1,2. وتبذل حاليا جهود في مؤسسات متعددة لفهم هذا المرض بشكل أفضل وتحديد أهداف علاجية جديدة قد تحسن نتائج المرضى. في حين أن هناك العديد من نماذج الفئران ورم المتوسطة ، فإن الوصول إلى خلايا ورم المتوسطة الأولية أكثر محدودية³. في المختبر ، سيوفر التوسع في خلايا ورم المتوسطة الأولية نظاما نموذجيا قيما يمكن استخدامه لدراسة الخلايا السرطانية مباشرة وتفاعلها مع الخلايا المناعية الذاتية مثل الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم. في حين كانت هناك تقارير عن توسيع خطوط الخلايا السرطانية الأولية لورم المتوسطة ، إلا أنها قليلة ولا توفر إجراء تشغيليا قياسيا مفصلا (SOP). علاوة على ذلك ، تتوفر خطوط خلوية قليلة من مصادر تجارية مثل مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC). في حين أن توافر خطوط الورم الأولية محدود ، فقد ثبت أنه يمكن توسيع الخلايا السرطانية من الانصباب الجنبي ومباشرة من أنسجة الورم ^4,5. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن خطوط الخلايا السرطانية الموسعة تحافظ على المظهر الجزيئي للورم الأصلي ^4,5,6.

يدرس مختبرنا البيئة الدقيقة المناعية للورم في MPM وقد طور طريقة لتوسيع خطوط الخلايا السرطانية MPM الأولية من الحالات التي تم استئصالها جراحيا. هذه الطريقة مقتبسة من تجربتنا في إنشاء خطوط الخلايا السرطانية الميلانينية النقيلية الأولية. الهدف من هذا العمل هو توفير نهج مفصل وعملي لتوسيع خط ورم المتوسطة الأولي باستخدام نظام نموذج 2D والتنميط الظاهري اللاحق. وبالنظر إلى النجاح الأخير لاستراتيجيات حصار نقاط التفتيش التي تستهدف CTLA4 و PD-1 في إعداد الخط الأول² ، فإن القدرة على توليد العديد من خطوط الورم الأولية يمكن أن تعزز فهم كل من آليات المقاومة الجوهرية للورم بالإضافة إلى توفير نظام نموذجي مهم لتقييم التعرف على الخلايا التائية ، وبالتالي تعميق فهمنا للاستجابة المناعية في MPM.

القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو أن كل ورم يحتوي على بيئة دقيقة مختلفة ، وهناك درجة عالية من التباين في نجاح التوسع. بالإضافة إلى ذلك ، تختار هذه الطريقة الخلايا السرطانية التي يمكن أن تتوسع في نظام زراعة 2D. يمكن أن توفر الطرق الأخرى التي تنطوي على إنتاج كروية 3D أو ثقافة عضوية نهجا بديلا قد يسمح بمعدل نجاح أعلى للتوسع أو يؤدي إلى القدرة على اشتقاق خطوط الخلايا غير القادرة على التوسع في نظام 2D التقليدي. وقد ثبت أن هذه الثقافات 3D لتكون مفيدة لتوليد أنواع الأورام التي يصعب توسيعها ، على سبيل المثال ، سرطان البنكرياس⁷.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل مجلس مراجعة المؤسسة (IRB) التابع لمركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس. يتعلق هذا بمعايير الرعاية ، واستئصال أورام MPM جراحيا التي تمت إزالتها بعد الموافقة المستنيرة.

1. إعداد وسائط هضم الورم وغيرها من الوسائط المرتبطة بها

1. لإعداد وسائط هضم الورم، أضف 5 مل من القلم / العقدية 100٪ (البنسلين / الستربتومايسين) إلى 500 مل من معهد روزويل بارك التذكاري المعقم (RPMI) 1640 وسط في غطاء التدفق الرقائقي.
   1. انقل الوسط إلى فلتر معقم بسعة 500 مل و 0.22 ميكرومتر من البولي إيثرسلفون (PES) للترشيح الفراغي.
      ملاحظة: يجب تنفيذ خطوات الترشيح والشفط بضغط فراغ قياسي يتراوح بين 75 و 150 تور.
   2. قم بتسمية وتأريخ وسط هضم الورم وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسط لمدة 1 شهر عند 4 درجات مئوية.
2. لتحضير الكوكتيل الأنزيمي المهضوم للورم، أضف 2.5 مل من 3٪ كولاجيناز من النوع 1، و 1 مل من 1.5 ملغم/مل هيالورونيداز، و 20 ميكرولتر من 250,000 وحدة/مل من الحمض النووي من 1 إلى 16.5 مل من وسط الهضم في أنبوب مخروطي 50 مل في غطاء التدفق الرقائقي.
   ملاحظة: الحجم الإجمالي للكوكتيل الأنزيمي الهضم للورم هو 20 مل. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى 10 مل فقط لكل عينة ورم. على هذا النحو ، يمكن تخزين الكوكتيل المتبقي في -20 درجة مئوية حتى الحاجة إليه. لا تقم بإعادة تجميد الأليكوت.
3. لإعداد وسط ورم كامل، أضف 5 مل من القلم / العقدية 100٪ و 50 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) إلى 500 مل من RPMI 1640 المعقم في غطاء التدفق الرقائقي.
   1. انقل الوسط إلى مرشح PES معقم 500 مل ، 0.22 ميكرومتر للترشيح الفراغي.
   2. قم بتسمية وتأريخ وسط الورم الكامل وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسط لمدة 1 شهر عند 4 درجات مئوية.
4. لإعداد وسط مصل منخفض للمجاعة، أضف 5 مل من القلم / البكتيريا العقدية بنسبة 100٪ و 5 مل من FBS إلى 500 مل من RPMI 1640 المعقم في غطاء التدفق الرقائقي.
   1. انقل الوسط إلى مرشح PES معقم 500 مل ، 0.22 ميكرومتر للترشيح الفراغي.
   2. قم بتسمية وتأريخ وسط المصل المنخفض وتخزينه على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسط لمدة 1 شهر عند 4 درجات مئوية.
5. لتحضير وسط التجميد، أضف 5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 45 مل من FBS في غطاء التدفق الرقائقي.
   1. انقل الوسط إلى مرشح PES معقم 50 مل ، 0.22 ميكرومتر للترشيح الفراغي.
   2. تسمية وتاريخ خمسة أنابيب مخروطية 15 مل.
   3. انقل 10 مل من وسط التجميد إلى كل أنبوب وخزن الأنابيب عند -20 درجة مئوية.
6. لإعداد وسط خال من المضادات الحيوية لاختبار الميكوبلازما، أضف 50 مل من FBS إلى 500 مل من RPMI 1640 المعقم في غطاء التدفق الرقائقي.
   1. انقل الوسط إلى مرشح PES معقم 50 مل ، 0.22 ميكرومتر للترشيح الفراغي.
   2. قم بتسمية وتأريخ الوسط الخالي من المضادات الحيوية وتخزينه على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسط لمدة 1 شهر عند 4 درجات مئوية.
7. لإعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لتحليل النمط الظاهري ، أضف 16.6 مل من ألبومين مصل البقر المعقم إلى 500 مل من الملح المعقم 1x المخزن بالفوسفات (PBS) في غطاء تدفق صفائحي.
   1. قم بتسمية وتأريخ المخزن المؤقت FACS وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لا يتطلب المخزن المؤقت FACS تعقيم المرشح طالما يتم تخزين كلا المكونين معقمين. يمكن تخزين المخزن المؤقت FACS قبل الفتح لمدة 6 أشهر عند 4 درجات مئوية.

2. هضم أنسجة الورم

1. انقل 10 مل من الكوكتيل الأنزيمي لهضم الورم من الخطوة 1.2 إلى أنبوب التفكك.
2. انقل قطعة أنسجة الورم إلى غطاء صفيحة معقم من 6 آبار باستخدام مشرط معقم.
   ملاحظة: كمية الوسط الذي يتم نقله مع أنسجة الورم كافية للمعالجة.
   1. قم بإزالة جميع الأنسجة الدهنية والأنسجة الميتة و / أو جلطات الدم باستخدام مشرط وملقط معقم جديد.
      ملاحظة: الأنسجة الدهنية عادة ما تكون صفراء في المظهر وشبه صلبة. الأنسجة الميتة أغمق من الأنسجة المحيطة في المظهر وناعمة جدا. سوف تتفكك كل من الأنسجة الدهنية والنخرية بسهولة. تظهر الأنسجة الدموية حمراء زاهية وقد تطلق الدم في الوسط عند التلاعب بها. بمجرد إزالته ، يجب أن يكون نسيج الورم الناتج على شكل وأن يكون شاحبا أو ورديا ، اعتمادا على نوع الأنسجة.
   2. قطع أنسجة الورم بأكملها إلى 1 مم³ شظايا صغيرة. لضمان عدم جفاف الأنسجة ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن المعقم 1x Hank's (HBSS) إلى أنسجة الورم.
3. انقل شظايا الورم إلى أنبوب التفكك الذي يحتوي على 10 مل من الكوكتيل الأنزيمي الهضام للورم (الخطوة 2.1). أغلق الأنبوب بإحكام ، وضعه على جانب الغطاء لأسفل على مفكك الأنسجة ، وأضف جهاز السخان عن طريق تطبيقه مثل الأكمام فوق أنبوب التفكك والضغط للنقر عليه في مكانه.
   ملاحظة: السعة القصوى لكل أنبوب هي 4 غرام من الورم وحجم 10 مل.
4. حدد الإعداد المبرمج مسبقا على 37C_h_TDK_1 المنفصل. تحقق من الحالة بعد 10 دقائق للتأكد من عدم وجود خطأ في الانسداد كما هو موضح في الضوء الأحمر الوامض.
   ملاحظة: يعالج هذا البرنامج عند 1865 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة مع درجة حرارة عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: في حالة حدوث انسداد ، قم بإزالة أنبوب التفكك وقم بتحريكه يدويا لإزاحة أي نسيج عالق في الغطاء ؛ ثم استبدل الأنبوب على الفاصل واستأنف البرنامج.
5. بعد عملية الهضم لمدة 1 ساعة ، قم بإزالة أنبوب التفكك وضعه في غطاء تدفق صفائحي. قم بتصفية الورم المهضوم عن طريق وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل وسحب الورم المهضوم باستخدام ماصة 10 مل على الفلتر. إذا انسد عامل التصفية، فقم بالتبديل إلى فلتر جديد.
   1. شطف أنبوب التفكك مع 10 مل من وسائط هضم الورم الطازجة وتمرير الغسيل من خلال الفلتر.
   2. قم بإزالة مرشح 70 ميكرومتر وتجاهله.
   3. ارفع الحجم الإجمالي إلى 40 مل مع وسط هضم الورم.
6. جهاز طرد مركزي على ارتفاع 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. باستخدام ماصة شفط 2 مل متصلة بمصدر فراغ ، قم بشفط السوبرناتانت دون إزعاج الكريات ، وأعد تعليق الخلايا باستخدام 10 مل من وسط الورم الكامل المعقم.
8. كرر الخطوة 2.6.
9. شفط supernatant كما هو موضح في الخطوة 2.7. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط الورم الكامل المعقم وانقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من صفيحة معقمة من 6 آبار.
10. احتفظ باللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
11. بعد 24 ساعة ، انقل الوسط المستخدم من الورم المهضوم في البئر 1 إلى بئر جديد (بئر 2) في نفس اللوحة المكونة من 6 آبار. أضف 3 مل من الورم الكامل المعقم المتوسط إلى البئر 1.
12. انقل الوسط المستخدم من البئرين 1 و 2 وادمجه في بئر 3 في نفس اللوحة المكونة من 6 آبار على مدار 24 ساعة بعد الخطوة 2.11. أضف 3 مل من وسط الورم الكامل المعقم إلى الآبار 1 و 2.
13. استنشاق الوسط من جميع الآبار الثلاثة وماصة 3 مل من وسط الورم الكامل في كل بئر 48 ساعة بعد الخطوة 2.12.

3. توليد خط الخلايا السرطانية الأولية

1. باستخدام مجهر الطور المقلوب، حدد النسبة المئوية لتلوث الخلايا الليفية في ثقافة المرور المبكر.
   ملاحظة: عادة ما تكون الخلايا الليفية طويلة وغير منتظمة ولها غشاء خلوي غير محدد بشكل جيد. تبدو رقيقة أو مسطحة على مقياس Z.
   1. إذا كان تلوث الخلايا الليفية أكبر من 20٪ من الخلايا في مزرعة المرور المبكر ، فاستمر في الزراعة بعد استبدال الوسط الكامل بوسط مصل منخفض.
   2. كرر الاستبدال بوسط مصل منخفض في الخطوة 3.1.1 مرتين في الأسبوع لمدة 3-4 أسابيع.
   3. عندما تصل الثقافة إلى 80٪ من الالتقاء ، قم بتمرير الخلايا عن طريق تقسيم 50:50 إلى 2 بئر جديدة من لوحة 6 آبار. استمر في تمرير 50:50 في وسائط المصل المنخفض بمجرد وصول الخلايا إلى التقاء بنسبة 80٪.
   4. كرر الخطوة 3.1.3 لمدة تصل إلى 4 أسابيع ، وتمر في قوارير الثقافة الأكبر حسب الحاجة عن طريق تقسيم 50:50 بمجرد وصول الثقافة إلى 80٪ من الالتقاء. إذا لم يتم تقليل عدد الخلايا الليفية إلى 10٪ أو أقل ، فاستمر في الخطوة 3.2 لمحاولة طريقة التربسين التفاضلية لإزالة تلوث الخلايا الليفية. وإلا، انتقل إلى الخطوة 3.3.
2. لإثراء الخلايا السرطانية ، اشطف البئر بلطف باستخدام 1x PBS لإزالة الوسط الذي يحتوي على المصل.
   1. أضف التربسين على النحو التالي: 1 مل لكل بئر إذا كان في لوحة من 6 آبار ، 2 مل لقارورة T25 ، 3 مل لقارورة T75.
   2. ضع الصفيحة أو القارورة المكونة من 6 آبار في حاضنة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة اللوحة أو القارورة من الحاضنة وتحقق من التصاق الخلايا باستخدام مجهر مقلوب. إذا كانت الخلايا ترفع جزئيا أو تطفو ، فقم بإزالة الخلايا المعلقة والتريبسين بلطف فقط. ضع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على حجم مساو أو أكبر من وسط الورم الكامل.
      ملاحظة: هذه المجموعة الجزئية من الخلايا القائمة على خصائص الالتصاق هي الأولى من الكسور المتعددة.
   3. كرر الخطوتين 3.2.1 و3.2.2 حتى يتم رفع كافة الخلايا، أو تتم إزالة 4 كسور.
   4. جهاز طرد مركزي لجميع الكسور المستقلة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   5. قم بشفط المادة الفائقة كما هو موضح في الخطوة 2.7 ، وأعد تعليق الخلايا باستخدام 5 مل من وسط المصل المعقم والمنخفض.
   6. قم بصفيحة الخلايا في قارورة T25 لكل جزء ووضع القوارير في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
   7. قم بتقييم الثقافة بعد 48 ساعة لتحديد الجزء الذي يتم إثراؤه للخلايا السرطانية مقابل الخلايا الليفية. تخلص من القوارير الغنية بالخلايا الليفية. إذا كان تلوث الخلايا الليفية <10٪ ، فاستمر في التوسع في وسط الورم الكامل وانتقل إلى الخطوة 4. إذا كان تلوث الخلايا الليفية 10-30٪ ، كرر الخطوات 3.1.2-3.1.4. إذا كان تلوث الخلايا الليفية أكبر من 30٪ ، فكرر الخطوات 3.2-3.2.7.
3. إذا تم الكشف عن عدد قليل من الخلايا الليفية أو لم يتم اكتشافها في مزرعة المرور المبكرة ، فاستمر في تمرير الخلايا في وسط الورم الكامل عن طريق الانقسام بنسبة 50:50 بمجرد أن تلتقي الخلايا بنسبة 80٪ في صفيحتها أو قارورتها المكونة من 6 آبار.

4. توسيع خط الخلايا السرطانية الأولية للمرور المبكر

1. بمجرد أن تحتوي ثقافة الورم الأولية على 10٪ أو أقل من تلوث الخلايا الليفية ، قم بشفط الوسط واستبدله بوسط ورم كامل معقم مرتين في الأسبوع.
   ملاحظة: الحجم المتوسط الأمثل ل T25 هو 5 مل ؛ T75 هو 12 مل. T150 هو 25 مل.
   1. مرر الثقافة بنسبة 50:50 إلى قوارير أكبر حسب الحاجة بمجرد أن تصل إلى 80٪ من الالتقاء في اللوحة أو القارورة.
      ملاحظة: قد تحتاج الثقافة إلى المرور بنسبة أعلى اعتمادا على نموها. اضبط بحيث تصل الثقافة إلى 80٪ من الالتقاء كل 3-5 أيام.
2. المرور حتى تكون الثقافة في الممر 4 أو أعلى. بمجرد أن تلتقي الثقافة بنسبة 80٪ في قوارير T75 على الأقل ، استمر في الخطوة 5.

5. توصيف وبنوك خط الخلايا السرطانية الأولية المعمول به

1. قم بحفظ قارورة T75 واحدة بالتبريد كتجميد للمرور المبكر. لاختبار الميكوبلازما لقوارير T75 المتبقية ، استمر في الخطوة 5.2.
   1. للحفظ بالتبريد للخلايا ذات المرور المبكر ، قم بإذابة أنبوب واحد من وسط التجميد المقتبس المحضر في الخطوة 1.5.
   2. جمع الخلايا عن طريق التربسين عن طريق غسل اللوحة أولا مع 1x PBS كما هو موضح في الخطوة 3.2 وإضافة التربسين كما هو موضح في الخطوة 3.2.1.
   3. ضع القارورة في حاضنة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. قم بإزالة القارورة من الحاضنة وتحقق من التصاق الخلايا باستخدام مجهر مقلوب. إذا كانت الخلايا ترفع أو تطفو ، فقم بإزالة الخلايا المعلقة والتريبسين برفق. ضع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على حجم مساو أو أكبر من وسط الورم الكامل.
      ملاحظة: إذا ظلت الخلايا ملتصقة بعد 3 دقائق، ضع القارورة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 2 دقيقة إضافية.
   4. امزج الأنبوب جيدا عن طريق السحب بلطف وإزالة 20 ميكرولتر للعد.
   5. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 500 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. أثناء دوران الخلايا ، عد باستخدام بروتوكول عد خاص بالمختبر مثل أزرق التريبان أو يوديد الأكريدين البرتقالي / البروبيديوم (AO / PI).
   7. أعد تعليق الخلايا بعد الطرد المركزي في وسط تجميد بحد أدنى 2 × 10⁶ خلايا / 1 مل وسط تجميد.
   8. انقل 1 مل من تعليق الخلية من الخطوة 5.1.7 إلى 1.5 مل من الكريوفيالات المصنفة مسبقا.
   9. ضع الكريوفيالات في غرفة تجميد ذات معدل متحكم فيه وانقلها على الفور إلى -80 درجة مئوية.
   10. تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع قبل نقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
2. قم بتقسيم قارورة T75 بنسبة 50:50 لاختبار الميكوبلازما. قم بتغيير الوسط إلى وسط خال من المضادات الحيوية تم إعداده في الخطوة 1.6.
   1. بعد 72 ساعة ، قم بإذابة كاشف الكشف عن الميكوبلازما والركيزة وعناصر التحكم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل الاختبار.
   2. جمع 1 مل من supernatant من كل ثقافة ليتم اختبارها ووضعها في أنبوب مخروطي 15 مل.
   3. قم بتكوير أي خلايا معلقة عن طريق الطرد المركزي للجهاز الفائق عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. قم بتحميل 100 ميكرولتر من عينات المواد الفائقة وعناصر التحكم في لوحة بيضاء ذات 96 بئرا. أضف 100 ميكرولتر من كاشف الكشف عن الميكوبلازما إلى كل عينة والتحكم.
   5. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. ضع اللوحة في قارئ لوحة واقرأ التلألؤ (القراءة A ، أي القراءة الأولى).
      ملاحظة: يشير بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة الميكوبلازما إلى الاحتفاظ بالإعدادات الافتراضية على قارئات اللوحات متعددة الوظائف. يتم تعيين القراءة عند نقطة نهاية التلألؤ مع وقت تكامل قدره 1 ثانية وكسب 135. يستخدم قارئ اللوحات روتين القياس التلقائي لتحسين إشارة الكسب لكل تجربة. وقت التكامل 1 ثانية هو الافتراضي القياسي. يستخدم كلا الإعدادين لضبط شدة الإشارة المضيئة التي يفسرها قارئ الألواح وقد تحتاج إلى تعديلها اعتمادا على قارئ اللوحة الفردي.
   7. قم بإزالة اللوحة من قارئ الألواح وأضف 100 ميكرولتر من ركيزة الكشف عن الميكوبلازما إلى كل عينة وعناصر التحكم.
   8. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   9. ضع اللوحة في قارئ اللوحة واقرأ التلألؤ (القراءة B ، أي القراءة الثانية).
   10. لتحديد إيجابية الميكوبلازما ، أوجد نسبة القراءة B إلى القراءة A.
       ملاحظة: يتم وصف نسب إيجابية الميكوبلازما في بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة الميكوبلازما. يتم الحصول على القراءات A و B بنفس الإعدادات وتعكس ببساطة ترتيب القراءة.
       1. ضع في اعتبارك أن النسبة < 1 تكون سلبية الميكوبلازما.
       2. ضع في اعتبارك أن نسبة 1-1.2 غير حاسمة وكرر الخطوة 5.2.
       3. النظر في نسبة > 1.2 لتكون إيجابية الميكوبلازما ومراقبة هذه الثقافة ؛ إنهاء الثقافة إذا لزم الأمر.
3. توصيف التدفق الخلوي للخلايا السرطانية سالبة الميكوبلازما
   1. إزاحة الخلايا السرطانية باستخدام المخزن المؤقت لتفكك الخلايا.
   2. عد الخلايا وأعد تعليق الخلايا عند 1 × 10⁶/mL في المخزن المؤقت FACS من الخطوة 1.7.
   3. قم بإزالة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا في أنابيب فردية لتلطيخ السطح.
   4. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   5. استنشاق مستقبلات Fc الفائقة وكتلتها عن طريق احتضان الخلايا في 500 ميكرولتر من مصل الماعز بنسبة 5٪ في مخزن FACS المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
   6. أضف 2 مل من المخزن المؤقت FACS وقم بالطرد المركزي للتعليق عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   7. شفط السوبرناتانت وإضافة مزيج البقع السطحية من الأجسام المضادة (الجدول 1) والمخزن المؤقت FACS بحيث يكون الحجم النهائي 100 ميكرولتر.
   8. كرر الخطوة 5.3.6.
   9. شفط supernatant وإصلاح الخلايا عن طريق تعليق في 200 ميكرولتر من 1 ٪ paraformaldehyde (PFA) بالإضافة إلى 0.25 ٪ EtOH. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع العينات المحمية من الضوء.
   10. كرر الخطوة 5.3.6. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS للحصول عليها باستخدام مقياس التدفق الخلوي المناسب.
       ملاحظة: من المتوقع أن تكون الخلايا السرطانية في ورم المتوسطة إيجابية للميزوثيلين و N-cadherin. قد يعبر البعض أيضا عن CD90.
4. توسع في وسط الورم الكامل والبنك كما هو موضح في الخطوتين 4.1 و 5.1 ، على التوالي.

النتائج

لتحديد تلوث الخلايا الليفية لمزارع المرور المبكر ، يتم تقييم الخلايا باستخدام مجهر الطور المقلوب لتحديد تواتر الخلايا الليفية بالنسبة للخلايا الملتصقة الأخرى الموجودة. يوضح الشكل 1 أمثلة على زيادة تلوث الخلايا الليفية بنسبة 80٪ (الشكل 1A) و 50٪ (الشكل 1B) و 30٪ (الشكل 1C) ، مقارنة...

Discussion

في حين أن هذا البروتوكول واضح ، إلا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب اتباعها عن كثب. يعد تجميد المرور المبكر مهما للحفاظ على القدرة على تكرار عملية إثراء الخلايا السرطانية إذا لم تنجح في البداية. تعد القدرة على تقييم تلوث الخلايا الليفية بالعين لتحديد تقنية الانقسام الصحيح وتجويع الوس...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML