JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة كيفية الاستخدام الفعال لثلاث منصات لمعالجة cryo-EM ، أي cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 ، لإنشاء سير عمل واحد وقوي ينطبق على مجموعة متنوعة من مجموعات بيانات الجسيمات المفردة لتحديد بنية عالية الدقة.

Abstract

جعلت التطورات الحديثة في كل من الأجهزة وبرامج معالجة الصور المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) الطريقة المفضلة لعلماء الأحياء الهيكلية لتحديد الهياكل عالية الدقة لمجموعة واسعة من الجزيئات الكبيرة. تتوفر مجموعات برامج متعددة للمستخدمين الجدد والخبراء لمعالجة الصور وحساب الهيكل ، مما يبسط نفس سير العمل الأساسي: تخضع الأفلام التي يتم الحصول عليها بواسطة كاشفات المجهر للتصحيح لتقدير وظيفة الحركة ونقل التباين (CTF) الناجم عن الحزمة. بعد ذلك ، يتم اختيار صور الجسيمات واستخراجها من إطارات الأفلام المتوسطة للتصنيف التكراري 2D و 3D ، تليها إعادة البناء ثلاثية الأبعاد والصقل والتحقق من الصحة. نظرا لأن حزم البرامج المختلفة تستخدم خوارزميات مختلفة وتتطلب مستويات مختلفة من الخبرة للعمل ، فإن خرائط 3D التي تولدها غالبا ما تختلف في الجودة والدقة. وبالتالي ، يقوم المستخدمون بنقل البيانات بانتظام بين مجموعة متنوعة من البرامج للحصول على أفضل النتائج. توفر هذه الورقة دليلا للمستخدمين للتنقل في سير العمل عبر حزم البرامج الشائعة: cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 للحصول على بنية دقة شبه ذرية للفيروس المرتبط بالغدة الدرقية (AAV). نقوم أولا بتفصيل خط أنابيب معالجة الصور باستخدام cryoSPARC v3 ، حيث تسمح خوارزمياته الفعالة وواجهة المستخدم الرسومية سهلة الاستخدام للمستخدمين بالوصول بسرعة إلى خريطة ثلاثية الأبعاد. في الخطوة التالية ، نستخدم PyEM والبرامج النصية الداخلية لتحويل ونقل إحداثيات الجسيمات من أفضل جودة لإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها في cryoSPARC v3 إلى RELION-3 و Scipion 3 وإعادة حساب الخرائط ثلاثية الأبعاد. وأخيرا، نحدد خطوات لمزيد من التحسين والتحقق من صحة الهياكل الناتجة من خلال دمج خوارزميات من RELION-3 و Scipion 3. في هذه المقالة ، نصف كيفية الاستخدام الفعال لثلاث منصات معالجة لإنشاء سير عمل واحد وقوي ينطبق على مجموعة متنوعة من مجموعات البيانات لتحديد الهيكل عالي الدقة.

Introduction

يتيح الفحص المجهري الإلكتروني المبرد (cryo-EM) وتحليل الجسيمات المفردة (SPA) تحديد بنية مجموعة واسعة من التجمعات الجزيئية الحيوية في حالتها المائية ، مما يساعد على إلقاء الضوء على أدوار هذه الجزيئات الكبيرة بالتفصيل الذري. جعلت التحسينات في بصريات المجهر وأجهزة الكمبيوتر وبرامج معالجة الصور من الممكن تحديد هياكل الجزيئات الحيوية بدقة تتجاوز 2 Å1,2,3. تم إيداع أكثر من 2,300 هيكل من هياكل التبريد EM في بنك بيانات البروتين (PDB) في عام 2020 ، مقارنة ب 192 بنية في عام 20144 ، مما يشير إلى أن cryo-EM أصبح الطريقة المفضلة للعديد من علماء الأحياء الهيكلية. هنا ، نصف سير عمل يجمع بين ثلاثة برامج SPA مختلفة لتحديد بنية عالية الدقة (الشكل 1).

الهدف من SPA هو إعادة بناء أحجام 3D من عينة مستهدفة من صور 2D صاخبة مسجلة بواسطة كاشف المجهر. تجمع أجهزة الكشف الصور كأفلام ذات إطارات فردية من نفس مجال الرؤية. من أجل الحفاظ على العينة ، يتم جمع الإطارات بجرعة إلكترون منخفضة وبالتالي يكون لها نسبة إشارة إلى ضوضاء ضعيفة (SNR). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي التعرض للإلكترون إلى تحفيز الحركة داخل شبكات التبريد EM المزججة، مما يؤدي إلى عدم وضوح الصورة. للتغلب على هذه المشكلات ، تتم محاذاة الإطارات لتصحيح الحركة التي يسببها الشعاع ومتوسطها لإنتاج ميكروغراف مع زيادة SNR. ثم تخضع هذه المجهر لتقدير دالة نقل التباين (CTF) لحساب آثار عدم التركيز البؤري والانحرافات التي يفرضها المجهر. من الصور المجهرية المصححة بواسطة CTF ، يتم اختيار الجسيمات الفردية واستخراجها وفرزها في متوسطات فئة 2D تمثل اتجاهات مختلفة اعتمدتها العينة في الجليد الزجاجي. يتم استخدام مجموعة الجسيمات المتجانسة الناتجة كمدخلات لإعادة بناء ab initio 3D لإنشاء نموذج أو نماذج خشنة ، والتي يتم تكريرها بعد ذلك بشكل متكرر لإنتاج واحد أو أكثر من الهياكل عالية الدقة. بعد إعادة الإعمار، يتم إجراء تحسينات هيكلية لزيادة تحسين جودة ودقة خريطة cryo-EM. وأخيرا، إما أن يكون النموذج الذري مشتقا مباشرة من الخريطة، أو أن الخريطة مزودة بإحداثيات ذرية تم الحصول عليها في مكان آخر.

تتوفر حزم برامج مختلفة لإنجاز المهام الموضحة أعلاه ، بما في ذلك Appion5 و cisTEM6 و cryoSPARC7 و EMAN8 و IMAGIC9 و RELION10 و Scipion11 و SPIDER12 و Xmipp13 وغيرها. في حين أن هذه البرامج تتبع خطوات معالجة مماثلة، فإنها تستخدم خوارزميات مختلفة، على سبيل المثال، لاختيار الجسيمات، وإنشاء نماذج أولية، وتحسين عمليات إعادة البناء. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب هذه البرامج مستوى متفاوتا من معرفة المستخدم والتدخل للعمل ، حيث يعتمد بعضها على ضبط المعلمات التي يمكن أن تكون بمثابة عقبة أمام المستخدمين الجدد. وغالبا ما تؤدي هذه التناقضات إلى خرائط ذات جودة ودقة غير متناسقتين عبر المنصات14، مما يدفع العديد من الباحثين إلى استخدام حزم برامج متعددة لتحسين النتائج والتحقق من صحتها. في هذه المقالة ، نسلط الضوء على استخدام cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ل AAV ، وهو ناقل يستخدم على نطاق واسع للعلاج الجيني 15. حزم البرامج المذكورة أعلاه مجانية للمستخدمين الأكاديميين. يتطلب cryoSPARC v3 و Scipion 3 تراخيص.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إنشاء مشروع cryoSPARC v3 جديد واستيراد البيانات

ملاحظة: تم الحصول على البيانات في جامعة أوريغون للصحة والعلوم (OHSU) في بورتلاند باستخدام مجهر إلكتروني تيتان كريوس بقوة 300 كيلو فولت مجهز بكاشف إلكترون مباشر من طراز فالكون 3. تم جمع الصور في وضع العد بجرعة إجمالية قدرها 28.38 e− / Å2 مجزأة عبر 129 إطارا ، ونطاق إلغاء التركيز من -0.5 ميكرومتر إلى -2.5 ميكرومتر ، بحجم بكسل 1.045 Å باستخدام EPU. تم تقديم عينة من AAV-DJ من قبل موظفي OHSU.

  1. افتح cryoSPARC v3 في مستعرض ويب وانقر فوق رأس المشاريع . حدد + إضافة لإنشاء مشروع جديد. قم بتسمية المشروع وفقا لذلك وتوفير مسار إلى دليل موجود حيث سيتم حفظ الوظائف والبيانات.
  2. قم بإنشاء مساحة عمل للمشروع عن طريق فتح المشروع والنقر فوق + إضافة وتحديد مساحة عمل جديدة. قم بتسمية مساحة العمل وانقر على إنشاء.
  3. انتقل إلى مساحة العمل الجديدة وافتح منشئ الوظائف على اللوحة اليمنى. تعرض علامة التبويب هذه جميع الوظائف المتوفرة في cryoSPARC v3. انقر فوق استيراد الأفلام وقم بتوفير مسار الأفلام ، واحصل على مسار ملف مرجعي ، وقم بتعيين معلمات الاكتساب على النحو التالي: حجم Raw Pixel 1.045 Å ، تسريع الجهد 300 kV ، الانحراف الكروي 2.7 مم ، إجمالي جرعة التعرض 28.38 e-/Å^2.
  4. انقر فوق قائمة الانتظار ، وحدد مسارا لتشغيل المهمة ومساحة عمل ، وانقر فوق إنشاء.
    ملاحظة: تعتمد معلمات الاقتناء على العينة والمجهر.

2. CryoSPARC v3 - محاذاة الفيلم وتقدير CTF

  1. افتح تصحيح حركة التصحيح (متعدد). تتطلب هذه المهمة الأفلام المستوردة في الخطوة 1.3 كإدخال. افتح بطاقة مهمة استيراد الأفلام في مساحة العمل واسحب مخرجات Imported_movies إلى العنصر النائب للأفلام في المهمة الجديدة. قم بانتظار الوظيفة.
    ملاحظة: لمزيد من المعلومات حول أساليب cryoSPARC الموضحة في هذه المقالة، راجع البرنامج التعليمي cryoSPARC16.
  2. لإجراء تقدير CTF، افتح تقدير CTF التصحيح (متعدد). أدخل الصور المجهرية التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.1 وقم بانتظار المهمة.
  3. لفحص الصور المجهرية المتوسطة والمصححة بواسطة CTF وتحديد مجموعة فرعية لمزيد من المعالجة، افتح تعرضات Curate وأدخل التعرضات التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2. قم بانتظار الوظيفة.
  4. بعد دخول المهمة في وضع الانتظار ، انقر فوق علامة التبويب التفاعل على بطاقة المهمة ، واضبط عتبات المعلمات ، واقبل أو رفض الرسوم البيانية الدقيقة الفردية لمزيد من المعالجة. اقبل الصور المجهرية ذات CTFs المقدرة والتجريبية المتطابقة جيدا (الشكل 2) وتخلص من تلك التي تحتوي على استجماتيزم مرتفع ، وملاءمة CTF ضعيفة ، وجليد سميك.
  5. أثناء معالجة البيانات الحالية ، اضبط العتبة العليا للاستجماتيزم على 400 Å ، ودقة تناسب CTF على 5 Å ، وسماكة الجليد النسبية على 2. انقر فوق تم لتحديد المصورات للمعالجة النهائية.

3. CryoSPARC v3 - انتقاء الجسيمات اليدوي والقائم على القالب

  1. افتح المنتقي اليدوي، وأدخل التعرضات المقبولة من الخطوات 2.4 إلى 2.5، ثم قم بانتظار المهمة. انقر فوق علامة التبويب تفاعلية ، واضبط حجم الصندوق (px) على 300 ، وانقر فوق بضع مئات من الجسيمات عبر صور مجهرية متعددة وتجنب اختيار الجسيمات المتداخلة. هنا ، تم اختيار 340 جسيما عبر 29 ميكروغرافا. عند الانتهاء ، انقر فوق تم الانتقاء! استخراج الجسيمات.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول الانتقاء اليدوي للجسيمات لإنشاء قوالب للتحديد التلقائي. ومع ذلك ، تتوفر طرق أخرى أيضا17.
  2. لإنشاء قوالب لاختيار الجسيمات آليا ، انقر فوق تصنيف 2D وأدخل مختارات الجسيمات التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.1. تغيير عدد فئات 2D إلى 10 وقائمة انتظار المهمة.
  3. افتح تحديد فئات 2D. أدخل الجسيمات ومتوسطات الفئات التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2 وانقر فوق علامة التبويب تفاعلية . حدد فصول 2D التمثيلية مع SNR جيدة وانقر على تم.
    ملاحظة: تعكس متوسطات الفئة طرق عرض جسيمات مختلفة. حدد متوسطات الفئات التي تعكس كل طريقة عرض. الهدف هو إنتاج قوالب محددة جيدا تمثل وجهات نظر مختلفة للعينة للانتقاء الآلي.
  4. افتح منتقي القوالب وأدخل الفئات ثنائية الأبعاد المحددة في الخطوة 3.3 والرسوم البيانية المجهرية من الخطوات 2.4-2.5. اضبط قطر الجسيمات (Å) على 220 Å وقم بانتظار المهمة.
  5. لفحص الاختيارات التلقائية، افتح Select Particle Picks، وأدخل الجسيمات والصور المجهرية التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.4، وقم بانتظار المهمة.
  6. في بطاقة مهمة تحديد اختيارات الجسيمات، انقر فوق علامة التبويب تفاعلية واضبط حجم الصندوق (px) على 300. انقر فوق مجهر فردي ، واضبط مرشح الممر المنخفض حتى تصبح الجسيمات مرئية بوضوح ، واضبط عتبة الارتباط المتقاطع العادي (NCC) على 0.41 وعتبة الطاقة بين 54000 و 227300 .
  7. افحص العديد من الصور المجهرية ، وإذا لزم الأمر ، اضبط العتبات بحيث يتم اختيار معظم الجسيمات دون تضمين إيجابيات خاطئة. عند الانتهاء، انقر فوق تم الانتقاء! استخراج الجسيمات.
    ملاحظة: عادة ما يكون للجسيمات الحقيقية درجة عالية من NCC والطاقة، مما يشير إلى أنها تشبه القالب ولها SNR عالية، على التوالي.
  8. افتح المستخلص من الميكروجرافات وأدخل الصور المجهرية والجسيمات من الخطوة 3.7. اضبط حجم المربع المستخرج (px) على 300 وقم بانتظار المهمة.

4. CryoSPARC v3 - تصنيف ثنائي الأبعاد

  1. انقر فوق تصنيف 2D وأدخل الجسيمات المستخرجة من الخطوة 3.8. تعيين عدد فئات 2D إلى 50 وقائمة انتظار المهمة.
  2. لتحديد أفضل فئات 2D لمزيد من المعالجة، افتح تحديد فئات 2D. أدخل الجسيمات ومتوسطات الفئة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.1. انقر فوق علامة التبويب تفاعلية واختر فئات ثنائية الأبعاد بناء على الدقة وعدد الجسيمات في الفئة (الشكل 3). لا تحدد الفئات التي تحتوي على القطع الأثرية. بعد التحديد ، انقر فوق تم.
    ملاحظة: عادة ، هناك حاجة إلى جولات متعددة من التصنيف 2D لإزالة الجسيمات ، التي لا تتلاقى في فئات متميزة ومحددة جيدا. قم بتشغيل أكبر عدد ممكن من جولات التصنيف ثنائي الأبعاد حسب الحاجة لإزالة هذه الجسيمات من مجموعة البيانات (الشكل 3).

5. CryoSPARC v3 - إعادة بناء البداية والصقل المتجانس

  1. لإنشاء وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد أولية ، افتح Ab-initio Reconstruction وأدخل الجسيمات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.2 أو من التصنيف النهائي ثنائي الأبعاد. ضبط التماثل إلى icosahedral. قم بانتظار الوظيفة.
    ملاحظة: يعتمد التماثل على العينة ويجب تغييره وفقا لذلك. إذا لم يكن معروفا، فاستخدم تناظر C1.
  2. فتح صقل متجانس. أدخل الحجم من الخطوة 5.1 والجسيمات من 4.2 أو التصنيف النهائي ثنائي الأبعاد. تغيير التماثل ووضع المهمة في قائمة الانتظار . عند الانتهاء من المهمة، افحص منحنى ارتباط Fourier Shell (FSC) وقم بتنزيل وحدة التخزين لفحصها في UCSF Chimera18.

6. تصدير إحداثيات الجسيمات من cryoSPARC v3 واستيرادها إلى RELION-3 باستخدام PyEM

ملاحظة: تحمل إحداثيات الجسيمات معلومات حول موقع الجسيمات الفردية في كل ميكروغراف. يسمح نقل الإحداثيات بدلا من مكدسات الجسيمات إلى RELION-3 بتشغيل خطوات التحسين التي لن تكون متاحة بخلاف ذلك. على سبيل المثال، يتطلب تلميع الجسيمات الوصول إلى إطارات الأفلام الأولية. وبالتالي ، قبل تصدير إحداثيات الجسيمات من cryoSPARC v3 إلى RELION-3 ، قم باستيراد الأفلام وإجراء تصحيح الحركة وتقدير CTF في RELION-3. راجع البرنامج التعليمي RELION-319 للحصول على التفاصيل.

  1. انتقل إلى دليل مشروع RELION-3 وقم بتشغيل RELION-3.
  2. افتح استيراد من المستعرض من نوع المهمة وحدد المسار إلى الأفلام ومعلمات الاكتساب كما في الخطوة 1.3.
  3. لإجراء تصحيح الحركة، استخدم UCSF MotionCor220 من خلال واجهة المستخدم الرسومية RELION-3، وافتح تصحيح الحركة واضبط المعلمات الافتراضية كما هو الحال في دليل UCSF MotionCor2222. أدخل المسار إلى الأفلام المستوردة في الخطوة 6.2. على علامة التبويب الحركة، حدد المسار إلى motioncor2 القابل للتنفيذ.
    ملاحظة: يمكن تشغيل MotionCor2 بالتوازي باستخدام وحدات معالجة رسومات متعددة.
  4. قم بإجراء تقدير CTF باستخدام CTFFIND-4.122 من خلال واجهة المستخدم الرسومية RELION-3. افتح تقدير CTF وأدخل micrographs.star الذي تم إنشاؤه في الخطوة 6.3. في علامة التبويب CTFFIND-4.1 ، حدد المسار إلى CTFFIND-4.1 القابل للتنفيذ وتعيين المعلمات كما هو الحال في البرنامج التعليمي RELION-3.1 19.
  5. من أجل استيراد مكدسات الجسيمات من cryoSPARC v3 إلى RELION-3 ، يجب أولا تصديرها من cryoSPARC v3. في cryoSPARC v3، افتح بطاقة المهمة الخاصة بمهمة فئة Select 2D من الخطوة 4.2 أو التصنيف النهائي ثنائي الأبعاد. في علامة التبويب التفاصيل ، انقر فوق تصدير المهمة. تصدير مهمة إخراج ملف particles_exported.cs.
  6. قبل استيراد إحداثيات الجسيمات من cryoSPARC v3 إلى RELION-3، يجب تحويل ملف particles_exported.cs من الخطوة 6.5 إلى تنسيق .star. باستخدام PyEM23 تحويل ملف particles_exported.cs إلى تنسيق .star عن طريق تنفيذ الأمر التالي: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. في RELION-3 ، انقر فوق علامة التبويب الانتقاء اليدوي وعلى علامة التبويب الإدخال / الإخراج ، أدخل الصور المجهرية من تحسين CTF الموضح في الخطوة 6.4. في علامة التبويب عرض، أدخل المعلمات التالية: قطر الجسيمات (A): 220، مرشح الممر المنخفض (A): -1، مقياس لصورة CTF: 0.5. قم بتشغيل المهمة. يتم إنشاء دليل يسمى ManualPick في المجلد الرئيسي RELION-3.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإنشاء بنية مجلد اختيار يدوي في RELION-3. أثناء تشغيل الانتقاء اليدوي، يتم إنشاء ملف .star واحد يحتوي على إحداثيات الجسيمات المنتقاة لكل ميكروغراف متوسط يستخدم للانتقاء في واجهة المستخدم الرسومية RELION-3.
  8. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على ملف particles_exported.star من الخطوة 6.6 وقم بتشغيل برنامج نصي مكتوب في المنزل ينتج ملف manualpick.star واحد لكل رسم مجهري متوسط يستخدم لاختيار جسيمات cryo-SPARC v3 ، مما ساهم في التصنيف ثنائي الأبعاد النهائي الذي تم تصديره في الخطوة 6.5. يتم حفظ ملفات الإحداثيات الناتجة في المجلد ManualPick/Movies.
  9. ارجع إلى RELION-3 وأعد فتح مهمة الانتقاء اليدوي . انقر على متابعة. سيعرض هذا الجسيمات التي تم اختيارها مسبقا في cryoSPARC v3 في واجهة المستخدم الرسومية RELION-3. افحص بعض الصور المجهرية للتحقق مما إذا كان نقل إحداثيات الجسيمات قد تم إنجازه وما إذا كانت الجسيمات قد تم اختيارها بشكل صحيح.

7. RELION-3 - استخراج الجسيمات والتصنيف ثنائي الأبعاد

  1. انقر على استخراج الجسيمات. في علامة التبويب إدخال /إخراج ، أدخل CTF تصحيح micrographs من الخطوة 6.4 والإحداثيات من الخطوة 6.9. انقر فوق علامة التبويب استخراج وقم بتغيير حجم مربع الجسيمات (pix) إلى 300. قم بتشغيل المهمة.
  2. قم بإجراء تصنيف ثنائي الأبعاد لزيادة تنظيف مجموعة الجسيمات التي تم إنشاؤها في cryoSPARC v3 لتحقيق إعادة بناء عالية الدقة. انقر فوق تصنيف 2D وعلى علامة التبويب الإدخال / الإخراج ، أدخل ملف particles.star الذي تم إنشاؤه في الخطوة 7.1. في علامة التبويب تحسين ، اضبط عدد الفئات على 50 وقطر القناع (A) على 280. قم بتشغيل المهمة.
    ملاحظة: يجب أن يشمل القناع الجسيم بأكمله.
  3. لاختيار أفضل فئات ثنائية الأبعاد ، انقر فوق طريقة تحديد المجموعة الفرعية ، وأدخل ملف _model.star من الخطوة 7.2 ، وقم بتشغيل المهمة. حدد الفئات كما هو موضح في الخطوة 4.2.
  4. كرر الخطوتين 7.2 و7.3 لإزالة الجسيمات غير المتقاربة.

8. RELION-3 - الصقل ثلاثي الأبعاد ، وإنشاء القناع ، وما بعد المعالجة

  1. استخدم الخريطة التي تم إنشاؤها في cryoSPARC v3 (الخطوة 5.2) كنموذج أولي للتحسين ثلاثي الأبعاد في RELION-3. حدد طريقة الاستيراد وقم بتعيين المعلمات التالية في علامة التبويب إدخال/إخراج: استيراد أفلام خام/ميكروغرافات: لا، ملفات إدخال خام: أفلام/*.mrc.
  2. قم بتوفير ملف MTF وأدخل معلمات الحصول على الفيلم كما هو موضح في الخطوة 1.3. في علامة التبويب أخرى ، حدد خريطة cryoSPARC v3 كملف إدخال، وقم بتغيير نوع العقدة إلى مرجع ثلاثي الأبعاد (.mrc)، ثم قم بتشغيل المهمة.
  3. حدد 3D Auto-Refine وعلى علامة التبويب إدخال/إخراج، قم بتعيين صور الإدخال كملف particles.star من الخطوة 7.3 أو مهمة التحديد الأخيرة. قم بإعطاء إعادة بناء cryoSPARC v3 كخريطة مرجعية. انقر فوق علامة التبويب مرجع وقم بتغيير مرشح التمرير المنخفض الأولي (Å) إلى 50 والتماثل إلى icosahedral. في علامة التبويب تحسين، قم بتغيير قطر القناع (Å) إلى 280 وقم بتشغيل المهمة.
  4. بعد الانتهاء من الجري ، افتح run_class001.mrc في UCSF Chimera.
  5. في UCSF Chimera ، انقر فوق أدوات وضمن بيانات الحجم ، حدد عارض مستوى الصوت. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة جديدة لضبط إعدادات مستوى الصوت. قم بتغيير الخطوة إلى 1 واضبط شريط التمرير حتى تصل إلى قيمة المستوى حيث لا تحتوي الخريطة على ضوضاء. سجل هذه القيمة، حيث سيتم استخدامها لإنشاء قناع في الخطوة التالية.
  6. لا تعكس الخريطة الناتجة عن التحسين التلقائي FSC الحقيقي ، حيث أن الضوضاء الصادرة عن المذيب المحيط تقلل من الدقة. قبل المعالجة اللاحقة ، قم بإنشاء قناع لتمييز العينة عن منطقة المذيبات.
    1. انقر فوق إنشاء قناع وإدخال run_class001.mrc من الخطوة 8.3.
    2. انقر فوق علامة التبويب قناع واضبط المعلمات على النحو التالي: خريطة مرشح الممر المنخفض (Å): 10 ، حجم البكسل (Å): 1.045 ، عتبة Binarization الأولية: قيمة المستوى التي تم الحصول عليها في الخطوة 8.5 ، توسيع الخريطة الثنائية هذا العدد الكبير من وحدات البكسل: 3 ، وإضافة حافة ناعمة من هذا العدد الكبير من وحدات البكسل: 3. قم بتشغيل المهمة.
  7. افحص القناع في UCSF Chimera. إذا كان القناع ضيقا جدا، فقم بزيادة توسيع الخريطة الثنائية بهذا العدد الكبير من وحدات البكسل و/أو أضف حافة ناعمة من هذا العدد الكبير من وحدات البكسل. من المهم إنشاء قناع بحواف ناعمة ، لأن القناع الحاد قد يؤدي إلى الإفراط في التركيب.
  8. انقر فوق ما بعد المعالجة وعلى علامة التبويب الإدخال / الإخراج ، أدخل الخرائط النصفية التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.3 وقناع من 8.6. اضبط حجم البكسل المعاير على 1.045 Å. في علامة التبويب شحذ، أدخل ما يلي: تقدير العامل B تلقائيا؟: نعم، أدنى دقة ل Auto-B Fit (A): 10، استخدم عامل B الخاص بك؟: لا. في علامة التبويب تصفية، قم بتعيين تخطي FSC-Weighting؟ إلى لا.

9. RELION-3 - التدريب على التلميع وتلميع الجسيمات

  1. قبل تصحيح الحركة التي يسببها شعاع الجسيمات، استخدم أولا وضع التدريب لتحديد مسارات الحركة المثلى لمجموعة البيانات. افتح تلميع Bayesian وعلى علامة التبويب إدخال/إخراج ، أدخل الصور المجهرية المصححة للحركة من الخطوة 6.3 والجسيمات من الخطوة 8.3 وملف .star بعد العملية من الخطوة 8.8. انقر فوق علامة التبويب تدريب وقم بتعيين المعلمات التالية: تدريب المعلمات المثلى : نعم ، جزء من Fourier Pixels للاختبار: 0.5 ، استخدم هذا العدد الكبير من الجسيمات: 5000. قم بتشغيل المهمة.
    ملاحظة: سينتج هذا البرنامج النصي ملف opt_params_all_groups.txt في المجلد RELION-3 Polish الذي يحتوي على معلمات تلميع محسنة مطلوبة لتنفيذ الخطوة التالية.
  2. بمجرد الانتهاء من مهمة التدريب ، انقر فوق تلميع بايزيان. انقر فوق علامة التبويب التدريب واضبط معلمات القطار الأمثل؟ إلى لا. حدد علامة التبويب البولندية وفي ملف المعلمة المحسن حدد المسار إلى ملف opt_params_all_groups.txt من الخطوة 9.1. انقر فوق تشغيل.
  3. كرر الصقل ثلاثي الأبعاد (الخطوة 8.3) وما بعد المعالجة (الخطوة 8.8) مع مجموعة من الجسيمات المصقولة.

10. RELION-3 - CTF وتحسينات لكل جسيم

  1. لتقدير انحرافات الترتيب الأعلى، افتح تحسين CTF ، وفي علامة التبويب إدخال/إخراج ضمن الجسيمات، حدد المسار إلى ملف .star الذي يحتوي على جزيئات مصقولة من مهمة Refine 3D الأخيرة (run_data.star).
    1. ضمن ملف نجمة ما بعد العملية، قم بتعيين المسار إلى الإخراج من أحدث مهمة ما بعد المعالجة (الخطوة 9.3).
    2. حدد علامة التبويب احتواء وقم بتعيين المعلمات التالية: تقدير (تكبير متباين الخواص): لا، إجراء تركيب معلمة CTF؟ لا ، تقدير Beamtilt: نعم ، أيضا تقدير Trefoil؟ نعم ، تقدير 4th ترتيب الانحرافات؟ نعم. قم بتشغيل المهمة.
  2. كرر الخطوة 10.1 باستخدام جسيمات الإدخال (من Refine3D) التي تم إنشاؤها في المهمة السابقة (particles_ctf_refine.star). في علامة التبويب ملائمة ، قم بتغيير التقدير (التكبير غير المتجانس) إلى نعم وقم بتشغيل المهمة.
  3. كرر الخطوة 10.2 باستخدام جسيمات الإدخال (من Refine3D) المنتجة في المهمة السابقة (particles_ctf_refine.star). في علامة التبويب Fit ، قم بتعيين المعلمات التالية: تقدير (التكبير غير المتجانس): لا ، إجراء تركيب معلمة CTF؟: نعم ، Fit Defocus?: لكل جسيم ، Fit Astigmatism؟ لكل مجهر ، تناسب B-factor؟: لا ، تناسب المرحلة التحول: لا ، تقدير Beamtilt؟: لا ، تقدير انحرافات الترتيب 4th؟: لا.
    ملاحظة: نظرا لأن الجسيم يحتوي على تباين كاف، يمكن تعيين علامة التبويب Fit Astigmatism؟ إلى كل جسيم. بالنسبة لمجموعة البيانات هذه، لم يؤد تحسين الاستجماتيزم لكل جسيم إلى تحسين جودة الخريطة ودقتها.
  4. كرر الصقل ثلاثي الأبعاد مع الجسيمات من الخطوة 10.3 وفي علامة التبويب الإدخال / الإخراج ، اضبط استخدام FSCs المسطحة بالمذيبات؟ إلى نعم. عند الانتهاء من التشغيل، قم بتنفيذ مهمة ما بعد المعالجة (الخطوة 8.8) وفحص الخريطة في UCSF Chimera (الخطوة 5.2).

11. نقل إحداثيات جسيمات RELION-3 وخريطة ثلاثية الأبعاد إلى Scipion 3

  1. لمزيد من التحسين والتحقق من صحة خريطة RELION-3، قم أولا باستيراد الحجم والجزيئات من آخر مهمة ما بعد المعالجة (الخطوة 10.4) إلى Scipion 3. قم بتشغيل Scipion 3 وإنشاء مشروع جديد.
  2. في لوحة البروتوكولات اليمنى، حدد القائمة المنسدلة الواردات وانقر على استيراد الجسيمات. تغيير المعلمات التالية: استيراد من: RELION-3، ملف النجمة: postprocess.star، وتحديد معلمات الاستحواذ كما في الخطوة 1.3. انقر على تنفيذ.
  3. انقر على القائمة المنسدلة واردات وحدد استيراد مجلدات. ضمن استيراد من إعطاء المسار إلى خريطة RELION-3. تغيير حجم البكسل (معدل أخذ العينات) Å/px إلى 1.045 والتنفيذ.

12. Scipion 3 - عالية الدقة - صقل

  1. أولا، قم بإجراء محاذاة شاملة. حدد القائمة المنسدلة تنقيح في لوحة البروتوكولات وانقر على Xmipp3 - highres24. أدخل الجسيمات والأحجام المستوردة من الخطوتين 11.2 و11.3 كصور كاملة الحجم ووحدات تخزين أولية، على التوالي واضبط مجموعة التماثل على icosahedral. على علامة التبويب محاذاة الصورة ضمن تعيين زاوي، اختر عمومي واضبط الحد الأقصى لدقة الهدف على 3 Å، ثم قم بتشغيل المهمة.
  2. عند الانتهاء من المهمة ، انقر فوق تحليل النتائج. في النافذة الجديدة ، انقر فوق رمز UCSF Chimera لفحص مستوى الصوت المكرر. بالإضافة إلى ذلك ، انقر فوق مخططات دقة العرض ( FSC) لمعرفة كيفية تغير FSC بعد التحسين ، بالإضافة إلى الرسم البياني للرسم مع التغييرات الزاوية لمعرفة ما إذا كانت تعيينات زاوية أويلر قد تغيرت.
    ملاحظة: استنادا إلى دقة بنية RELION-3 المدخلة، قد تتكرر هذه الخطوة عدة مرات بقيم مختلفة تم تعيينها لدقة الهدف الأقصى ضمن علامة التبويب تعيين الزاوي . لمزيد من المعلومات، راجع البرنامج التعليمي Scipion25.
  3. كرر الخطوة 12.1 مع محاذاة محلية. انسخ الوظيفة السابقة وقم بتغيير تحديد تشغيل سابق إلى Xmipp3 - highres Global. على علامة التبويب تعيين زاوي، قم بتغيير محاذاة الصورة إلى محلي. اضبط الحد الأقصى لدقة الهدف على 2.1 Å.
  4. افحص الخريطة المنقحة في UCSF Chimera وقم بتحليل التغيير في FSC والتعيينات الزاوية (الخطوة 12.2). كرر التحسين المحلي حتى لا تتحسن الدقة وتتلاقى التعيينات الزاوية، مع ضبط الدقة القصوى المستهدفة حسب الحاجة.
  5. يمكن تعديل خريطة الإخراج من Scipion 3 بالإضافة إلى ذلك من خلال الكثافة وشحذها في Phenix26.

13. Scipion 3 - التحقق من صحة الخريطة

  1. فحص الدقة المحلية للخريطة النهائية التي تم إنشاؤها في Xmipp3 - Highres. افتح Xmipp - MonoRes27 المحلي وأدخل وحدة التخزين النهائية من المهمة السابقة والقناع الذي تم إنشاؤه في الخطوة 8.6. اضبط نطاق الدقة من 1 إلى 6 Å بفاصل زمني 0.1 Å وقم بتنفيذ المهمة.
  2. عند الانتهاء من التشغيل ، انقر فوق تحليل النتائج وفحص الرسم البياني للدقة وشرائح الحجم الملونة حسب الدقة.
  3. لمعرفة ما إذا كانت الجسيمات محاذاة بشكل جيد، افتح قابلية المحاذاة متعددة المراجع28 وأدخل الجسيمات والحجم من الخطوة 12.3. انقر فوق تحليل النتائج لعرض مخطط التحقق من الصحة. من الناحية المثالية ، يجب تجميع جميع النقاط حول (1.0 ، 1.0).
  4. افتح Xmipp3 - التحقق من صحة التركيب الزائد. أدخل الجسيمات والأحجام من الخطوة 12.3. عند الانتهاء من الجري ، قم بتحليل النتائج وفحص المؤامرة الزائدة. يشير عبور الضوضاء الغاوسية المحاذاة ومنحنيات الجسيمات المحاذاة إلى الإفراط في التركيب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لقد قدمنا خط أنابيب SPA شامل للحصول على هيكل عالي الدقة باستخدام ثلاث منصات معالجة مختلفة: cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3. يلخص الشكل 1 والشكل 4 سير عمل المعالجة العام، ويفصل الجدول 1 بروتوكولات التحسين. تم استخدام هذه البروتوكولات أثناء تحسينات هيكل 2.3 Å من AAV ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه المقالة ، نقدم سير عمل SPA قويا لمعالجة بيانات cryo-EM عبر منصات برمجية مختلفة لتحقيق عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة (الشكل 1). ينطبق سير العمل هذا على مجموعة واسعة من الجزيئات البيولوجية الكبيرة. وترد الخطوات اللاحقة للبروتوكول في الشكل 4، ب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر كارلوس أوسكار سورزانو على المساعدة في تثبيت Scipion3 وكيليان شنيل وآرني مولر للمساعدة في نقل البيانات بين منصات المعالجة المختلفة. تم دعم جزء من هذا البحث من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة U24GM129547 وتم إجراؤه في PNCC في OHSU وتم الوصول إليه من خلال EMSL (grid.436923.9) ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة برعاية مكتب البحوث البيولوجية والبيئية. تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة بدء التشغيل من جامعة روتجرز إلى Arek Kulczyk.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARCStructura Biotechnology Inc.https://cryosparc.com/
CTFFIND 4Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical Schoolhttps://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2UCSF Macromolecular Structure Grouphttps://msg.ucsf.edu/software
PhenixComputational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)http://www.phenix-online.org/
PyEMUniverisity of California, San Franciscohttps://github.com/asarnow/pyem
RELIONMRC Laboratory of Structural Biologyhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
ScipionInstruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF ChimeraUCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informaticshttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/

References

  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194(2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

179 cryo EM SPA cryoSPARC RELION Scipion AAV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved