JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة مجهرية للكشف عن البكتين في التفاعل بين القهوة والفطريات.

Abstract

تستخدم الخلايا النباتية آليات هيكلية مختلفة ، إما تأسيسية أو مستحثة ، للدفاع عن نفسها من العدوى الفطرية. التغليف هو آلية فعالة للحث على عزل الهوستوريا الفطرية من بروتوبلاست الخلية النباتية. على العكس من ذلك ، فإن البكتين ، أحد المكونات البوليمرية لجدار الخلية ، هو هدف للعديد من الإنزيمات المحللة للبكتالوتيك في التفاعلات الضمورية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول للكشف عن البكتين والفطريات من خلال المجهر الضوئي. يتم التحقيق في التغليف الغني بالبكتين في خلايا أوراق القهوة المصابة بفطر الصدأ Hemileia vastatrix وتعديل جدار خلية mesophyll الناجم عن Cercospora coffeicola . تم إصلاح عينات الأوراق المصابة بمحلول كارنوفسكي ، وتجفيفها ، وتضمينها في ميثاكريليت الجليكول لمدة 2-4 أيام. اتبعت جميع الخطوات عن طريق الضخ الفراغي لإزالة الهواء في المساحات بين الخلايا وتحسين عملية التضمين. تم تقسيم الكتل المدمجة إلى أقسام بسماكة 5-7 ميكرومتر ، والتي تم ترسيبها على شريحة زجاجية مغطاة بالماء وتم تسخينها لاحقا عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، كانت الشرائح ملطخة مرتين ب 5٪ قطن أزرق في لاكتوفينول للكشف عن الفطريات و 0.05٪ من الروثينيوم الأحمر في الماء للكشف عن البكتين (المجموعات الحمضية من الأحماض البولي يورونيك من البكتين). تم العثور على الهوستوريا الفطرية من Hemileia vastatrix مغلفة بالبكتين. في cercosporiosis القهوة ، أظهرت خلايا mesophyll ذوبان جدران الخلايا ، ولوحظ hyphae بين الخلايا و conidiophoress. الطريقة المعروضة هنا فعالة للكشف عن الاستجابة المرتبطة بالبكتين في التفاعل بين النبات والفطريات.

Introduction

آليات الدفاع عن جدار الخلية في النباتات ضرورية لكبح العدوى الفطرية. وقد أبلغت الدراسات عن تغيرات في سمك جدار الخلية وتكوينها منذ القرن التاسععشر 1,2. يمكن أن تحدث هذه التغييرات بواسطة مسببات الأمراض الفطرية التي تحفز تكوين حليمة ، والتي تمنع الفطريات من دخول الخلية أو يمكن استخدامها لتغليف الواصلة لعزل بروتوبلاست الخلية المضيفة من الهوستوريا الفطرية. يعد إنتاج حاجز جدار خلية ديناميكي (أي الحليمات و haustorium مغلف بالكامل) مهما لتعزيز مقاومة النبات3. وقد بحثت الدراسات النسيجية المرضية على الأمراض المرتبطة بالفطريات في حدوث هذه الآليات ووصفت بوليمرات جدار الخلية والسليلوز والهيميسيلولوز (أرابينوكسيلان) والكالوز كآليات مقاومة للهجوم الفطري4،5،6،7.

جدار الخلية هو الحاجز الأول ضد هجوم الكائنات الحية الدقيقة ، مما يضعف التفاعل بين النبات والفطريات. تشكل السكريات البكتيكية جدار الخلية وتمثل حوالي 30٪ من تكوين جدار الخلية في الخلايا الأولية لنباتات اليوديكوت التي يكون فيها الهوموجالاكتورونان البوليمر الأكثر وفرة (حوالي 60٪)8. يفرز Golgi مركبات البكتين المعقدة التي تشكل سلاسل حمض الجالاكتورونيك ، والتي قد تكون أو لا تكون ميثيلية 8,9. منذ عام 2012 ، أشارت الأدبيات إلى أن درجة استرجاع ميثيل البكتين أمر بالغ الأهمية لتحديد التوافق أثناء العدوى بالإنزيمات البكتية الميكروبية 10،11،12. وبالتالي ، هناك حاجة إلى بروتوكولات للتحقق من وجود وتوزيع المركبات البكتيكية في النظم المرضية النباتية الفطرية.

تم استخدام تقنيات مختلفة للكشف عن تغليف الحليمات أو haustoria. الطرق المرجعية المستخدمة هي المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) للأنسجة الثابتة والمجهر الضوئي للأنسجة الحية والثابتة. فيما يتعلق ب TEM ، أظهرت العديد من الدراسات الدور الهيكلي لتعيينات جدار الخلية في المقاومة الفطرية 13،14،15،16 ، وأن استخدام الليكتين والأجسام المضادة هو طريقة معقدة لتحديد موقع بوليمرات الكربوهيدرات 16. ومع ذلك ، تشير الدراسات إلى أن الفحص المجهري الضوئي هو نهج مهم وأن الأدوات الكيميائية النسيجية والكيميائية المناعية تسمح بفهم أفضل لتكوين الحليمات وتغليف الهوستوريوم 6,7.

تظهر الفطريات المسببة للأمراض نوعين رئيسيين من أنماط الحياة: التغذية الحيوية والميتة. تعتمد الفطريات الحيوية على الخلايا الحية لتغذيتها في حين أن الفطريات الميتة تقتل الخلايا المضيفة ، ثم تعيش في الأنسجة الميتة17. في أمريكا اللاتينية ، صدأ أوراق البن ، الناجم عن الفطريات Hemileia vastatrix ، هو مرض مهم في محاصيل البن18,19. يقدم Hemileia vastatrix سلوكا حيويا ، ومن بين التغيرات الهيكلية التي لوحظت في أنواع أو أصناف القهوة المقاومة ، تم الإبلاغ عن استجابة فرط الحساسية ، وترسب الكالوز والسليلوز واللجنين على جدران الخلايا ، وكذلك تضخم الخلايا14. على حد علم المؤلفين ، لا تقدم الأدبيات معلومات حول أهمية البكتين في مقاومة صدأ القهوة. من ناحية أخرى ، تستهدف الفطريات الميتة التي تسبب التهاب عنق الرحم البكتين عبر مجموعة من الإنزيمات المرتبطة بتدهور جدار الخلية ، مثل البكتيناز و polygalacturonase20. Cercosporiosis في البن ، الناجم عن الفطريات Cercospora coffeicola هو أيضا تهديد كبير لمحاصيل البن21,22. هذا الفطر يسبب آفات نخرية في كل من الأوراق والتوت. بعد الاختراق ، يستعمر C. coffeicola الأنسجة النباتية من خلال المسارات داخل الخلايا وبين الخلايا 23،24،25.

يبحث هذا البروتوكول في وجود هياكل فطرية وبكتين على جدران الخلايا. هذا البروتوكول مفيد لتحديد استجابة النبات المرتبطة بالبكتين (ملطخة بصبغة الروثينيوم الحمراء ، والتي هي خاصة بالمجموعات الحمضية من الأحماض البولي يورونيك من البكتين) ، التي يسببها المضيف في تفاعل حيوي مع الفطريات. كما أنه يساعد على التحقق من تأثير الفطريات الميتة على تدهور جدران الخلايا البكتيكية. تشير النتائج الحالية إلى أن طريقة التلطيخ المزدوج فعالة في التمييز بين الهياكل والمرحلة التناسلية للفطريات.

Protocol

1. إعداد محلول التخزين المؤقت والكواشف

  1. تحضير 2 M كاكوديلات المخزن المؤقت عن طريق إضافة 4.28 غرام من كاكوديلات الصوديوم إلى 100 مل من الماء المقطر وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.25 مع 0.2 N HCl.
  2. تحضير 100 مل من محلول كارنوفسكي المثبت عن طريق خلط 10 مل من 25٪ غلوتارالدهيد المائي ، 10 مل من الفورمالديهايد المائي 10٪ ، 25 مل من 2 متر كاكوديليت المخزن المؤقت ، و 0.5 مل من 0.5 م كاكل226. تشكل الحجم إلى 100 مل بالماء المقطر.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالمحلول في الثلاجة لمدة 6 أشهر.
    تنبيه: محلول التخزين المؤقت الكاكوديليت سام. لذلك ، تعامل مع الحل المثبت في غطاء الدخان أو منطقة مفتوحة. تجنب استنشاق أبخرة المحلول وارتداء القفازات أثناء المناولة.
  3. تحضير محلول المغذيات المائية Hoagland عن طريق خلط ما يلي: 3 mM Ca(NO 3) 2.4H2O ، 2 mM NH 4 H 2 PO 4 ، 5 mM KH 2 PO 4 ، 2 mM MgSO 4.7H 2 O ، 9.07 mM MnSO 4 ، 0.765 mM ZnSO 4.7H 2 O، 46.4 mM H 3 BO 3 ، 0.09 mM Na2MoO4. H2O و 0.01 mM CuSO 4 و 36 mM FeSO4.7H 2O مثل الحديد-EDTA (حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك) 27.

2. عينات نباتية وتلقيح الفطريات

ملاحظة: بالنسبة للتجارب على الأوراق المتأثرة بصدأ القهوة ، خمس شتلات عمرها 2 شهر من Coffee arabica cv. تم زراعة Catuaí والاحتفاظ بها في دفيئة في مركز الطاقة النووية في الزراعة (CENA) بجامعة ساو باولو ، بيراسيكابا ، ولاية ساو باولو ، البرازيل.

  1. تنمو نباتات البن في أواني بلاستيكية سعة 500 مل مملوءة بمحلول مغذيات Hoagland المائي (درجة الحموضة ~ 5.5) لمدة 4 أشهر في غرفة نمو محفوظة عند 27 ± 3 درجات مئوية مع فترة ضوئية مدتها 12 ساعة تم إنشاؤها بواسطة مصابيح LED عند تدفق الفوتون 250 ميكرومول s-1 m-2. استبدل محلول المغذيات Hoagland كل أسبوع لمدة 4 أشهر.
  2. تلقيح أربع أوراق موسعة من خمسة نباتات على أسطحها المحورية مع 1 × 103 H. vastatrix uredospores باتباع الطريقة الموضحة في المرجع28. بعد التلقيح ، احتفظ بالنباتات لمدة 48 ساعة في الظلام عن طريق تغطيتها بكيس بلاستيكي أسود. حصاد الآفات بعد 30 يوما من التلقيح.
  3. الآفات المميزة للحصاد التي تسببها سيركوسبورا كوفيكولا من كوفيا أرابيكا السيرة الذاتية. تقع نباتات أوباتا (الإحداثيات: -22.906506126269942, -47.015075902025266) في المعهد البيولوجي، كامبيناس، ولاية ساو باولو، البرازيل. قبل معالجة العينة ، قم بتحليل الآفات في المجهر المجسم للتحقق من وجود القهوة C. coffeicola conidia. ثم ، قم بتركيب بعض الشرائح باستخدام conidia لتأكيد مسببات المرض22.

3. حصاد العينات وتثبيتها وجفافها

  1. باستخدام مشرط وملقط ، قم بحصاد عينة من الأوراق ~ 10 مم2 في المنطقة الوسطى من الآفة (بقع صفراء; الشكل 1) واغمره في 30 مل من محلول كارنوفسكي المثبت (الشكل 1 والشكل 2A). يمكن أن تتم خطوة التثبيت في الثلاجة لمدة 48 ساعة.
  2. لمدة أربع مرات على الأقل ، أخضع عينة الورقة لفراغ منخفض (500-600 مللي بار) باستخدام مضخة زيت لمدة 15 دقيقة لكل منها لزيادة نفاذية المحلول المثبت في أنسجة الأوراق. نفذ هذه الخطوة مع تدوير العينة (الشكل 1).
  3. بعد التثبيت ، اغسل عينة الورقة ثلاث مرات في مخزن مؤقت كاكوديليت 0.5 M (الرقم الهيدروجيني 7.2) مخفف في الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منها ثم انقلها إلى سلسلة إيثانولية متدرجة (30٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 90٪ (2x) ، و 100٪ (2x)) لمدة 15 دقيقة عند كل تركيز إيثانول (الشكل 1 والشكل 2B).

4. Historesin إجراء التضمين

  1. انقل العينات تدريجيا إلى ميثاكريليت الجليكول (GMA) في ثلاث خطوات ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أولا ، اصنع المحلول A عن طريق خلط مسحوق GMA (1 جم) مع 100 مل من الراتنج الأساسي (مجموعة historein ؛ جدول المواد) تحت التحريض المغناطيسي ، ثم اتبع الخطوات التالية.
    1. اغمر العينات في 1: 2 الحل A: 100٪ الإيثانول لمدة 3 ساعات.
    2. اغمر العينات في 1: 1 المحلول A: 100٪ الإيثانول لمدة 3 ساعات.
    3. اغمر العينات في راتنج أساسي نقي لمدة 2-4 أيام. خلال هذه الخطوة، قم بإخضاع العينات لفراغ منخفض أربع مرات على الأقل في اليوم لمدة 15 دقيقة متبوعة بالدوران.

5. البلمرة

ملاحظة: تتطلب عملية البلمرة قوالب بلاستيكية سعة 1.2 مل وراتنج أساسي ومصلب (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المجموعة التجارية).

  1. امزج 15 مل من المحلول A (الخطوة 4.1) مع 1 مل من المصلب في كوب مع الدوران لمدة دقيقتين لإنتاج محلول البلمرة (الحل B).
  2. ضع 1.2 مل من محلول البلمرة (المحلول B) في قوالب بلاستيكية. باستخدام معول خشبي ، انقل عينات الأوراق المصابة من الراتنج الأساسي النقي إلى المحلول B (الشكل 2C). تجنب استخدام الملقط لأنها يمكن أن تسبب سحق الأنسجة.
  3. تأكد من توجيه عينات الأوراق بسرعة عموديا على القوالب البلاستيكية حيث يصبح المحلول B لزجا بسرعة في غضون 5 دقائق. يمكن وضع أكثر من عينة واحدة من الأوراق المصابة في قالب واحد.
    ملاحظة: يوصى بممارسة الخطوة المذكورة أعلاه عدة مرات قبل التقدم بطلب للحصول على العديد من العينات. عندما يكون هناك العديد من العينات ، يختلف وقت البلمرة بين القوالب وقد يكون من الصعب تحقيق الاتجاه العمودي لعينات الأوراق.
  4. عندما يتم تحقيق الاتجاه العمودي لعينات الأوراق ، انتظر لمدة 30 دقيقة ، ثم انقل القالب البلاستيكي إلى غرفة بلاستيكية أو زجاجية تحتوي على هلام السيليكا لمنع الرطوبة. انتظر 2-3 ساعات للبلمرة.
  5. بمجرد بلمرة الراتنج وعينة الورقة بعد فترة 2-3 ساعات ، افصل الكتلة الناتجة عن القالب البلاستيكي عن طريق صنفرة قاعدة الكتلة بملف صنفرة. ثم ، قم بلصق الكتلة على قطعة من الخشب (الشكل 2D).

6. التقسيم

  1. باستخدام ميكروتوم دوار مجهز بشفرات فولاذية 8 سم (الشكل 2E) ، قم بقطع الكتلة إلى أقسام بسماكة 5 ميكرومتر. ضع الأقسام على شرائح زجاجية مغطاة بالماء المقطر. انقل الشرائح مع الأقسام العائمة فوق الماء إلى صفيحة ساخنة عند 40 درجة مئوية لتجف وتعزز التصاق الأقسام بالشرائح الزجاجية.
  2. بعد التجفيف (الشكل 2F) ، قم بتسمية الشرائح الزجاجية باسم مرجع الكتلة ورقم الشريحة.

7. عملية تلطيخ مزدوجة

  1. غطي الأقسام ب 2 مل من 5٪ قطن أزرق في لاكتوفينول (40٪ جليسرين ، 20٪ فينول ، و 20٪ حمض اللاكتيك في الماء) وقم بتسخينها على صفيحة ساخنة عند 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الشكل 3A).
  2. قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر (الشكل 3B-D).
  3. وصمة عار مع 2 مل من 0.01 ٪ الروثينيوم الأحمر في الماء لمدة 1 دقيقة (الشكل 3E).
  4. قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر (الشكل 3F ، G).
  5. ضع قطرة من الماء المقطر فوق الأقسام وقم بتغطية الأقسام بغطاء 24 مم × 60 مم لإجراء تحليل مجهري خفيف.

النتائج

كشف تلطيخ لاكتوفينول أزرق قطني على القسم المدمج في GMA عن وجود العديد من الهياكل الفطرية بين وداخل خلايا ميزوفيل القهوة في كل من التفاعلات الفطرية الحيوية والميتة.

في النظام المرضي الحيوي ، عند تلطيخه باستخدام طريقة التلطيخ المزدوج ، تظهر Hyphae Hemileia vastatrix التي تحتوي على ج?...

Discussion

يقدم هذا العمل اختبارا نسيجيا كيميائيا بديلا مزدوج التلطيخ للتحقيق في تكوين البكتين لجدران الخلايا التي تغلف الهوستوريا في نظام مرضي حيوي. والهدف من ذلك أيضا هو إثبات فعالية الطريقة للكشف عن الفطريات الميتة وتغيرات جدار الخلية الناجمة عنها. هنا ، يمكن أن يغلف البكتين من جدران خلايا حمة ا?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور هدسون دبليو بي دي كارفالهو على الدعم لتطوير هذا العمل. كما أعرب المؤلفون عن امتنانهم لمختبر المجهر الإلكتروني "البروفيسور إليوت واتانابي كيتاجيما" لتوفيره مرفق الفحص المجهري الضوئي. يشكر المؤلفون الدكتور فلافيا رودريغز ألفيس باتريسيو على تزويد المواد النباتية بالآفات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Blades DB80 HSLeica14035838383Sectioning
Cacodylate bufferEMS# 11652Fixation
Cotton Blue LactophenolMetaquímica70SOLSIG024629Staining
FormaldehydeEMS#15712Fixation
GlutaraldehydeEMS#16216Fixation
Historesin KitTechnovit /EMS#14653Historesin for embedding
Hot plateDubesserSSCD25X30-110VStaining
MicroscopyZeiss#490040-0030-000Image capture
Microtome (Leica RM 2540)Leica149BIO000C1 14050238005Sectioning
Plastic molding cup trayEMS10176-30Staining
Ruthenium redLABHouse#006004Staining
Software Axion VisionZeiss#410130-0909-000Image capture
Vaccum pumpPrismatec131 TIPO 2 V.C.Fixation

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. . Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T., Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. 689, 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Piracicaba, F. E. A. L. Q. . Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. , 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. . Methods in Plant Histology. , 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A., Kerbauy, G. B. Cell Wall. Plant Physiology. , 165-181 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved