JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في النماذج الحيوانية لأمراض إزالة الميالين ، باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا العمودي.

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا المناعية الفطرية المقيمة في الدماغ ، هي المستجيبين الأساسيين للالتهاب أو الإصابة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). يمكن تقسيم الخلايا الدبقية الصغيرة إلى حالة راحة وحالة تنشيط ويمكن أن تتغير حالتها بسرعة استجابة للبيئة الدقيقة للدماغ. سيتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في ظل ظروف مرضية مختلفة وتظهر أنماطا ظاهرية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من المجموعات الفرعية المختلفة من الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة وعدم التجانس الكبير بين المجموعات الفرعية المختلفة. يعتمد عدم التجانس بشكل أساسي على الخصوصية الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة. كشفت الدراسات أنه سيتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتلعب دورا مهما في العملية المرضية لإزالة الميالين الالتهابية. لفهم خصائص الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أفضل في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية مثل التصلب المتعدد واضطراب طيف التهاب النخاع والعصب البصري ، نقترح بروتوكول فرز الخلايا الدبقية الدقيقة الأولية حول الآفات. يستخدم هذا البروتوكول فرز الخلايا العمودية المنشطة مغناطيسيا (MACS) للحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية عالية النقاء والحفاظ على الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة للتحقيق في الآثار المحتملة للخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية.

Introduction

تنشأ الخلايا الدبقية الصغيرة من أسلاف كيس صفار البيض ، والتي تصل إلى الدماغ الجنيني في وقت مبكر جدا وتشارك في تطوير الجهاز العصبي المركزي 1,2. على سبيل المثال ، يشاركون في التقليم المشبكي3 وتنظيم النمو المحوري4. أنها تفرز العوامل التي تعزز بقاء الخلايا العصبية وتساعد على توطين الخلايا العصبية5. في الوقت نفسه ، يشاركون في إزالة الخلايا غير الطبيعية والخلايا الماصة لضمان نمو الدماغ الطبيعي6. بالإضافة إلى ذلك ، باعتبارها الخلايا المختصة بالمناعة في الدماغ ، تراقب الخلايا الدبقية الصغيرة باستمرار حمة الدماغ لإزالة الخلايا الميتة ، والمشابك العصبية المختلة وظيفيا ، والحطام الخلوي7. وقد ثبت أن تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة يلعب دورا مهما في مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية، والأمراض العصبية التنكسية، وأورام الدماغ. تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في التصلب المتعدد (MS) في تمايز خلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs) وتجديد المايلين عن طريق ابتلاع حطام المايلين8.

في مرض الزهايمر (AD) ، ينشط تراكم بيتا أميلويد (Aβ) الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يؤثر على وظائف البلعمة والالتهابات في الخلايا الدبقية الصغيرة9. يمكن للدبقية الصغيرة المنشطة في أنسجة الورم الدبقي ، والتي تسمى الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالورم الدبقي (GAM) ، تنظيم تطور الورم الدبقي وتؤثر في النهاية على تشخيص المرضى10. يغير التنشيط بشكل عميق النسخ الدبقي الصغير ، مما يؤدي إلى تغيرات مورفولوجية ، والتعبير عن المستقبلات المناعية ، وزيادة نشاط البلعمة ، وتعزيز إفراز السيتوكين11. هناك مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في الأمراض العصبية التنكسية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالمرض (DAM) ، والخلايا الدبقية الصغيرة ذات الاستجابة المنشطة (ARM) ، والنمط الظاهري العصبي التنكسي الدبقي الصغير (MGnD)8.

وبالمثل ، تتعايش مجموعات فرعية وظيفية ديناميكية متعددة من الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في الدماغ في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية12. إن فهم عدم التجانس بين مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الدبقية الصغيرة أمر ضروري للتحقيق في التسبب في أمراض إزالة الميالين الالتهابية وإيجاد استراتيجياتها العلاجية المحتملة. يعتمد عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أساسي على الخصوصية الجزيئية8. من الضروري وصف التغيرات الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة بدقة لدراسة عدم التجانس. وقد مكن التقدم في تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (RNA-seq) من تحديد الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في الحالات المرضية13. لذلك ، فإن القدرة على عزل مجموعات الخلايا أمر بالغ الأهمية لمزيد من التحقيق في هذه الخلايا المستهدفة في ظل ظروف محددة.

الدراسات التي أجريت لفهم خصائص ووظائف الخلايا الدبقية الصغيرة عادة ما تكون في الدراسات المختبرية ، حيث وجد أنه يمكن تحضير أعداد كبيرة من الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية وزراعتها من أدمغة جرو الفئران (1-3 أيام) ، والتي ترتبط بقوارير الثقافة وتنمو على السطح البلاستيكي مع الخلايا الدبقية المختلطة الأخرى. في وقت لاحق ، يمكن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة النقية بناء على الالتصاق المختلف للخلايا الدبقية المختلطة14,15. ومع ذلك ، يمكن لهذه الطريقة فقط عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الدماغ في الفترة المحيطة بالولادة وتستغرق عدة أسابيع. قد تؤثر المتغيرات المحتملة في زراعة الخلايا على خصائص الخلايا الدبقية الدقيقة مثل التعبير الجزيئي16. علاوة على ذلك ، لا يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بهذه الطرق المشاركة إلا في التجارب المختبرية من خلال محاكاة ظروف أمراض الجهاز العصبي المركزي ولا يمكنها تمثيل خصائص ووظائف الخلايا الدبقية الصغيرة في حالات مرض الجسم الحي. لذلك ، من الضروري تطوير طرق لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن دماغ الفأر البالغ.

فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) والفصل المغناطيسي هما طريقتان مستخدمتان على نطاق واسع ، على الرغم من أن لهما قيودهما المختلفة الخاصة16،17،18،19. وسيتم المقارنة بين مزاياها وعيوبها في قسم المناقشة. يوفر نضج تقنية MACS إمكانية تنقية الخلايا بسرعة. طور هوانغ وآخرون طريقة ملائمة لتسمية الآفات المزيل للميالين في الأدمغة20. من خلال الجمع بين هذين النهجين التقنيين ، نقترح بروتوكول فصل مغناطيسي عمودي CD11b سريع وفعال ، مما يوفر وصفا خطوة بخطوة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة حول الآفات المزيلة للميالين في أدمغة الفئران البالغة والحفاظ على الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة. كانت آفات إزالة الميالين البؤرية ناتجة عن الحقن التجسيمي ل 2 ميكرولتر من محلول الليسوليسيثين (1٪ LPC في 0.9٪ كلوريد الصوديوم) في الجسم الثفني قبل 3 أيام من بدء البروتوكول21. يضع هذا البروتوكول الأساس لتنفيذ الخطوة التالية في التجارب المختبرية. علاوة على ذلك ، يوفر هذا البروتوكول الوقت ويظل ممكنا للاستخدام على نطاق واسع في التجارب المختلفة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة معهد رعاية الحيوان التابعة لكلية تونغجي الطبية ، جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا ، الصين.

1. المواد

  1. قم بإعداد الحلول التالية قبل بدء البروتوكول.
    1. قم بإعداد مخزن التحميل المؤقت عن طريق إضافة مصل البقر الجنيني (FBS ، 2٪) إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    2. أضف صبغة حمراء محايدة (NR) (نهائي 1٪) إلى PBS.
  2. قم بإعداد الحلول التالية باستخدام مجموعة أدوات تفكك دماغ البالغين المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    1. لإعداد مزيج الإنزيم 1 ، ماصة 1.9 مل من Buffer Z و 50 ميكرولتر من إنزيم P في أنبوب طرد مركزي 15 مل.
    2. لإعداد مزيج الإنزيم 2 ، ماصة 20 ميكرولتر من Buffer Y و 10 ميكرولتر من الإنزيم A في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
    3. تحضير حل إزالة الحطام.

2. تروية الفئران وتشريحها

  1. حقن الفأر داخل الصفاق (i.p) ب 500 ميكرولتر من صبغة NR 1٪ في PBS 2-3 h قبل التخدير.
    ملاحظة: يساعد الحقن داخل الصفاق ل NR في نماذج الفئران المزيلة للميالين على تمييز الآفات (الشكل 1).
  2. تخدير الفأر باستخدام بنتوباربيتال (50 مجم / كجم ، i.p.) ، وتأكد من تخدير الفأر بنجاح من خلال فحص استجابات الألم.
  3. افتح التجويف الصدري للفأر وكشف القلب.
  4. قطع زاوية صغيرة من الأذين الأيمن بعناية وداخل القلب تخلل الماوس مع 20-30 مل من PBS الباردة من البطين الأيسر.
  5. قطع رأس الفأر تحت التخدير.
  6. افتح جمجمة الفأر وحرر الدماغ بعناية من الجمجمة.
  7. نقل الدماغ إلى قالب شريحة دماغ الفأر وقطع الدماغ إلى شرائح 0.1 سم.
  8. قم بإزالة شرائح الدماغ وضعها في PBS باردة في طبق بتري (60/15 مم). تشريح دقيق للآفات التي تحمل صبغة NR حول الجسم الثفني تحت المجهر المجهري باستخدام ملقط الجراحة المجهرية.
    ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة التي تم تشريحها كاملة قدر الإمكان لتسهيل النقل اللاحق ؛ يجب إكمال التقدم الكلي في التشريح في 2 ساعة.
  9. انقل الأنسجة المشوهة إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل تحتوي على الكمية المناسبة من المخزن المؤقت للتحميل البارد.
    ملاحظة: قم بتجميع أنسجة الجسم الثفني من 2-3 فئران معا في أنبوب واحد كعينة واحدة.

3. تفكك الأنسجة

  1. الطرد المركزي للأنسجة المشوهة عند 300 ×g لمدة 30 ثانية (بعد الوصول إلى هذه السرعة) لجمع العينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
  2. سخن مزيج الإنزيم 1 ومزيج الإنزيم من 2 إلى 37 درجة مئوية في الحاضنة.
  3. أضف 1950 ميكرولتر من مزيج الإنزيم المسخن مسبقا 1 إلى عينة واحدة وهضمه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. أضف 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم المسخن مسبقا 2 واخلطه بلطف.
  5. يهضم في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ويخلط بلطف كل 5 دقائق.
  6. أضف 4 مل من PBS البارد إلى الأنبوب بعد الهضم ورجه بلطف.
  7. ضع مرشحات 70 ميكرومتر على أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتبليل المرشحات مسبقا ب 500 ميكرولتر من PBS البارد. قم بتصفية الأنسجة المنفصلة عن طريق تمرير عينات الأنسجة المهضومة عبر المرشحات ، ونقل التعليق المصفى في أنبوب جهاز الطرد المركزي سعة 50 مل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
    ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كانت كمية الأنسجة صغيرة جدا.
  8. الطرد المركزي لعينات الأنسجة المصفاة عند 300 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط السوبرناتان ببطء وبشكل كامل.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات على الجليد باستثناء الهضم الإنزيمي.

4. إزالة الأنقاض

  1. أعد تعليق حبيبات الخلايا بلطف باستخدام 1550 ميكرولتر من PBS البارد.
  2. أضف 450 ميكرولتر من المحلول البارد لإزالة الحطام واخلطه جيدا.
  3. تراكب الخليط أعلاه ببطء شديد وبلطف مع 2 × 1 مل من PBS الباردة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    ملاحظة: قم بإمالة أنبوب جهاز الطرد المركزي بمقدار 45 درجة وأضف PBS ببطء على طول جدار الأنبوب مع الماصة.
  4. انقل الأنبوب ببطء ولطف إلى جهاز طرد مركزي وقم بالدوران عند 4 درجات مئوية و 3000 × جم لمدة 10 دقائق.
  5. ابحث عن ثلاث طبقات بعد الطرد المركزي. استنشق الطبقتين العلويتين بالكامل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر (الشكل 2).
  6. املأ الأنبوب حتى 5 مل بمخزن مؤقت للتحميل البارد وقم بعكس الأنبوب بلطف ثلاث مرات.
  7. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و 1000 × جم لمدة 10 دقائق. شفط supernatant تماما وتجنب تعطيل بيليه الخلية.

5. الفصل المغناطيسي للخلايا الدبقية الدقيقة

  1. أعد تعليق حبيبات الخلية مع 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل وأضف 10 ميكرولتر من حبات CD11b (Microglia).
  2. تخلط جيدا وتحضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. أضف 1 مل من مخزن التخزين المؤقت للتحميل وماصة السائل بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لغسل الخلايا بعد الحضانة. الطرد المركزي للخلايا عند 4 درجات مئوية و 300 × غرام لمدة 10 دقائق وشفط supernatant تماما لإزالة الخرز غير المقيد.
  4. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل.
  5. ضع عمود MS مع الفاصل الخاص به للاختيار الإيجابي في المجال المغناطيسي.
  6. شطف العمود مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت تحميل لحماية الخلايا وضمان كفاءة الفرز المغناطيسي على أساس بروتوكول الشركة المصنعة.
  7. قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود MS وتخلص من التدفق الذي يحتوي على خلايا غير مسماة.
  8. أضف 500 ميكرولتر من مخزن التخزين المؤقت للتحميل إلى العمود ثلاث مرات لغسل الخلايا التي تلتصق بجدار العمود وتتخلص من التدفق.
    ملاحظة: أضف مخزن مؤقت جديد للتحميل للغسيل فقط عندما يكون خزان العمود فارغا تماما.
  9. قم بإزالة العمود من الفاصل بعد غسل العمود وضعه على أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
  10. أضف 1 مل من مخزن التخزين المؤقت للتحميل إلى العمود وادفع المكبس إلى أسفل العمود لطرد الخلايا المصنفة مغناطيسيا. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات لجمع الخلايا المصنفة مغناطيسيا بالكامل.

النتائج

الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة باستخدام حبات CD11b ذات نقاء عال
تم عزل الخلايا الدبقية الدقيقة حول الآفات في نماذج فئران إزالة الميالين باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه واختبارها بواسطة قياس التدفق الخلوي. يتم تصنيف الخلايا بشكل فلوري باستخدام CD11b-fluorescein isothiocyanate (FITC) و CD45-allophy...

Discussion

يقترح البروتوكول طريقة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة حول الآفات المزيلة للميالين ، والتي يمكن أن تساعد في دراسة الخصائص الوظيفية للخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية. تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة التي تم التقاطها باستخدام حبات CD11b نقاء عاليا وقابلية للحياة. وت?...

Disclosures

وقد أعلن صاحبا البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم الدراسة من قبل مؤسسة مستشفى تونغجي (HUST) للعلماء الشباب المتميزين (منحة رقم 2020YQ06).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Micro Centrifuge TubesBIOFILCFT001015
15 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011150
50 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011500
70 µm FilterMiltenyi Biotec130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and ratMiltenyi Biotec130-107-677
C57BL/6J MiceSJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouseMiltenyi Biotec130-093-634
Fetal Bovine SerumBOSTERPYG0001
FlowJoBD BiosciencesV10
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Neutral RedSigma-Aldrich1013690025
NovoCyte Flow CytometerAgilentA system consisting of various parts
NovoExpressAgilent1.4.1
PBSBOSTERPYG0021
PentobarbitalSigma-AldrichP-010
StereomicroscopeMshOtMZ62

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
  6. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  8. Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
  9. Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
  10. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  11. Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
  12. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
  13. Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  14. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , (2010).
  15. Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
  16. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  17. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  18. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  19. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  20. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  21. Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
  22. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  23. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
  24. Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  26. He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved