JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي أدوات جديدة لمقايسات ربط SPR لفحص ارتباط CV-N ب HA ، والبروتين السكري S ، والجليكان الهجين ذي الصلة ، والسكريات قليلة السكاريد عالية المانوز. يستخدم SPR لتحديد KD لربط إما ثنائي أو أحادي CV-N بهذه الجليكانات.

Abstract

يستخدم رنين البلازمون السطحي (SPR) لقياس ارتباط الهيماجلوتينين (HA) بثنائي ثنائي السيانوفيرين-N (CV-N) المبادل بالمجال ولمراقبة التفاعلات بين الببتيدات المانوسيلية وموقع الارتباط عالي التقارب ل CV-N. تم الإبلاغ عن طفرات غلاف الفيروس gp120 و HA و Ebola glycoprotein (GP) 1,2 لربط كل من مواقع الربط عالية ومنخفضة التقارب على CVN2 الثنائي. يرتبط ببتيد HA ثنائي المانوسيلات أيضا في موقعي الربط منخفض التقارب بجزيء مهندس من CVN2 ، والذي يحمل موقعا عالي التقارب لليجند المعني ويتحور ليحل محل رابطة ثاني كبريتيد مستقرة في جيب ربط الكربوهيدرات ، مما يؤكد الارتباط متعدد التكافؤ. يظهر ارتباط HA بموقع ربط عالي التقارب للجسم المضاد الزائف CVN2 عند ثابت تفكك (KD) يبلغ 275 نانومتر مما يزيد من تحييد فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) من خلال قلة القلة. يؤدي ربط عدد جسور ثاني كبريتيد في CVN2 المبادلة بالمجال ، والتي يتم تقليلها من 4 إلى 2 عن طريق استبدال السيستين في أزواج بقايا قطبية من حمض الجلوتاميك والأرجينين ، إلى تقليل تقارب الارتباط ب HA. من بين أقوى التفاعلات ، يرتبط الإيبولا GP1,2 ب CVN2 مع موقعين ملزمين عالي التقارب في النطاق النانوي السفلي باستخدام غلاف الجليكان بدون مجال عبر الغشاء. في هذه الدراسة ، يتم قياس ارتباط CV-N أحادي متعدد الأنواع بفيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) سبايك (S) بروتين سكري عند K D = 18.6 μM مقارنة ب nanomolar KD لتلك المسامير الفيروسية الأخرى ، وعبر مجال ربط المستقبلات في نطاق منتصف μ المولي.

Introduction

يتم تحفيز النشاط المضاد للفيروسات المرتبط ب Tetherin بواسطة α الإنترفيرون ، وهو يشتمل على حبال قائمة على البروتين ، مما يؤدي إلى الاحتفاظ بالفيروسات المشكلة بالكامل على أسطح الخلايا المصابة1. لا تزال ضرورة غليكوزيل التيثرين في تثبيط إطلاق الفيروس غير مؤكدة ، مما يعني أهمية أنماط الجليكوزيل على الجليكان المعبر عنه بشكل مؤتلف للدراسات المختبرية 1,2 ، والتي تعتمد على تشكيل (في حالة فيروس الأنفلونزا) الأنفلونزا المعبر عنها سطحيا هيماغلوتينين HA 3,4 . وقد لوحظ أن تعديل قليل السكاريد المربوط بالجليكوزيل المرتبط ب N يكفي لتقييد إطلاق فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1بوساطة التيثرين 2 ، بينما يلعب dimerization دورا أساسيا في منع إطلاق الفيروس ، وبالتالي إشراك المجال عبر الغشاء أو مرساة جليكوزيل فوسفاتيديل إينوسيتول (GPI) لربط الفيروسات الناشئة5 . يتم وصف الميزات الفريدة للحبل البشري والفئران لمنع العديد من الفيروسات المغلفة والفيروسات القهقرية والفيروسات الخيطية. BST-2 / tetherin هو بروتين مضاد للفيروسات يمكن تحريضه بواسطة الإنترفيرون للمناعة الفطرية 1,6 ، ويعمل مع نشاط مضاد للفيروسات واسع الطيف ويتم معاداته بواسطة البروتينات السكرية المغلفة5 إما لنقل التيثرين أو تعطيل بنية التيثرين 6. على سبيل المثال ، يعرف البروتين السكري المغلف المعبر عنه سطحيا HA والنورامينيداز على فيروس الأنفلونزا A بمعاداة التيثرين بطريقة خاصة بالسلالة7 ، مما يسهل التعرف على مواقع ربط مستقبلات المضيف8. تتم دراسة الأجسام المضادة التي تستهدف الجليكان في القياس المتكافئ لتفاعلاتها مع دروع الجليكان سريعة التخصيص على HA ، مما يؤدي إلى تقارب ملزم بالنوعين الفرعيين4 من الأنفلونزا A H3N2 و H1N1.

لتوضيح آليات الربط بين العوامل المضادة للفيروسات وطفرات غلاف الفيروس ، أي روابط الكربوهيدرات ، والطرق المناعية والطيفية التكميلية ، يتم تصنيع شقوق أحادية وثنائية وثلاثية مانوز كيميائيا. يتم إنشاء الببتيدات المانوسيلية عن طريق أزيدو جليكوزيل من جليكوزيل {بيتا}-بيراسيتات إلى 1،2-trans glycosyl azidesتحويل 9 ، مما يحاكي الجلوكوزامين N-acetyl الموجود عادة وقليل السكاريد عالي المانوز على سطح الفيروسات التي تهدد الحياة. تستخدم الإيزوكوسترات الحيوية التريازول لتقليد الروابط التي تشكل بقايا مانوسيلات من ببتيد HA10 وتسهيل التفاعلات الخاصة بالموقع مع مشتقات CV-N المضادة للفيروسات حول بقعة الجليكوزيل الثانية المرتبطة ب N على مجال رأس HA (قمة HA مع 4 جليكان مرتبط ب N N54 ، N97 ، N181 ، N301) 8،11،12 . أظهرت التفاعلات بين حمض الجلوتاميك (Glu) والأرجينين (Arg) وثنائي القطب الحلزوني الناتج استقرارا جيدا لكل من الببتيدات النموذجية والبروتينات ولكن يتم تصورها باستخدام SPR. إذا ما قورنت بالتعرف على موقع جليكوزيل واحد مركب كيميائيا على HA10 عن طريق تثبيط ارتباط المستقبلات مباشرة على شقوق الجليكان ، فإن التقارب الأعلى لهيكل Fc المتحور المكون من أربعة مواقع لمستقبلاته يظهر أنه يستنبط وظائف المستجيب في الجسم الحي ، مما يكشف عن التركيب غير ذي الصلة للجليكان المرتبط ب N المرتبط بمتحولة Fc ليتم تحديده ميكانيكيا13.

يعرض CV-N نشاطا مضادا للفيروسات ضد فيروس نقص المناعة البشرية 14،15 والإنفلونزا16 وفيروس الإيبولا ، والذي يتم بوساطة الارتباط النانوي بتعديلات قليل السكاريد عالية المانوز على بروتينات سبايك المغلف 12،17،18،19. تم تحديد ارتباط الأنفلونزا HA بموقع واحد عالي التقارب لربط الكربوهيدرات (H) في CV-N أو اثنين من Hs في CVN2 ثنائي الارتباط تساهميا للحصول على ثوابت تفكك التوازن (K D) = 5.7 نانومتر (الشكل 1A) و KD = 2.7 نانومتر ، على التوالي. يحتوي كل من CV-N و CVN2 على واحد أو اثنين من مواقع ربط الكربوهيدرات منخفضة التقارب (L) s12،17،20،21. يرتبط الإيبولا GP1,2 ب 2H من CVN2 مع تقارب في النطاق النانوي السفلي (KD = 26 نانومتر). يظهر ارتباط CV-N WT بالإيبولا GP1,2 و HA صلات من K D = 34 نانومتر إلى KD = 5.7 نانومتر (A / New York / 55/04)12. الليكتين ، مثل CV-N ، الذي يستهدف على وجه التحديد جليكان عالي المانوز على الأظرف الفيروسية ، يمنع تكاثر فيروس التهاب الكبد C ، و SARS-CoV ، وفيروس الهربس ، وفيروس ماربورغ ، وفيروس الحصبة22.

تمت دراسة جزيء CV-N الصغير بدقة لأكثر من 20 عاما لأنه يعمل على ربط مجموعة واسعة من الفيروسات لمنع دخول الفيروس16,18. تشير التحليلات الهيكلية ومقايسات تقارب الربط إلى الربط المتقاطع لاثنين من Ls في ثنائي CVN2 المبادل بالمجال عن طريق الارتباط ثنائي التكافؤ في نطاق micromolar لتعزيز الحساسية للبروتينات السكرية المغلفة الفيروسية10,19. يتكون الارتباط الانتقائي ل Manα1-2Manα على أذرع Man(8) D1D3 و Man(9) من موقعين ملزمين لهما صلات مختلفة يقعان على بروتومرات البروتينالمعاكسة 20 ، وبالتالي الوصول إلى تقارب الارتباط النانوي (الشكل 1B). وبالتالي ، يعتبر CVN2 جسما مضادا زائفا فيما يتعلق بتطبيقه لربط الحواتم على فيروس نقص المناعة البشرية gp120 ، على غرار الأجسام المضادة المعادلة للفيروس17. هنا ، يهتم المؤلف بالتحقيق في الارتباط المحتمل ل CVN2 بارتفاع SARS-CoV-2 عبر مجال ربط المستقبلات (RBD). تؤدي منحنيات الربط للإنزيم البشري المحول للأنجيوتنسين (ACE) -2 مع SARS-CoV-2 RBD إلى KD = 4.7 نانومتر لهذا التفاعل المرتبط بيولوجيا23.

على النقيض من ذلك ، تتعرف فئات الغلوبولين المناعي المختارة على أنماط البروتين الهيكلية المحددة والمتسقة ، والتي تضفي ركيزة لنضج التقارب في مناطق HA المثبتة بالغشاء24. يظهر CV-N نشاطا قويا للغاية في جميع فيروسات الأنفلونزا A و B تقريبا16 ، وهو عامل مضاد للفيروسات على نطاق واسع. معرفتنا غير مكتملة حول موقع الحلقات المستهدفة على جذع HA1 و HA2 والتي ربما تتضمن هياكل epitopic لاستهداف الجليكان بواسطة أجسام مضادة شديدة التحييد وبالمقارنة مع ربط الليكتين25.

figure-introduction-6575
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لمقايسة ربط SPR ل CV-N إلى طفرات غلاف الفيروس. (أ) مقايسة SPR لربط CV-N بالليجند: بروتين HA كامل الطول (90 كيلو دالتون). مجموعة البيانات الحركية (5120 ، 2560 ، 1280 ، 640 ، 320 ، 160 ، 80 ، 40 ، 20 ، 10 ، 5 ، 2.5 ، 0 نانومتر) تظهر الارتباط المرجعي المزدوج في الوقت الفعلي بالأنفلونزا HA A / New-York / 55/04 (H3N2). (B) ارتباط متغير CVN2L0 V2 بربط DM المجمد ضمن نطاق تركيز يتراوح بين 500 نانومتر و 16 ميكرومتر. التسلسل: يتم تمييز بقايا L باللون الأصفر. يتم تمييز بقايا H باللون الرمادي. E58 و R73 هما بديل للسيستين في البروتين البري ويجعلان V2 طية بروتين مستقرة مع ثلاثة بدلا من أربعة روابط ثاني كبريتيد الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

في حين أن درع الجليكان الموجود على الجزء العلوي من HA البعيد الغشائي يحفز ارتباطا عالي التقارب ب CV-N 12 ، فقد لوحظ ارتباط CVN2 ب HA المجاور لجسر ثاني كبريتيد الجزء العلوي من HA في مواقعه منخفضة التقارب10,12. يتم تحديد التفاعلات القطبية المختلفة ومواقع التفاعل في ربط الكربوهيدرات بواسطة CV-N. يتم التحقق من هذه التفاعلات عن طريق توليد متغيرات خروج المغلوب في موقع الربط لربط صلات الربط في السيليكو المتوقعجليكوزيل 12. وبالتالي ، يهدف المشروع إلى مقارنة ببتيدات HA التي تم اختبارها كيميائيا سابقا في تقارب وخصوصية ملزمة مع تسلسلات ببتيد قصيرة من طفرات 2019-nCoV المرتبطة بالسارس و SARS-CoV-2 ، والتي تحدث بشكل طبيعي معدلة بواسطة عدد صغير من مواقع الجليكوزيل المختلفة المرتبطة ب N والجليكوزيل المرتبط ب O. باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد وفحوصات الربط ، أبلغ بينتو وزملاؤه عن جسم مضاد أحادي النسيلة ، S309 ، من المحتمل أن يتعرف على حاتم على بروتين سبايك SARS-CoV-2 يحتوي على جليكان محفوظ داخل الجنس الفرعي لفيروس Sarbecovirus ، دون التنافس مع مرفق المستقبل26. يصف بروتوكول هذه الدراسة مدى أهمية تصميم متغيرات CV-N والتعبير عنها وتوصيفها لدراسة كيفية ارتباط CV-N و CVN2 بالبروتينات الغليكوزيلاتية والببتيدات الاصطناعية باستخدام تقنية SPR10,12.

يتم التعبير عن ثنائي التدوير المرتبط بالترادف CVN2L027 ومتغيرات موقع الربط (V2-V5) بشكل مؤتلف والمتغيرات مع بدائل رابطة ثاني كبريتيد (C58E و C73R) (الشكل 2 أ). أيضا ، يتم إعداد طفرة مع طفرة أحادية النقطة E41A لأن هذا الموقف ينظر إليه على أنه بقايا تلامس بين الجزيئات. هذا الطفرة هي جزيء آخر مثير للاهتمام لقياسات ربط SPR بين الليكتين والسكريات قليلة السكاريد عالية المانوز التي تفك رموز مجالات الربط وتسمح بالمقارنة مع الشكل الثنائي. يظهر الهيكل البلوري المبدل المجال ل CVN2 رابطا مرنا يمتد بين 49 و 54 بقايا. يمكن أن يستمر المجالان في التحرك حول المفصلة كأجسام صلبة ، ويطوران إما مونومر من خلال تفاعلات المجال داخل الجزيئات (المجال A - بقايا 1-39 ؛ 90-101- مع المجال B - بقايا 40-89) أو ثنائي عن طريق تبديل المجال بين الجزيئات [المجال A (من المونومر الأول) مع المجال B (من الثاني) ، والمجال B (من المونومر الأول) مع المجال A (من النسخة الثانية)]. لا توجد تفاعلات وثيقة بين المجالين A و B للأوليين ، باستثناء Glu4128. يمكن تطوير جين CV-N باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتكررة مع أوليغوس29 المركب 40 مير ثم يتم استنساخه في مواقع NdeI و BamHI ل pET11a للتحويل (التثقيب الكهربائي) إلى خلايا كهروبيئية كما وصفها Keeffe، J.R.27. يتضمن البروتين ، الذي يستخدم لتحقيق البنية البلورية المعنية (PDB ID 3S3Y) ، علامة تنقية N-terminal 6-histidine متبوعة بموقع انقسام البروتياز العامل Xa. يستخدم الطفرات الموجهة للموقع لعمل طفرات نقطية ، وتبديل الكودونات ، وإدخال أو حذف قواعد أو كودونات مفردة أو متعددة لتبادل الأحماض الأمينية. توفر هذه التحولات نظرة ثاقبة لا تقدر بثمن في وظيفة البروتين وهيكله. تمت دراسة CV-N و CVN2 و CVN3 المعبر عنها وتنقيتها بشكل جيد من الناحية الفيزيائية الحيوية20،21،27 ، وهي رخيصة الإنتاج ، وبالتالي تستخدم لتوصيف مقايسات الربط بالجليكان المثبت على رقائق مستشعر SPR. يوفر مقايسة الممتز المناعي التقليدي المرتبط بالإنزيم (ELISA) قابلية استنساخ أقل فيما يتعلق بتقنية تجميد روابط الجليكان ويحول الارتباط في الوقت الفعلي لمتغيرات موقع الربط المختلفة ، والتي تظهر ل SPR ، إلى مقايسات نقطة النهاية.

يتم التعبير عن متغير التقارب المرتبط CVN2L0-V2 (طية سليمة من CV-N المتجانس مع استبدال جسر ثاني كبريتيد10) بعلامة His-tag في الإشريكية القولونية (E. coli) ، ويتم تنقيتها فوق عمود Ni-NTA باستخدام كروماتوغرافيا التقارب واختبارها للارتباط ب HA (H3N2) ، ببتيد HA-أحادي المانوسيلات وببتيد HA-ثنائي المانوسيلات باستخدام SPR. الببتيدات المانوسيلية كيميائيا ، أو بروتين HA و S ، كلها روابط وأمين مقترنة بسطح الرقاقة المحبة للماء عن طريق الإسترات التفاعلية أو هندسة بروتين البيوتين ستربتافيدين. يتم تطبيق نفس الإجراء الخاص بالتشغيل المتسلسل على تلك الروابط ، وحقن التخفيفات المختلفة ل CV-N ومتغيرات CV-N (و CVN2) للحصول على معلومات حركية لتحليلات التفاعل الجزيئي كما هو موضح أدناه30. تستخدم رقاقة مستشعر SPR المجمدة RBD لدراسات الربط على ببتيدات CV-N إلى S ، وتتم مقارنة الصلات بربط SARS-CoV-2 مع ACE2 البشري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام بروتين اندماج صغير يشبه يوبيكويتين (SUMO) CVN في مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم بدلا من CV-N وهو مناسب للمقايسات القائمة على الخلايا. يتم الحصول على بروتين HA H3 لفيروس الأنفلونزا الكامل المؤتلف تجاريا (انظر جدول المواد) أو يتم التعبير عنه في خطوط خلايا HEK293 في الثدييات وخلايا الحشرات المصابة بالفيروس البقعي وفقا للبروتوكولات القياسية12. يتم التعبير عن بروتين سبايك Wuhan-1 في خلايا HEK293 في الثدييات. يسمح تخليق الببتيد أحادي المومانوسيلات (MM) والببتيد ثنائي المونيل (DM) بالكشف عن الروابط المتجانسة ل CVN2 والجزيء الصغير أحادي المومانوسيلات10.

1. إنشاء هياكل CV-N

  1. لكل من متغيرات CVN2 وبروتين CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) ، احصل على بنية الجين بتسلسل قائد pelB N-terminal وعلامة His-tag في pET27b (+) من مصادر تجارية (انظر جدول المواد ، الملف التكميلي 1).
  2. الحصول على CVN2L0 ومتغيراته (V2 و V3 و V4 و V5 ؛ الشكل 2A ، C) في خلفية جين قالب CVN2L0 يتكون من تسلسلين مختلفين من الحمض النووي لكل تكرار CV-N.
  3. إذابة الحمض النووي البلازميد المجفف بالتجميد في الماء المقطر المعقم منزوع الأيونات (ddH2O) إلى تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام / ميكرولتر.

2. تحضير صفائح LB-agar مع خلايا الحمض النووي المحول للبلازميد

  1. تحضير وسط الاستزراع LB-Lennox عن طريق إذابة 10 جم / لتر من الببتون ، و 5 جم / لتر من خلاصة الخميرة ، و 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم في ddH2O (انظر جدول المواد) ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. قم بإجراء التحويل إلى E. coli BL21 (DE3) المختصة لكل متغير (V2-V5) بالطريقة الكيميائية بعد تقرير منشور مسبقا10.
  2. قم بتقسيم المحلول (900 ميكرولتر و 100 ميكرولتر) ، وانقل 100 ميكرولتر على ألواح LB-agar (50 ميكروغرام / مل كاناميسين) ، واستخدم برفق موزع الخلايا المعقمة. احتضان ألواح الآجار طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

3. الاستنساخ

  1. استنساخ جين CV-N في مواقع NdeI و BamHI ل pET11a (انظر جدول المواد) للتحويل (التثقيب الكهربائي) إلى خلايا كهروبيئية بعد المرجع27.

4. الطفرات الموجهة للموقع

  1. لتوليد CVN2L029 و CVN-E41A الطافر في خلفية جين قالب CVN2L0 يحتوي على تسلسلين متميزين للحمض النووي لكل CV-N كرر27.
  2. قم بإجراء طفرات باستخدام مجموعة الطفرات الموجهة للموقع (انظر جدول المواد) وبادئات مطفرة محددة 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' و 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' لتشغيل PCR31.
    1. ابدأ سلسلة من تفاعلات العينات باستخدام تركيزات متعددة من قالب الحمض النووي المزدوج (dsDNA) تتراوح من 5-50 نانوغرام (على سبيل المثال ، 5 و 10 و 20 و 50 نانوغرام من قالب dsDNA). حافظ على تركيز التمهيدي ثابتا.
      ملاحظة: يتم استخدام مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل وبروتوكول الدورة الحرارية بشكل عام كما هو موضح في دليل التعليمات لمجموعة الطفرات الموجهة للموقع32.
  3. أضف إنزيم تقييد Dpn I (1 ميكرولتر ، 10 وحدة / ميكرولتر ، انظر جدول المواد) أسفل تراكب الزيت المعدني. امزج التفاعلات جيدا وبلطف ، وقم بتدويرها لأسفل في جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة لمدة 1 دقيقة ، واحتضانها على الفور عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لهضم dsDNA الأبوي فائق الالتفاف.

5. تحول الخلايا البكتيرية

  1. قم بإذابة الخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue (انظر جدول المواد) برفق على الجليد. لتحويل كل عنصر تحكم وتفاعل عينة ، قم بتقسيم الخلايا فائقة الكفاءة (50 ميكرولتر) إلى أنبوب دائري القاع من مادة البولي بروبيلين المبردة مسبقا (14 مل).
    1. نقل 1 ميكرولتر من الحمض النووي أحادي الشريط المعالج ب Dpn I (ssDNA) من كل تفاعل تحكم وعينة (ssDNA متحور) لفصل حصص الخلايا فائقة الكفاءة ، والتي توليف الشريط التكميلي. حرك تفاعلات التحول بعناية لخلط واحتضان التفاعلات على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: قبل نقل الحمض النووي المعالج ب Dpn I إلى تفاعل التحويل ، يوصى بإزالة أي زيت معدني متبقي بعناية من طرف الماصة. كعنصر تحكم اختياري ، يجب فحص كفاءة تحويل الخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue عن طريق خلط 0.1 نانوغرام / ميكرولتر من بلازميد التحكم pUC18 (1 ميكرولتر) مع حصص 50 ميكرولتر من الخلايا فائقة الكفاءة.
  2. ضع نبضة حرارية على تفاعلات التحول عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ثم ضع التفاعلات على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: تم بالفعل تحسين النبض الحراري المطبق للظروف المذكورة في أنابيب البولي بروبلين المستديرة القاع (14 مل).
  3. أضف 0.5 مل من مرق NZY + (يحتوي على لكل لتر: 10 جم من أمين NZ (تحلل الكازين المائي) ، 5 جم من مستخلص الخميرة ، 5 جم من كلوريد الصوديوم ، 12.5 مل من 1 M MgCl2 ، 12.5 مل من 1 M MgSO4 ، 10 مل من 2 M جلوكوز ، درجة حموضة 7.5 ، ومسخن مسبقا إلى 42 درجة مئوية) واحتضان تفاعلات التحول عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225-250 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. قم بلوحة الحجم الصحيح لكل تفاعل تحويل (5 ميكرولتر من تحويل بلازميد التحكم ؛ 250 ميكرولتر من تحويل العينة) على ألواح أجار LB-ampicillin.
    ملاحظة: بالنسبة لضوابط التحول والطفرات، انشر الخلايا على ألواح أجار LB-ampicillin التي تحتوي على 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-D-galactopyranoside (X-gal، 80 ميكروغرام/مل) وإيزوبروبيل-1-ثيو-β-D-غالاكتوبيرانوسيد (IPTG، 20 mM) (انظر جدول المواد). تلقيح 50 مل من مزارع الخلايا بمستعمرة واحدة من E المتحولة. خلايا قولونية لتنقية الحمض النووي البلازميد المتحور للتحليلات. يتم تأكيد الطفرات عن طريق تسلسل الحمض النووي في منشأة خارجية.

6. التعبير وتنقية البروتين

  1. للحصول على ثقافة واسعة النطاق ، قم بتلقيح كمية صغيرة من LB (تحتوي على الأمبيسلين) بمستعمرة واحدة من اللوحة المحولة.
  2. باستخدام الثقافة الليلية ، قم بتلقيح ثقافة التعبير بإضافات ، مثل 10 mM من MgCl2 ، و 10 mM من MgSO 4 ، و 20 mM من الجلوكوز، مما يخفف من ثقافة البذور إلى 1/100.
    1. تنمو الخلايا مع اهتزاز قوي عند 37 درجة مئوية. تنمو الخلايا إلى ABS 600 نانومتر بين 0.4-0.6 (مرحلة منتصف السجل) قبل تبريد الخلايا إلى 20 درجة مئوية. حث مع 1 mM IPTG وتنمو بين عشية وضحاها.
    2. بعد ذلك ، احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وأعد الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثم ، تجاهل الطاف مع ماصة. أعد تعليق الحبيبات المتبقية في 10 مل من محلول التحلل واحتضان التعليق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تركيب محلول التحلل: (50 mM من NaH 2 PO4، 300 mM من كلوريد الصوديوم، 2٪ Triton-X100، 500 نانوغرام/مل من الليزوزيم، 1 mM من فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF)، 1 mM من ثنائي ثيوثريتول، 1 mM من MgCl2، الرقم الهيدروجيني 8، انظر جدول المواد).
    1. أخضع الخليط لدورتي تجميد وذوبان (-80 درجة مئوية). فصل الكسور القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) ، على وجه الخصوص ، كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) - الصفحة33 (الشكل 2B ، C).
      ملاحظة: يمكن تحلل الخلايا بعدة طرق ، مثل ذوبان الجليد بالتجميد ، أو الصوتنة ، أو التجانس ، أو التحلل الأنزيمي ، أو مزيج من هذه الطرق. يوصى بالتنقية من هيئات التضمين لجمع غلات البروتين العالية26.
  4. تنقية البروتينات باستخدام كروماتوغرافيا عمود Ni-NTA (انظر جدول المواد). قم بتحميل الكسر القابل للذوبان على عمود حبة Ni-NTA المجدد (1 مل / دقيقة). اغسل النظام بمخزن TBS المؤقت (50 مللي متر من Tris ، 150 mM من كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.5) قبل بدء التدرج (0-100٪ 500 mM imidazole في TBS على مدار 60 دقيقة) وجمع الكسور (1 مل / دقيقة). غسيل البروتينات المنقاة للتوصيف الكيميائي الحيوي مقابل 100 mM PBS (الشكل 2C ، D).
  5. بدلا من ذلك ، استخدم جل التقارب His-Select Ni2+ (انظر جدول المواد) في أنابيب سعة 14 مل لربط وإعادة تعليق CV-N المعبر عنه المؤتلف الموسوم به في المحاليل العازلة مع 20 mM imidazole و 250 mM imidazole ، على التوالي. احتضان دفعة واحدة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: قم بتطبيق هذه البروتينات شبه المنقاة على عمود معبأ مسبقا للاستخدام مرة واحدة لتبادل المخزن المؤقت وتنظيف العينات البيولوجية ، على سبيل المثال ، الكربوهيدرات والبروتينات ، والتي يمكن أن تحمل 1-1.5 مل من كروماتوغرافيا التقارب المعدني الثابت.
  6. نقل محاليل البروتين إلى أنابيب الطرد المركزي مع مرشح قطع 10 كيلو دالتون (انظر جدول المواد) وتركيزها عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 4500 × جم و 4 درجات مئوية. بالنسبة لقياسات SPR ، استبدل المحاليل المراد تحليلها ب 10 mM HEPES ، و 150 mM كلوريد الصوديوم ، و 3 mM من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، و 0.05٪ Tween20 ، و pH 7.4 (HBS-EP (+) ، انظر جدول المواد).
    1. أضف هذا المخزن المؤقت لتشغيل SPR إلى عامل تخفيف 1:10 وأجهزة طرد مركزي أربع مرات إلى الحجم الأولي لمدة 10 دقائق عند 4500 × جم و 4 درجات مئوية.
  7. تحديد تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop UV-Vis (انظر جدول المواد) بناء على معامل الانقراض المحسوب (20,440 M-1 cm-1) للبروتين الرئيسي CVN2L0 الذي يظهر حجما 23,474 Da34. استخدم PBS (100 mM ، pH 7.0) أو SPR buffer كفراغ ، وقم بقياس تركيز البروتين في ثلاث خطوات تخفيف (1: 1 ، 1: 10 ، و 1: 100).

figure-protocol-9658
الشكل 2: تسلسلات CV-N والتعبير. (أ) يتم التعبير عن CVN2 بدون رابط بين كل تكرار CV-N (101 حمض أميني لكل منهما) وأربعة جسور ثاني كبريتيد في متجه pET11a في E. القولونية. (ب) تعبيرات مستعمرتين مستقلتين ل CV-N (مونومر) و CVN2 (ديمر). (ج) يتم تنقية متغيرات رابطة ثاني كبريتيد وتحليلها على SDS-PAGE. يتم استخدام علامة الوزن الجزيئي المنخفض (6 ميكرولتر) كمرجع. WT = CVN2L0 تحمل أربعة جسور ثاني كبريتيد كما هو موضح في (A). V2 هو متغير مع استبدال رابطة ثاني كبريتيد ببقايا قطبية في الموضعين 58 و 73. V3-V5 هي متغيرات مع اثنين من روابط S-S المتبقية وإما قطبية (C58E-C73R) أو غير قطبية (C58W-C73M) تحل محل الأحماض الأمينية أو مزيج من بدائل زوج البقايا هذه. (د) يتم استخلاص كروماتوجرام HPLC ل CVN2L0 المنقى بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة مع تدرج خطي من 5٪ -65٪ مخزن مؤقت B في المخزن المؤقت A على مدار 30 دقيقة. المخزن المؤقت A هو: 0.1٪ (v / v) حمض ثلاثي فلورو أسيتيك في ddH2O ، المخزن المؤقت B هو: 0.08٪ (v / v) حمض ثلاثي فلورو أسيتيك في الأسيتونيتريل. يتم تحليل البروتين على عمود هلام السيليكا عالي الأداء 300-5-C4 (150 × 4.6 مم) عند 214 نانومتر و 280 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

7. التحليل الطيفي SPR

  1. استخدم نظام SPR ثنائي القناة (انظر جدول المواد) مع تشغيل المخزن المؤقت HBS-EP (+) و 10 mM glycine HCl pH 1.5-1.6 كمخزن مؤقت للتجديد. قم بتشغيل الجهاز ، وجهاز إزالة العينات ، وأخذ العينات التلقائي ، وضخ وغسل النظام بأكمله باستخدام ddH20 لمدة 1 ساعة. ضع المخزن المؤقت للتشغيل الجاهز للاستخدام في زجاجة منفصلة.
  2. قم بإسقاط زيت الانتفاخ على الكاشف وقم بتركيب شريحة مستشعر زجاجية (انظر جدول المواد) مطلية بغشاء ذهبي رقيق وعلى الجانب العلوي تعمل بهيدروجيل كربوكسي ميثيل ديكستران مباشرة على الكاشف أسفل خلية التدفق ثلاثية المنافذ. قم بإصلاح الإعداد عن طريق سحب المناولة لأسفل.
    ملاحظة: C19RBDHC30M 200 نانومتر ستربتافيدين مشتق كربوكسي ميثيل ديكستران هيدروجيل مع كثافة متوسطة من بروتين فيروس كورونا 2 RBD المصاب بالبيوتينيل المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة ، هو عبارة عن شريحة استشعار جاهزة للاستخدام مع ليجند مثبت مسبقا.

8. مقايسة ربط SPR لربط CV-N ببروتين HA و S و RBD

  1. شل حركة الروابط البروتينية إلى رقائق المستشعر باتباع الخطوات أدناه.
    1. افتح جدول تشغيل بالنقر فوق نموذج في شريط القائمة وتشغيل محرر الجدول في برنامج SPRAutoLink المدمج (انظر جدول المواد). اختر وانقر فوق BASIC_Immobilization من قائمة جداول التشغيل المتاحة واتبع خطوات الإجراء التجريبي على شاشة الكمبيوتر. يظهر محرر النماذج المستخدم في الزاوية العلوية اليمنى.
    2. انقر فوق محرر مجموعة العينات في قسم النموذج لملء قائمة الكواشف لرفين موضوعين في أخذ العينات الأوتوماتيكي لمزيد من التحليلات. انقر فوق التحكم المباشر في أخذ العينات التلقائي ك "أداة" في شريط القائمة لإعادة الرفوف إلى الأمام أو إلى المنزل. اختر 4 درجات مئوية كدرجة حرارة التشغيل.
      ملاحظة: يسمح برنامج SPR ب "التحكم المباشر في أداة SPR" و "التحكم المباشر للمضخة" عن طريق اختيار الأدوات المقابلة ، بالإضافة إلى معالجة أخذ العينات التلقائي ، والنقر فوق النموذج ؛ كما يمكن اختيار تشغيل محرر الجدول أو مخطط البيانات أو المعالجة اللاحقة لإجراء تحليل البيانات. يتم حفظ الملفات مباشرة في الدليل الافتراضي وتصديرها كملفات scrubber.files من نافذة ما بعد المعالجة.
  2. ابدأ تشغيل المضخة لبث ddH20 بالنقر فوق أدوات والتحكم المباشر في المضخة وتسجيل البيانات بالنقر فوق التحكم المباشر في أداة SPR ، وفي كل مرة ابدأ في النوافذ التي تظهر حديثا. ضع كواشف التوصيل (الخطوة 8.3) في قارورة سعة 300 ميكرولتر ، وضعها في رفوف أخذ العينات الأوتوماتيكية وابدأ جدول التشغيل بالنقر فوق تشغيل.
    ملاحظة: يتم تكييف أسطح الرقائق إما بمحلول جليكاين 10 mM pH 9.0 أو ربما تم غسلها باستخدام 1 M كلوريد الصوديوم ، 0.1 M محلول بورات الصوديوم pH 9.0 لتكييف سطح رقاقة مشتق من الكربوكسيل لمزيج تنشيط EDC / NHS30.
  3. لهذا التفاعل البسيط بين البروتين والبروتين ، استخدم شريحة CMD500D (انظر جدول المواد) لإنشاء وحدات معامل الانكسار الدقيق (μRIU) = 2500 - 3000 خلية تدفق مع HA و μRIU = 400 خلية تدفق مع بروتين سبايك. عند معدل تدفق لبث يبلغ 15 ميكرولتر / دقيقة ، قم بحقن خليط مائي ومتساو من 0.4 M N-ethyl-N'- (dimethylaminopropyl) كربودايميد هيدروكلوريد (EDC * HCl) و 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS) عن طريق تطبيق الخطوات المتسلسلة التالية.
    1. إعادة تعبئة مضخة إعادة الملء عند 25000 ميكرولتر / دقيقة ، وإجراء تعديل خط الأساس لمدة 30 ثانية ، وحقن 90 ميكرولتر من محلول تنشيط العينة (EDC / NHS) على مدار 6 دقائق من وقت الاتصال ، ثم الاستمرار لمدة 5 دقائق أخرى.
    2. كرر هذه الدورة بعد تشغيل خط الأساس لمدة دقيقة واحدة عند 10 ميكرولتر / دقيقة على خلية التدفق اليسرى فقط (الأزرق) لحقن وشل حركة الببتيدات المركبة كيميائيا 10 و HA وبروتين السنبلة عند20 ميكروغرام / مل ، والسماح بتعديل خط الأساس اللاحق باستخدام ddH2O لمدة 1.5 دقيقة قبل إخماد سطح الرقاقة المنشط ب 1 M إيثانولامين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5.
  4. قم بتبديل الأنابيب من جهاز أخذ العينات السائل إلى جهاز إزالة الغازات من ddH20 إلى الزجاجة باستخدام HBS-EP (+) (الشكل التكميلي 1).
  5. تحليل مخططات استشعار SPR.
    1. لإجراء دراسات حركية ، استخدم تركيزات تحليلية مختلفة (10-5-10-8 م) ، مع خطوة تجديد بعد كل حقنة وقياسات فارغة بعد تحليلات مختلفة. قم بتغيير معدل التدفق إلى 10 ميكرولتر / دقيقة وابدأ الحقن لمدة 4 دقائق من وقت التلامس ، ثم 5 دقائق من توليد خط الأساس ، وخطوتين تجديد مدة كل منهما 2 دقيقة بفاصل 30 ثانية.
    2. حقن المحلول العازل للقياسات الفارغة التي يتم طرح أجهزة الاستشعار الخاصة بها من تشغيل العينات لتطبيع تركيزات البروتين المختلفة.
  6. انقر فوق النموذج ، وقم بالتمرير لأسفل ، وقم بالتغيير إلى "المعالجة اللاحقة" بالنقر فوق وضع التشغيل هذا. انقر فوق إضافة لتحديد منحنيات الربط التي تم إنشاؤها بمرور الوقت في نموذج مخطط البيانات لكل خلية تدفق ، وقم بتصدير التراكب كملف تنقية (.ovr). انقر فوق ملف لفتح خيارات حفظ الملف. احصل على منحنيات الاستجابة عن طريق محاذاة منحنيات اليسار واليمين وطرح إشارات القناة المرجعية الثانية من إشارات قناة الرباط.
    ملاحظة: يتم تشغيل البيانات في "مرحلة ما بعد المعالجة" عن طريق تحديد المخططات الحسية حسابيا. يتم وضعه في تراكب من المخططات الحسية من خلايا التدفق اليمنى واليسرى ، أو يتم تمثيله كمخططات حسية من اختلاف كلتا القناتين.
  7. نظف السوائل بالكامل باستخدام 50-100 مللي مول من محلول الجلايسين بدرجة حموضة 9.5 وماء و 20٪ إيثانول قبل وبعد قياسات الربط لإزالة آثار الملح أو أي تلوث بالبروتين ، أو أكثر صرامة ، مع 0.5٪ SDS وجلايسين.
    ملاحظة: لمنع تلف الجهاز ، يوصى بالتحقق من الاستقرار الميكانيكي للرقاقة الزجاجية قبل إعادة إدخال خرطوشة الرقاقة في الجهاز إذا تم تخزين الرقائق تحت المخزن المؤقت أو في رطوبة 100٪.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم اختبار جزيء CVN2L0 ثنائي المجال المبدل للارتباط بالمنطقة العليا HA في ثلاث تجارب SPR منفصلة ويتم تقديم تقارب الربط بقيم KD. يفترض أن المجال B يشتمل على مواقع ربط H ، والتي تتأثر باستبدال رابطة ثاني كبريتيد في بقايا أيونية ، ويشكل المجال A L10,18. يتم اختبار ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يرتبط تقارب ربط CV-N بعدد مواقع الربط الوظيفية [2H على المجالات B ، و 2L على المجال (المجالات) A عند هندستها كثنائي مبدل بالمجال]. يتم التعبير عن متغير مع تقارب ربط متغير (CVN2L0-V2 ، طية مستقرة متجانسة من CV-N تتكون من ضربة قاضية لجسر ثاني كبريتيد) في الإشريكية القولونية ، وتنقيتها ، واختبارها إيجا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.

Acknowledgements

يعترف المؤلف بالدكتور كريستيان ديرنتل من قسم التكنولوجيا الحيوية وعلم الأحياء الدقيقة في TU Wien وقسم الطب الثالث ، قسم أمراض الكلى وغسيل الكلى في جامعة فيينا الطبية ، وخاصة الدكتور ماركوس وهرمان للدعم الفني والعلمي. تم دعم تعبير البروتين في خلايا الثدييات من قبل قسم التكنولوجيا الحيوية في جامعة الموارد الطبيعية وعلوم الحياة (BOKU) في فيينا. تريد الكاتبة أن تعرب عن تقديرها العميق للدكتور نيكو دانكبار من XanTec bioanalytics في دوسلدورف ، ألمانيا ، لإجراء مناقشات علمية مفيدة حول إجراء فحوصات ربط SPR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Äkta primeplusCytiva
Amicon tubesMerckC7715
AmpillicinSigma-AldrichA5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifugeBeckman CoulterB06320
Cell spreaderSigma-AldrichHS86655silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA OligosSigma-AldrichOLIGO
Custom GensynthesisGenScript#1390661 cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mLThermo Scientific50-105-5354
Dionex UlitMate 3000Thermo ScientificIQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) Fisher ScientificER1701
DTTMerckDTT-RO
EDCMerck39391
EDTAMerckE9884
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120086
Eppendorf Safe-Lock TubesEppendorf30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifugeSigma-AldrichZ606235
EthanolMerck51976
Ethanolamine HClMerckE6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/PackCorning352057
GlucoseMerckG8270
Glycine HClMerck55097
HA H3 proteinAbcamab69751
HEPESMerckH3375
His-select Ni2+MerckH0537
ImidazoleMerckI2399
IPTGMerckI6758
Kanamycin ASigma-AldrichK1377
Kromasil 300-5-C4Nouryon
LB agarMerck52062
LB agarMerck19344
LB LennoxMerckL3022
LysozymeMerck10837059001
Magnesium chlorideMerckM8266
Magnesium sulfateMerckM7506
NaH2P04MerckS0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometerThermo ScientificND2000CLAPTOP
NaOHMerckS5881
NHSMerck130672
NZ amine (casein hydrolysate)MerckC0626
PBSMerck806552
PD MidiTrap G-10Sigma-AldrichGE28-9180-11
PeptoneMerck70171
pET11aMerck Millipore (Novagen)69436 
PMSFMerckPMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)Qiagen27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel SystemReichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysisReichert
SDSMerck11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmidStratagene#200518
Sodim chlorideMerckS9888
Sodium acetate.TrihydrateMerck236500
SPR sensor chip C19RBDHC30MXanTec bioanalyticsSCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500DXanTec bioanalyticsSCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri DishesThermo Scientific101R20
TBSMerckT591210x, solution
Triton-X100MerckT8787
TryptoneMerck93657
Tween20MerckP1379
Vortex-Genie 2 MixerMerckZ258423
X-galMerckXGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent CellsStratagene#200236
Yeast extractMerckY1625

References

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26(2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621(2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184 Cyanovirin N

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved