JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير متحدة البؤرة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية. تشمل أوضاع الاندماج هذه 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والتشغيل) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الانصهار ، 2) الاندماج ، الذي ينطوي على فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار الانكماشي ، الذي ينطوي على انكماش الحويصلة المنصهرة.

Abstract

يتوسط فتح وإغلاق المسام الانصهارية الديناميكية الإفرازات الخارجية وكثرة الخلايا الداخلية وتحديد حركياتها. هنا ، يتضح بالتفصيل كيف تم استخدام المجهر البؤري في تركيبة مع تسجيل المشبك الرقعة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية في الزراعة الأولية. تشمل أوضاع الاندماج الثلاثة 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والجري) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الاندماج ، 2) الاندماج المتبقي ، الذي يتضمن فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار المتقلص ، الذي ينطوي على انكماش ملف تعريف Ω الشكل المتولد عن الاندماج حتى يندمج تماما في غشاء البلازما.

للكشف عن أوضاع الاندماج هذه ، تم تسمية غشاء البلازما عن طريق الإفراط في التعبير عن mNeonGreen المرتبط بمجال الأس الهيدروجيني للفوسفوليباز C δ (PH-mNG) ، والذي يرتبط بالفوسفاتيديلينوسيتول-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) في النشرة المواجهة للسيتوسول من غشاء البلازما. تم تحميل الحويصلات بالناقل العصبي الكاذب الفلورسنت FFN511 للكشف عن إطلاق المحتوى الحويصلي. وتم تضمين Atto 655 في محلول الحمام للكشف عن إغلاق مسام الانصهار. تم تصوير هذه المجسات الفلورية الثلاثة في وقت واحد عند ~ 20-90 مللي ثانية لكل إطار في خلايا الكرومافين الحية للكشف عن فتح مسام الاندماج ، وإطلاق المحتوى ، وإغلاق مسام الاندماج ، وتغيرات حجم الحويصلة المنصهرة. تم وصف طريقة التحليل للتمييز بين ثلاثة أوضاع اندماج من قياسات التألق هذه. يمكن أن تنطبق الطريقة الموصوفة هنا ، من حيث المبدأ ، على العديد من الخلايا الإفرازية خارج خلايا الكرومافين.

Introduction

يتوسط الاندماج الغشائي العديد من الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك الانتقال المشبكي ، وتوازن الجلوكوز في الدم ، والاستجابة المناعية ، والدخول الفيروسي1،2،3. إفراز الخلايا الخارجية ، الذي ينطوي على اندماج الحويصلة في غشاء البلازما ، يطلق الناقلات العصبية والهرمونات لتحقيق العديد من الوظائف الهامة ، مثل أنشطة الشبكة العصبية. يفتح الانصهار مسام لإطلاق محتويات حويصلية ، وبعد ذلك قد تغلق المسام لاسترداد الحويصلة المنصهرة ، والتي تسمى قبلة وتشغيل 1,4. يمكن قياس كل من فتحة مسام الاندماج التي لا رجعة فيها وعكسها باستخدام تسجيلات السعة المرفقة بالخلايا جنبا إلى جنب مع تسجيلات توصيل مسام الاندماج لاندماج حويصلة واحدة.

غالبا ما يفسر هذا على أنه يعكس اندماج كامل الانهيار ، بما في ذلك تمدد الاندماج حتى تسطيح حويصلة الصمامات ، والتقبيل والتشغيل ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الاندماج ، على التوالي5،6،7،8،9،10،11،12،13 . لاحظت الدراسات التصويرية الحديثة لاستنفاد الانبعاثات البؤرية والمحفزة (STED) في خلايا الكرومافين مباشرة فتح وإغلاق مسام الاندماج (قبلة وتشغيل ، وتسمى أيضا الانصهار القريب) ، وفتح مسام الاندماج الذي يحافظ على شكل Ω مع مسام مفتوحة لفترة طويلة ، يسمى الاندماج المتبقي ، وتقلص حويصلة الصمامات حتى تكتمل مع غشاء البلازما ، الذي يحل محل الاندماج الكامل لدمج الحويصلات الاندماجية مع غشاء البلازما4 ، 8,14,15,16,17.

في الخلايا العصبية، تم الكشف عن فتح وإغلاق مسام الاندماج مع التصوير الذي يظهر إطلاق النقاط الكمومية المحملة مسبقا في الحويصلات التي هي أكبر من مسام الاندماج ومع قياسات توصيل مسام الاندماج في وجه إطلاق المحطات العصبية5،18،19. تستخدم خلايا الكرومافين الكظرية على نطاق واسع كنموذج لدراسة كثرة الخلايا الخارجية والداخلية20,21. على الرغم من أن خلايا الكرومافين تحتوي على حويصلات كبيرة كثيفة النواة ، في حين أن المشابك العصبية تحتوي على حويصلات متشابكة صغيرة ، فإن بروتينات الإفرازات الخارجية وكثرة الخلايا الداخلية في خلايا الكرومافين والمشابك العصبية متشابهة تماما 10,11,12,20,21,22,23.

هنا ، يتم وصف طريقة لقياس أوضاع الاندماج الثلاثة هذه باستخدام طريقة تصوير متحدة البؤرة جنبا إلى جنب مع الفيزيولوجيا الكهربية في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية (الشكل 1). تتضمن هذه الطريقة تحميل الناقلات العصبية الكاذبة الفلورية (FFN511) في الحويصلات للكشف عن الإفرازات الخارجية. إضافة Atto 655 (A655) في محلول الحمام لملء ملف تعريف Ω الشكل المتولد عن الانصهار ، ووضع علامات على غشاء البلازما مع مجال PH من δ الفوسفوليباز C (PH) ، والذي يرتبط ب PtdIns(4,5)P2 في غشاء البلازما 8,15,24. يمكن الكشف عن ديناميكيات المسام الانصهارية من خلال التغيرات في كثافة الفلورسنت المختلفة. على الرغم من وصفها لخلايا الكرومافين ، إلا أن مبدأ هذه الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقه على نطاق واسع على العديد من الخلايا الإفرازية خارج خلايا الكرومافين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: اتبع إجراء استخدام الحيوانات إرشادات المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المعاهد الوطنية للصحة.

1. زراعة خلايا الكرومافين البقرية

  1. قم بإعداد حل لوك (الجدول 1) وأدوات الأوتوكلاف قبل يوم واحد من زراعة خلايا الكرومافين.
  2. احصل على الغدد الكظرية البقرية من مسلخ محلي في يوم الثقافة ، واحتفظ بها مغمورة في محلول لوك البارد قبل تشريحها.
    ملاحظة: الغدد الكظرية هي من 21-27 شهرا ، صحية ، أنجوس سوداء من أي من الجنسين (الذكور بشكل رئيسي) مع وزن الجسم حوالي 1400 رطل (~ 635 كجم).
  3. تحضير 30 مل (ل 3 غدد كظرية) من محلول إنزيم طازج يحتوي على الكولاجيناز P ومثبط التربسين وألبومين مصل البقر (الجدول 1) قبل تشريحه والاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة.
  4. اختر 3 غدد سليمة دون جروح أو نزيف على السطح وقم بإزالة الأنسجة الدهنية بالمقص (الشكل 1A). اغسل الغدد عن طريق التروية بمحلول لوك حتى لا يخرج الدم. لتحقيق ذلك ، قم بتضخيم الغدة عبر الوريد الكظري (الشكل 1 ب) باستخدام حقنة 30 مل متصلة بمرشح 0.22 ميكرومتر عدة مرات حسب الحاجة25.
    ملاحظة: عادة ما تكون هناك حاجة إلى حوالي 150 مل من محلول لوك لغسل 3 غدد.
  5. للهضم ، حقن محلول الإنزيم من خلال الوريد الكظري باستخدام حقنة 30 مل متصلة بمرشح 0.22 ميكرومتر حتى تبدأ الغدة في الانتفاخ. ثم اترك الغدد عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حقن مرة أخرى وترك الغدد في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أخرى.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى حوالي 30 مل من محلول الإنزيم لهضم 3 غدد.
  6. بعد الهضم ، اقطع الغدة طوليا من الوريد إلى الطرف الآخر باستخدام مقص لكشف الغدة (الشكل 1C). اعزل النخاع عن طريق إخراج النخاع الأبيض في طبق بتري بحجم 10 سم يحتوي على محلول لوك.
    ملاحظة: تظهر مقارنة الجزء الداخلي من الغدة قبل وبعد الهضم في الشكل 1C. تم الإبلاغ عن تفاصيل عزل الهضم والنخاع سابقا23,25.
  7. قطع النخاع وفرمه إلى قطع صغيرة بالمقص (الشكل 1D). قم بتصفية تعليق النخاع باستخدام شبكة نايلون 80-100 ميكرومتر في دورق. ثم انقل الترشيح إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل للطرد المركزي عند 48 × جم ، درجة حرارة الغرفة ، لمدة 3 دقائق مع تباطؤ 3.
    ملاحظة: عادة ما يستغرق فرم النخاع حوالي 10 دقائق. للحصول على عائد جيد من الخلايا ، يجب أن تكون القطع المفرومة صغيرة جدا ، حتى لا يمكن ملاقطها.
  8. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant وأعد تعليق حبيبة الخلية بمحلول لوك عن طريق السحب. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة 80-100 ميكرومتر ، وأجهزة طرد مركزي عند 48 × جم ، درجة حرارة الغرفة ، لمدة 3 دقائق مع تباطؤ 3.
  9. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 30 مل من وسط الثقافة (الجدول 1). أوجد رقم الخلية باستخدام غرف عد مقياس الدم25.

2. النقل مع الكهرباء

  1. نقل 2.8 × 106 خلايا إلى أنبوب 15 مل. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 48 × جم لمدة 2 دقيقة مع تباطؤ 3. أضف 100 ميكرولتر من مخزن النقل المؤقت (انظر جدول المواد) الذي توفره الشركة المصنعة إلى بيليه الخلية ، ثم أضف 2 ميكروغرام من بلازميد PH-mNG.
    ملاحظة: تم إنشاء بلازميد PH-mNG عن طريق استبدال بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) ب mNG في PH-EGFP15 (انظر جدول المواد).
  2. امزج التعليق بلطف عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل ، وانقل الخليط إلى كوفيت كهربائي دون تأخير (الشكل 1E). انقل الكوفيت على الفور إلى المسام الكهربائية (انظر جدول المواد) ، وحدد برنامج O-005 في قائمة الشاشة واضغط على Enter لإجراء الفحص الكهربائي.
    ملاحظة: قم بإعداد تعليق الخلية للنقل في غطاء زراعة الخلية. لا تقم بإدخال فقاعات الهواء في التعليق أثناء خطوة الخلط. انتقل إلى الخطوة التالية دون تأخير.
  3. بعد المعالجة الكهربائية ، أضف 1.8 مل من الوسط على الفور إلى الكوفيت واخلطه بلطف مع ماصة دقيقة مجهزة بطرف معقم. ثم أضف 300 ميكرولتر من تعليق الخلايا الكهربائية أعلى الغطاء (انظر جدول المواد) في كل طبق ، مع طلاء 5-6 أطباق في المجموع لتفاعل كهربائي واحد.
  4. انقل الأطباق بعناية إلى حاضنة مبللة عند 37 درجة مئوية مع 9٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة ، وأضف بلطف2 مل من الوسط المسخن مسبقا إلى كل طبق بعد 30 دقيقة.
  5. حافظ على الخلايا المنقولة في الحاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية مع 9٪ CO 2 لمدة2-3 أيام قبل التجربة.
    ملاحظة: ستستمر الخلايا المستزرعة لمدة أسبوع. من الأفضل استخدام الخلايا المستزرعة في الأيام 2-3.

3. التحضير لتسجيل المشبك التصحيح والتصوير البؤري

ملاحظة: تم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر ومضخم صوت مشبك التصحيح مع تسجيل الجهد المشبك مع مضخم صوت قفل لتسجيل السعة. تم استخدام التصوير البؤري لمستوى XY في مستوى Z ثابت (المسحالضوئي الثابت XY / Z) لتصوير جميع إشارات الفلورسنت الثلاثة في وقت واحد. تم تركيز المستوى Z في قاع الخلية حيث كان غشاء البلازما ملتصقا بالغطاء.

  1. في يوم تجربة المشبك والتصحيح والتصوير ، راقب الخلايا تحت المجهر الفلوري. استخدم برايتفيلد للتأكد من أن مزرعة الخلايا غير ملوثة (الشكل 1F) والتألق اللاإرادي للتحقق من التعبير السليم عن البروتين الموسوم بالفلورسنت.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، يتم التعبير عن PH-mNG في غشاء البلازما ل ~ 20-30 ٪ من الخلايا.
  2. تحضير ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات. للقيام بذلك ، اسحب الماصات باستخدام مجتذب ماصة ، وقم بتغطية نصائحها بالشمع السائل ، وقم بتلميعها باستخدام microforge (انظر جدول المواد).
  3. قم بتشغيل مضخم تسجيل مشبك التصحيح وابدأ تشغيل برنامج تسجيل مشبك التصحيح (انظر جدول المواد). قم بتعيين المعلمات المناسبة لتسجيل تيار الكالسيوم والسعة في البرنامج (انظر جدول المواد).
    1. قم بتعيين بروتوكول تسجيل لمدة 60 ثانية في المجموع ، حيث يبدأ التحفيز من 10 ثوان.
    2. اضبط إمكانات الاحتفاظ لتسجيل مشبك الجهد على -80 mV. اضبط إزالة الاستقطاب 1 ثانية من -80 mV إلى 10 mV كحافز للحث على تدفق الكالسيوم وقفزة السعة.
    3. بالنسبة لقياسات السعة، اضبط تردد التحفيز الجيبي على نطاق يتراوح بين 1000 و1500 هرتز مع جهد من الذروة إلى الذروة لا يزيد عن 50 مللي فولت.
  4. احفظ البروتوكول وأنشئ ملفا جديدا للتسجيل.
  5. قم بتشغيل نظام المجهر البؤري وتعيين المعلمات المناسبة في البرنامج (انظر جدول المواد).
    1. قم بتشغيل الليزر ، بما في ذلك 458 نانومتر و 514 نانومتر و 633 نانومتر ، واضبط نطاق جمع الانبعاثات لكل ليزر وفقا لكل مسبار فلوري كما في ما يلي. FFN511: الطول الموجي للإثارة (EX) ، 458 نانومتر ؛ الطول الموجي للانبعاثات (EM) ، 468-500 نانومتر. mNG: EX ، 514 نانومتر ؛ EM ، 524-560 نانومتر. A655: EX، 633 نانومتر؛ EM ، 650-700 نانومتر.
    2. استخدم التصوير المتسلسل ل FFN511 و mNG لتجنب التداخل بين هذين المسبارين. قم بتعيين فاصل زمني مدته دقيقة واحدة لتسجيل الصور (الشكل 1G).

4. تسجيل المشبك التصحيح والتصوير البؤري

  1. اختر طبقا ذا حالة خلية جيدة وتعبيرا مناسبا وأضف 2 ميكرولتر من الناقل العصبي الكاذب الفلورسنت FFN511 (مخزون 10 mM ، محلول عمل 1: 1000) إلى الوسط. ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. بدلا من ذلك، قم بتحميل FFN511 بعد الخطوة 3.2 وقم بتنفيذ الخطوات 3.3-3.5 أثناء الانتظار لتوفير الوقت.
  2. بعد الانتهاء من تحميل FFN511 ، قم بإعداد غرفة التسجيل وإضافة 2 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت A655 إلى 500 ميكرولتر من محلول الحمام (الشكل 2A والجدول 1). انقل الغطاء من الطبق إلى غرفة التسجيل (انظر جدول المواد) باستخدام ملاقط ، وأضف على الفور محلول الحمام المحتوي على A655 (الشكل 2B).
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ ب A655 في -20 درجة مئوية بتركيز 10 mM وتركيز العمل هو 40 μM.
    تنبيه: ارتد قفازات لتجنب ملامسة الجلد مباشرة ل FFN511 أو A655.
  3. ضع قطرة من الزيت (معامل الانكسار: 1.518؛ انظر جدول المواد) على هدف غمر الزيت 100x (الفتحة العددية = 1.4). قم بتركيب الغرفة في المجهر واستخدم مقبض الضبط لجعل الزيت يتصل فقط بالجزء السفلي من الغطاء ، ثم اغمر طرف السلك الأرضي في محلول الحمام (الشكل 2C ، D).
    ملاحظة: اختر زيت الغمر المناسب للعمل في درجة حرارة الغرفة. التبديل بين عدسة التكبير المنخفض والعالي غير ضروري. يتم الحفاظ على درجة حرارة الغرفة حوالي 20-22 درجة مئوية أثناء التسجيل.
  4. ضع الخلايا في بؤرة التركيز واستخدم التصوير الساطع والتصوير البؤري للعثور على خلية جيدة مع تعبير mNG. قم بتكبير الخلية المحددة وضبطها على مركز العرض لتقليل المناطق الفارغة.
    ملاحظة: الرسم التخطيطي لوضع العلامات الفلورية مبين في الشكل 3A. عادة ما يكون للخلية الجيدة غشاء أملس وحافة نظيفة (الشكل 3B). مع التألق أو التصوير البؤري ، يبدو أن الخلية الجيدة لها قاع كبير ومسطح مع تعبير mNG مشرق (الشكل 3C).
    حجم البكسل هو ~ 50 نانومتر ، ضمن نطاق ~ 40-80 نانومتر وفقا لحجم الخلية المختلفة وعامل التكبير/التصغير.
  5. قم بإعداد معلمات للتصوير البؤري لمستوى XY عند مستوى Z ثابت (مسح ضوئيثابت XY/Z) ل FFN511 وPH-mNG وA655، مع فاصل زمني مصغر. اضبط التركيز البؤري على الجزء السفلي من الخلية باستخدام مقبض الضبط الدقيق.
    ملاحظة: يشير PH-mNG إلى محيط غشاء بلازما الخلية عند المقطع العرضي XY-level البؤري (باستثناء قاع الخلية). بالقرب من قاع غشاء الخلية ، يمكن ملاحظة بقع A655 ، والتي تعكس غزوات الغشاء على شكل Ω أو Λ. إذا كان المستوى البؤري Z أقل من قاع الخلية ، فستصبح شدة كل التألق أضعف.
  6. اضبط طاقة ليزر الإثارة في البرنامج للعثور على إعداد للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء وتجنب التبييض الفلوري الكبير. للقيام بذلك ، ابدأ بقيمة اختبار أولية تبلغ 2.5 ميجاوات طاقة FFN511 متحمسة عند 458 نانومتر و 1 ميجاوات ل mNG متحمسة عند 514 نانومتر. بالنسبة ل A655 متحمس عند 633 نانومتر باستخدام ليزر HeNe ، استخدم طاقة ليزر عالية ، ~ 12-15 mW (أي 70٪ -80٪ من الحد الأقصى) ، والتي ، عند الإثارة المستمرة ، يمكنها تبييض جميع A655 الفلورسنت داخل ملف تعريف Ω الشكل عند إغلاق مسامها.
    ملاحظة: إذا كانت طاقة الليزر عالية جدا ، تبييض التألق PH-mNG و FFN511 بسرعة. إذا كانت طاقة الليزر منخفضة جدا ، فستكون الإشارات ضعيفة جدا أو صاخبة بحيث لا يمكن تحليلها.
  7. أضف 9 ميكرولتر من المحلول الداخلي (الجدول 1) إلى ماصة التصحيح وقم بتوصيل الماصة بالحامل في مرحلة مضخم التصحيح المشبك (انظر جدول المواد).
  8. ضع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي باستخدام حقنة وحرك طرف الماصة للمس محلول الحمام باستخدام جهاز مناور دقيق. تأكد من أن مكبر الصوت يظهر أن مقاومة الماصة هي ~ 2-4 MΩ مع اختبار نبض الجهد. اضغط على LJ/Auto لإلغاء الوصلة السائلة.
  9. حرك الماصة باتجاه الخلية المحددة باستخدام المتلاعب الدقيق. لتشكيل وضع متصل بالخلية ، حرك طرف الماصة للمس الخلية (ستزداد المقاومة) ؛ تطبيق الضغط السلبي بلطف مع المحقنة (ستزداد المقاومة إلى أكثر من 1 GΩ) ، وتغيير إمكانات الاحتفاظ من 0 إلى -80 mV.
  10. بمجرد أن تمر المقاومة ب 1 GΩ ، انتظر ~ 30 ثانية حتى يستقر التكوين. اضغط على C-fast/Auto للتعويض عن السعة السريعة.
  11. لتشكيل وضع خلية كاملة ، قم بتطبيق ضغط سلبي قصير وقوي مع المحقنة لتمزيق الغشاء (يتغير شكل النبضة الحالية باستخدام مكثف غشاء مشحون ومفرغ). اضغط على C-slow/Auto للتعويض عن السعة البطيئة.
  12. اضبط تركيز التصوير قليلا للتركيز على قاع الخلية. ابدأ التصوير بالفاصل الزمني البؤري وتسجيل مشبك التصحيح في وقت واحد بالنقر فوق الزرين " ابدأ" في تطبيقي البرامج المختلفين في نفس الوقت.
    ملاحظة: يقوم برنامج التصوير البؤري بعمل فيلم بمعدل ~ 20-90 مللي ثانية / إطار. يتضمن تسجيل المشبك التصحيحي حالة الراحة لمدة 10 ثوان ، وتحفيز إزالة الاستقطاب 1 ثانية ، و 49 ثانية إضافية بعد التحفيز. يسمح تكوين المشبك الرقعة بتسجيل تيار الكالسيوم ، وقفزة السعة ، والاضمحلال الناجم عن إزالة الاستقطاب 1 s من -80 إلى +10 mV (الشكل 3D).
  13. بمجرد الانتهاء من التسجيل ، تأكد من حفظ البيانات. قم بتغيير إمكانات الكبح إلى 0 mV. حرك الماصة خارج محلول الحمام وتخلص منها.
  14. كرر الخطوات من 4.7 إلى 4.13 لتسجيل خلية أخرى في الطبق. بعد 1 ساعة من التسجيل ، قم بالتغيير إلى طبق آخر للتسجيل.
    ملاحظة: بعد 1 ساعة من التسجيل ، ينخفض معدل نجاح تسجيل مشبك التصحيح بشكل ملحوظ. لزيادة كفاءة جمع البيانات ، يوصى بالتسجيل لمدة 1 ساعة فقط في كل طبق.

5. تحليل بيانات المشبك التصحيحي

  1. افتح البرنامج المناسب (انظر جدول المواد) لتحليل البيانات. انقر فوق | PPT تحميل ملف PULSE | أزرار الملفات لتحميل ملف .dat. انقر فوق Do it وسيتم رسم أربعة آثار في رسم بياني واحد تلقائيا بما في ذلك تيار الكالسيوم وآثار السعة.
  2. انقر فوق | Windows أزرار رسم بياني جديدة ، اختر Pulse_1_1_1، الموجة الأولى في موجة (موجات) Y، وانقر فوق Do it لرسم الرسم البياني لتيار الكالسيوم. انقر فوق | Windows أزرار جدول جديدة، اختر Pulse_1_1_1، وانقر فوق Do it لإظهار البيانات الخام لتيار الكالسيوم، والتي يمكن استخدامها لرسم متوسط تتبع خلايا متعددة.
  3. ارسم مربعا وفقا لذلك في الرسم البياني لتيار الكالسيوم ، وانقر بزر الماوس الأيمن ووسع الإشارة الحالية لتشمل خط الأساس وذروة تيار الكالسيوم. انقر على الرسم البياني | إظهار المعلومات لإظهار المؤشرين A وB ونقلهما إلى خط الأساس والذروة على التوالي. سيتم عرض معلومات الرسم البياني في الأسفل ويمكن تقدير المعلمات.
  4. كرر الخطوة 5.2، ولكن اختر Pulse_1_1_1_Cm، الموجة الثانية في Y Wave(s)، لرسم تتبع السعة. كرر الخطوة 5.3 وضع المؤشرات A وB في الموضع المناسب لقياس معلمات السعة، مثل خط الأساس والسعة ومعدل الاضمحلال.
  5. انسخ البيانات الخام في الخطوة 5.2 إلى جدول بيانات، واحسب متوسط الخطأ المعياري للمتوسط لمجموعة من الخلايا المسجلة، وارسم متوسط آثار تيار الكالسيوم وسعة الغشاء (الشكل 3E) في برنامج مناسب.

6. تحليل بيانات التصوير البؤري

  1. افتح ملفات التصوير الخام باستخدام أي برنامج توفره الشركة المصنعة (راجع جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن استخدام بعض البرامج المجانية الأخرى ، مثل ImageJ أو Fiji ، لمعالجة البيانات وتحديد كمية الصور التي تم الحصول عليها في القسم 4.
  2. انقر على معالجة | ProcessTools واستخدام الأدوات لإنشاء ملفات متوسطة متداولة (على سبيل المثال ، المتوسط المتداول لكل 4 صور) لكل صورة بفاصل زمني وحفظ تلك الملفات.
    ملاحظة: بعد المتوسط المتداول ، يمكن إجراء تعديل مناسب للسطوع والخلفية لإظهار تغيرات التألق لثلاث قنوات بشكل أفضل ، مما قد يساعد في تحديد أحداث الاندماج. قد يساعد التحقق من كثافة الفلورسنت في بعض المناطق بدون حدث اندماج على التمييز بين إشارة الفلورسنت لأحداث الاندماج وإشارات الخلفية.
  3. انقر فوق الأزرار تحديد كمي | أدوات | ملف تعريف المكدس ، تحقق من النقاط الزمنية قبل وبعد التحفيز لتحديد تغيرات التألق في كل قناة. انقر فوق الزر رسم القطع الناقص لوضع دائرة حول مناطق الاهتمام (ROIs) لأحداث الاندماج. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وانقر فوق حفظ عائد الاستثمار لحفظ عائد الاستثمار.
    ملاحظة: كان حجم عائد الاستثمار ، الذي يغطي جميع إشارات الفلورسنت الثلاثة ، مشابها لحجم الحويصلة في خلايا الكرومافين24. واستخدمت البيانات الأولية للتحليل، في حين تم توفير بيانات المتوسط المتداولة التي تزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء لإظهار الإشارات الثلاث بوضوح.
  4. انقر فوق فتح المشاريع لتحديد موقع الملف الخام ، وانقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وانقر فوق تحميل عائد الاستثمار لتحميل ملف عائد الاستثمار في ملفات التصوير الخام لقياس كثافة التألق.
    ملاحظة: سيتم استخدام إشارة الفلورسنت الخام لرسم آثار القنوات المختلفة. لكل عائد استثمار ، يتم تعريف خط الأساس على أنه الكثافة قبل التحفيز ، ويمكن تطبيع آثار الكثافة إلى خط الأساس.
  5. انقر على أدوات | فرز عائد الاستثمار في البرنامج ورسم الآثار لجميع القنوات الثلاث لكل عائد على الاستثمار. انقر فوق تقرير لحفظ بيانات عائد الاستثمار، بما في ذلك كل من البيانات الرقمية وعمليات تتبع التصوير لكل عائد استثمار في مجلد ملفات.
    1. حدد حدث الاندماج من خلال الزيادة المتزامنة في شدة التألق الموضعي PH-mNG (FPH) و A655 (F655) (داخل إطار واحد) ، مصحوبا بانخفاض في التألق الموضعي FFN511 (FFFN).
    2. ابحث عن مظهر FPH و F655 ، مما يشير إلى تكوين بقعة PH-mNG / A655 بسبب ملف تعريف Ω الناتج عن الاندماج ، مما يسمح بنشر PH-mNG من غشاء البلازما والانتشار المستمر ل A655 من الحمام.
    3. ابحث عن انخفاض FFFN ، مما يشير إلى إطلاقه من حويصلة بسبب فتح مسام الانصهار ويستبعد احتمال أن يكون مظهر FPH و F655 ناتجا عن غزو الغشاء الناجم عن داء الخلايا الداخلية.
    4. افحص الصورالثابتة XY/Z ذات الفاصل الزمني التي تظهر أحداث الاندماج التي تحدث في قاع الخلية. تحليل ثلاثة أنماط من أحداث الانصهار: 1) الاندماج الوثيق ، 2) الاندماج الدائمين ، و 3) الانصهار المتقلص.
      ملاحظة: نادرا ما لوحظت أحداث الاندماج قبل إزالة الاستقطاب ، في حين يمكن ملاحظة عشرات أحداث الاندماج بعد إزالة الاستقطاب. بعد الانصهار ، قد يغلق ملف تعريف Ω مسامه ، أو يحافظ على مسامه المفتوحة ، أو يتقلص ليندمج في غشاء البلازما.
      1. لتحديد الانصهار القريب ، ابحث عن تعتيم F655 لأن إغلاق مسام الاندماج يمنع تبادل الحمام A655 ، بينما يحافظ F PH ، مما يعكس التحويل المستمر ل PtdIns(4,5)P2 إلى PtdIns(4)P ، أو FPH يتحلل مع تأخير ، مما يعكس قرصة الحويصلة (الانصهار القريب ، الشكل 4A ، B).
      2. ابحث عن FPH و F655 المستدامين لتحديد الاندماج البقي (الشكل 4C).
      3. ابحث عن انخفاضات متوازية ل FPH و F655 ، مما يشير إلى انكماش Ω لتحديد اندماج الانكماش (الشكل 4D).
        ملاحظة: تحقق من ملفات التصوير الأصلية لفحص آثار التصوير إذا لم يكن متأكدا من نوع الحدث. قد يساعد التحقق من كثافة الفلورسنت في بعض المناطق بدون حدث اندماج على التمييز بين إشارة الفلورسنت لأحداث الاندماج وإشارات الخلفية.
  6. آثار تمثيلية للرسم لتغيرات الكثافة لهذه القنوات الثلاث: FFN511 و PH-mNG و A655. حدد النسبة المئوية لأوضاع الاندماج المختلفة في كل خلية وأرقام المخطط.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وباتباع الإجراءات التجريبية المبينة في الشكل 1 والشكل 2، تم نقل خلايا الكرومافين من الغدد الكظرية البقرية باستخدام PH-mNG لوضع علامة على غشاء البلازما؛ تمت إضافة A655 إلى محلول الحمام للكشف عن إغلاق مسام الانصهار. وتم تحميل الناقل العصبي الكاذب الفلورسنت FFN511 ف?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يتم وصف طريقة التصوير المجهري البؤري للكشف عن ديناميكيات مسام الاندماج وإطلاق جهاز الإرسال ، بالإضافة إلى ثلاثة أوضاع اندماج ، اندماج وثيق ، اندماج البقاء ، وانكماش الانصهار في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية 4,24. يتم وصف طريقة الفيزيولوجيا الكهربية ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

نشكر برامج البحوث الداخلية NINDS (ZIA NS003009-13 و ZIA NS003105-08) على دعم هذا العمل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium saltSigmaA9187-500MGATP for preparing internal solution
Atto 655ATTO-TEC GmbHAD 655-21Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary NeuronsLonzaVSPI-1003Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipetteWarner Instruments64-0795Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albuminSigmaA2153-50GReagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 MQuality Biological351-130-721Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µmFalcon352360Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solutionSigma232041Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase PSigma11213873001Enzyme for gland digestion
CoverslipNeuvitroGG-14-LamininGG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-GlucoseSigmaG8270-1KGReagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEMThermoFisher Scientific11885092Reagent for preparing culture medium
EGTASigma324626-25GMReagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and NucleofectorAmaxa BiosystemsNucleofector IITransfect plasmids into cells
Fetal bovine serumThermoFisher Scientific10082147Reagent for preparing culture medium
FFN511Abcamab120331Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrateSigmaG8877-250MGGTP for preparing internal solution
HEPESSigmaH3375-500GReagent for preparing Locke’s solution
Igor ProWaveMetricsIgor proSoftware for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X softwareLeicaLAS X softwareConfocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning MicroscopeLeicaLeica TCS SP5Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acidSigma49449-100GReagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifierHekaLock-inSoftware for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 MQuality Biological351-033-721EAReagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-LineHausser Scientific3120Counting chamber
MicroforgeNarishigeMF-830Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µmMilliporeSLGPR33RBMaterial for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)Allele BiotechnologyABP-FP-MNEONSBTemplate for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micronEIKO filtering co03-100/32Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10HekaEPC-10Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFPAddgenePlasmid #51407Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette pullerSutter InstrumentP-97Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium ChlorideSigmaP5404-500GReagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse softwareHekaPulseSoftware for patch-clamp data collection
Recording chamberWarner Instruments64-1943/QR-40LPcoverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chlorideSigmaS7653-1KGReagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxideSigmaS5881-500GReagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasicSigmaS0876-500GReagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasicSigmaS8282-500GReagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plateBarnsted/Thermolynetype 10100Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mLBecton Dickinson302832Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chlorideSigmaT2265-100GTEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitorSigmaT9253-5GReagent for gland digestion
Type F Immersion liquidLeica195371-10-9Leica confocal mounting oil

References

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356(2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503(2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604(2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved