استخدام حقن تتبع الخلايا للتحقيق في أصل الخلايا المكونة للنيوينتيما في نموذج الجدار الجانبي العجزي للفئران

Summary

أجرينا حقنة تتبع الخلايا المحبة للدهون من نقطة واحدة لتتبع الخلايا البطانية ، تليها بضع الشرايين وخياطة تمدد الأوعية الدموية في الجدار الجانبي على الشريان الأورطي للفئران البطنية. بدا أن تكوين Neointima يعتمد على الشريان الأم في تمدد الأوعية الدموية المنزوع الخلايا وتم تعزيزه من خلال التوظيف من خلايا جدار تمدد الأوعية الدموية في الجدران الحيوية الغنية بالخلايا.

Abstract

يخلق القطع الجراحي المجهري حاجزا لاحقا لتدفق الدم إلى تمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة ، في حين يعتمد العلاج داخل الأوعية الدموية على تكوين النيوينتيما والجلطة. لا يزال مصدر الخلايا البطانية التي تغطي الطبقة الداخلية من neointima غير واضح. لذلك ، كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق في أصل الخلايا المكونة للنيوينتيما بعد حقن تتبع الخلايا في نموذج تمدد الأوعية الدموية الجانبي المجهري للفئران في هلسنكي الراسخ بالفعل.

تم إنشاء تمدد الأوعية الدموية على الجدار الجانبي عن طريق خياطة أكياس شريانية ثنائية أو حيوية من طرف إلى آخر في ذكور الفئران لويس. قبل استئصال الشرايين مع خياطة تمدد الأوعية الدموية ، تم إجراء حقن تتبع الخلايا التي تحتوي على صبغة CM-Dil في الشريان الأورطي المثبت لتسمية الخلايا البطانية في الوعاء المجاور وتتبع انتشارها أثناء المتابعة (FU). العلاج يليه اللف (n = 16) أو الدعامات (n = 15). في FU (7 أيام أو 21 يوما) ، خضعت جميع الفئران لتصوير الأوعية الدموية الفلوري ، تليها حصاد تمدد الأوعية الدموية والتقييم العياني والنسيجي مع تعداد الخلايا المناعية النسيجية لمناطق محددة من الاهتمام.

لم يتمزق أي من تمدد الأوعية الدموية ال 31 عند المتابعة. ماتت أربعة قبل الأوان. لوحظ التروية المتبقية عيانية في 75.0٪ ملفوفة و 7.0٪ من الفئران الدعامات. كانت كمية الخلايا الإيجابية لتتبع الخلايا مرتفعة بشكل كبير في الدعامات غير الخلوية مقارنة بتمدد الأوعية الدموية الملفوف فيما يتعلق بالجلطة في اليوم 7 (p = 0.01) و neointima في اليوم 21 (p = 0.04). لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في الجلطة أو neointima في تمدد الأوعية الدموية الحيوية.

تؤكد هذه النتائج أنماط شفاء أسوأ في الملفات مقارنة بتمدد الأوعية الدموية الدعامات. يبدو أن تكوين Neointima يعتمد بشكل خاص على الشريان الأم في تمدد الأوعية الدموية المنزوع الخلايا ، في حين أنه مدعوم بالتجنيد من خلايا جدار تمدد الأوعية الدموية في الجدران الحيوية الغنية بالخلايا. من حيث الترجمة، قد يكون العلاج بالدعامات أكثر ملاءمة لتمدد الأوعية الدموية شديد التدهور، في حين أن اللف وحده قد يكون كافيا لتمدد الأوعية الدموية مع جدران الأوعية الدموية الصحية في الغالب.

Introduction

نزيف تحت العنكبوتية الناجم عن تمزق تمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة (IA) هو حالة جراحية عصبية مدمرة مرتبطة بارتفاع معدلات المراضة والوفيات^1،2،^3،4. بالإضافة إلى قصاصات الجراحة المجهرية ، التي توفر اتصالا مباشرا من البطانة إلى البطانة ، اكتسبت الأجهزة داخل الأوعية الدموية أهمية متزايدة على مدى العقود الماضية لعلاج IAs الممزقة والمكتشفة بالصدفة. تعتمد استجابة الشفاء في IAs المعالجة داخل الأوعية الدموية بشكل أساسي على تكوين neointima وتنظيم الجلطة. كلاهما عمليتان تآزريتان ، اعتمادا على هجرة الخلايا من الوعاء المجاور وجدار تمدد الأوعية الدموية. ⁵ حتى الآن ، لا يزال أصل الخلايا البطانية في تكوين neointima من تمدد الأوعية الدموية المعالجة داخل الأوعية الدموية غير واضح. هناك نقاش مستمر في الأدبيات حول المصدر الذي يتم من خلاله تجنيد الخلايا المكونة للنيوينتيما.

باستخدام حقن تتبع الخلايا من صبغة CM-Dil (انظر جدول المواد) في الشريان الأورطي البطني للفئران ، كنا نهدف إلى تحليل دور الخلايا البطانية ، التي تنشأ في الشريان الأم ، في تكوين neointima في نقطتين زمنيتين مختلفتين FU (اليوم 7 واليوم 21) (الشكل 1). ميزة النموذج هي حضانة تتبع الخلايا المحلية المباشرة في الجسم الحي في الشريان الأم قبل خياطة تمدد الأوعية الدموية ، مما يسمح ب FU في نقاط زمنية لاحقة. لم يتم وصف تقنيات الحقن في الجسم الحي ، مثل حضانة تتبع الخلايا ، في الأدبيات. ميزة هذه التقنية هي الحقن المباشر ، من نقطة واحدة ، أثناء العملية الجراحية ، في الجسم الحي ، مما يجعل النموذج قويا وقابلا للتكرار.

Protocol

تم تنفيذ الدعم البيطري وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية ، سويسرا (BE 60/19). تم اتباع إرشادات REACH ومبادئ 3R بدقة ^6,7. تم تضمين واحد وثلاثين من ذكور فئران لويس ، يبلغ عمرها 12 أسبوعا وتزن 492 ± 8 جم. إيواء جميع الفئران في درجة حرارة الغرفة 23 درجة مئوية ودورة الضوء / الظلام 12 ساعة. توفير حرية الوصول إلى المياه والكريات. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار Wilcoxon-Mann-Whitney U غير البارامتري. واعتبرت القيم الاحتمالية (p) ≤ 0.05 و/أو ≤ 0.01 ذات أهمية.

1. مرحلة التحضير العام قبل الجراحة وجوانب التخدير

1. قم بتوزيع الفئران عشوائيا إما إلى مجموعات معالجة لفائف أو دعامات (الشكل 2) عبر نظام عشوائي قائم على الويب. الآن ، قم بإجراء فحص سريري قبل الجراحة لجميع الحيوانات المخطط لها للجراحة بجوار غرفة عمليات هادئة ومعقمة تحافظ على درجة حرارة الغرفة من 23 ± 3 درجات مئوية. تحليل سلوك الحيوانات وفحص الأغشية المخاطية والتورجور كجزء من الفحص السريري قبل الجراحة.
2. سجل وزن كل.
3. قبل الجراحة ، احتضن الحقائب الشريانية من الفئران المانحة في 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم لمدة 10 ساعات عند 37 درجة مئوية للحصول على تمدد الأوعية الدموية المنزوع الخلايا⁸. اجمع هذه الحقائب من الحيوانات المانحة قبل أيام قليلة من الجراحة.
   1. تحضير الطول الكامل للشريان الأورطي البطني باستخدام مقص مجهري وملقط وتطبيق 6-0 أربطة غير قابلة للامتصاص بفاصل زمني يتراوح بين 3-4 مم.
   2. توليد تمدد الأوعية الدموية الحيوية مباشرة أثناء العملية الجراحية عن طريق كيس الأوعية الشريانية المربوطة مسبقا من الجزء الصدري من مانح⁹. قم بإجراء بضع الصدر باستخدام المقص والملقط الجراحي في النقطة الزمنية FU المشار إليها وقم بربط حقيبة الوعاء بالطول المطلوب.
4. زرع الحقيبة مباشرة في المتلقي وحصاد تمدد الأوعية الدموية من الحيوان المتبرع لمزيد من التحليل العياني والمعالجة النسيجية.
5. لتحريض التخدير ، ضع جميع الفئران في صندوق نظيف مزود بالأكسجين (O₂) حتى فقدان الوعي بعد 5-10 دقائق. تخدير الفئران عن طريق حقن تحت الجلد (SC) من خليط من الفنتانيل 0.005 ملغم / كغم ، ميديتوميدين 0.15 ملغ / كغ ، وميدازولام 2 ملغ / كغ.
   ملاحظة: هذا يضمن طائرة جراحية لا تقل عن 45 دقيقة.
6. تحقق من عمق التخدير من خلال عدم وجود منعكس سحب الدواسة.
7. ضع الفئران في وضع ضعيف واحلق الجزء الصدري البطني باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
8. تثبيت الكفوف 4 من الفئران مع شريط على لوحة ، مغطاة بوسادة التدفئة المتصلة بمسبار المستقيم ذاتي التنظيم. أدخل مسبار المستقيم في فتحة الشرج للفئران للحفاظ على درجة الحرارة المطلوبة البالغة 37 درجة مئوية بمساعدة وسادة التدفئة.
9. الآن ، قم بتثبيت مستشعر على الساق الخلفية اليمنى متصلا بنظام محوسب للتحقق من العلامات الحيوية أثناء الجراحة.
10. قم بتغطية أنف الفئران وفمها بقناع الوجه. إذا كنت تتطلب تخديرا مطولا ، فابدأ الأيزوفلوران (1.0-2.0٪ معايرة للتأثير في 100٪ O₂).
11. تطهير المجال الجراحي باستخدام البوفيدون اليود أو المطهرات المتناوبة ولف المجال الجراحي بطريقة معقمة.
12. للعناية بالفترة المحيطة بالتخدير، ضع مادة تشحيم عيون معقمة على العينين وقم بتغطيتها بقناع رقائق غير شفاف لمنع الجفاف والتلف الناتج عن المصباح الجراحي.
13. طوال الجراحة ، قم بتوفير الأكسجين باستمرار عبر قناع الوجه ، ومراقبة درجة حرارة الجسم ، وتوفير الحرارة باستخدام وسادة التدفئة ، والحفاظ على normothermia.
14. راقب العلامات الحيوية الأخرى باستمرار (انتفاخ النبض والتنفس، ومعدل ضربات القلب والتنفس، وتشبع الأكسجين).

2. المرحلة الجراحية - حقن تتبع الخلايا

ملاحظة: يتم وصف النهج الجراحي المفصل في نموذج تمدد الأوعية الدموية الجانبي المجهري للفئران في هلسنكي^{نموذج 9} وتقنيات زرع الملف والدعامات في مكان آخر⁸،^10،11.

1. قم بتخزين متتبع الخلايا الفلورية المحبة للدهون في ≤ -20 درجة مئوية طوال الوقت ، محميا من الضوء.
2. قم بإجراء الجراحة عن طريق إعداد الشريان الأورطي للفئران والوريد التجويف ، يليه فصل كليهما ، بالإضافة إلى التثبيت المؤقت القريب والبعيد للشريان الأورطي.
   ملاحظة: تم وصف هذه التقنية سابقا⁹.
   1. قم بتثبيت الأجزاء القريبة والبعيدة من الشريان الأورطي بمقطعين مؤقتين من تيتان.
3. ضع مسحة صغيرة واحدة مع حشوة أرجوانية لكل منها تحت الأجزاء القريبة والبعيدة من الشريان الأورطي للحصول على تصور أفضل للشريان.
4. الآن ، حماية البطن مع الشاش الرطب.
5. في يوم العملية ، قم بإذابة 2 ميكرولتر من مقتفي الخلايا عن طريق سحب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
6. انقل الخليط إلى حقنة سعة 1 مل مزودة بقنية معقمة 27-1/2 جم (0.4 × 13 مم).
   ملاحظة: احرص على تجنب التعرض للضوء أثناء تنفيذ الخطوتين 2.5 و2.6.
7. أطفئ الضوء في غرفة العمليات. أثناء النظر تحت المجهر ، قم بإجراء الحقن من نقطة واحدة في الجزء البطني الأوسط من الشريان الأورطي باستخدام ملقط دقيق وحقن 1 مل بعناية من محلول ملحي هيبارين بنسبة 0.9٪.
8. حقن متتبع الخلايا بعناية (فيديو 1) وقم بإيقاف تشغيل المجهر التشغيلي على الفور أيضا. مرة أخرى ، حماية البطن مع الشاش الرطب.
9. دع الصبغة تحضن لمدة 15 دقيقة على الأقل. بعد فترة الحضانة ، قم بتشغيل المجهر وأضواء غرفة العمليات.
10. إجراء بضع الشرايين الطولي وخياطة تمدد الأوعية الدموية ، كما هو موضح في مكان آخر¹¹.
    1. استخدم الملقط الدقيق والمقص الدقيق لإجراء بضع الشرايين بحيث يبلغ طوله متوسط قطر تمدد الأوعية الدموية الذي تم حصاده (الخطوة 1.3). لضمان الطول الصحيح، ضع تمدد الأوعية الدموية بجانب الشريان الأورطي قبل إجراء بضع الشرايين. قم بخياطة تمدد الأوعية الدموية باستخدام 8-10 غرز مفردة باستخدام خياطة 10-0 غير قابلة للامتصاص ، وقم بإزالة المشابك المؤقتة بعناية - التي تبدأ بعيدا - تحت الري المستمر باستخدام محلول ملحي هيبارين. أغلق الجرح بطريقة طبقات. من الجدير بالذكر ، استخدم كثافة تعبئة لفائف تبلغ 1 سم.
       ملاحظة: تم وصف تقنية زرع اللفائف أو الدعامات في مكان آخر ^8,10.

3. مراقبة المرحلة بعد العملية الجراحية والرعاية الأنثالية

1. في نهاية الجراحة ، عكس التخدير بمزيج حقن SC من البوبرينورفين 0.05 مجم / كجم ، أتيباميزول 0.75 مجم / كجم ، و flumazenil 0.2 مجم / كجم. دع كل يعمل يتعافى في قفص نظيف حتى يستيقظ تماما ويدفئ ، حسب الحاجة ، باستخدام مصباح تدفئة.
2. لمدة 3 أيام ، قم بإعطاء 1 ملغم / كغم ميلوكسيكام (حقنة واحدة أو تطبيق عن طريق الفم يوميا) والبوبرينورفين (0.05 مجم / كجم أربع مرات كل يوم) SC. بين عشية وضحاها ، قم بتزويد البوبرينورفين باستمرار في مياه الشرب بنفس الجرعات: 6 مل من البوبرينورفين 0.3 مجم / مل ، 360 مل من مياه الشرب ، 10 مل من الجلوكوز بنسبة 5٪.
3. في مرحلة ما بعد الجراحة مباشرة ، ضع كل في قفص واحد للحماية. أعد تجميع الحيوانات بعد 24 ساعة.
4. إذا أظهر أي فأر سلوكا مضطربا أو عدوانيا بعد حقن SC ، فقم بإعطاء البوبرينورفين في مياه الشرب خلال النهار.
5. توفير تغذية ناعمة على أرضية القفص لدعم التغذية والانتعاش بعد العملية الجراحية.
6. مراقبة ورعاية جميع الحيوانات وفقا لورقة درجة الرفاهية والألم.
7. إدارة مسكن الإنقاذ SC (ميلوكسيكام 1 مغ / كغ و 0.05 مغ / كغ بوبرينورفين) عند الحاجة.

النتائج

وأدرج ما مجموعه 31 حيوانا في بيئة المختبر: 27 فأرا في التحليل الإحصائي النهائي؛ و 27 فأرا في التحليل الإحصائي النهائي؛ و 27 فأرا في التحليل الإحصائي النهائي؛ و 27 فأرا في التحليل الإحصائي النهائي؛ و 27 فأرا في التحليل ال توفي 4 فئران قبل الأوان (معدل وفيات 12.9٪). أثناء العملية الجراحية ، انخفض انتف?...

Discussion

توضح هذه الدراسة أن تكوين neointima يتم بوساطة الخلايا البطانية التي تنشأ في الشريان الأم لمجمع تمدد الأوعية الدموية ولكن يتم دعمها من خلال توظيف الخلايا المشتقة من جدار تمدد الأوعية الدموية في تمدد الأوعية الدموية الحيوي. ومع ذلك ، فإن دور الخلايا السلفية المتداولة في شفاء تمدد الأوعية الدم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 non-absorbable suture	B. Braun, Germany	G1111140
Atipamezol	Arovet AG, Switzerland
Bandpass filter blue	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpass filter green	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolar forceps			any other
Bicycle spotlight			any other
Board (20 x 10 cm)			any other
Buprenorphine	Indivior, Switzerland	1014197
Camera	Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)			any other
Cell count software	Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dye	ThermoFisher SCIENTIFIC, USA	C7000
Coil-Device	Styker, Kalamazoo, MI, USA		2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfection			any other
Eye-lubricant			any other
Fentanyl	Sintetica, S.A., Switzerland	98683	any generic
Flumazenil	Labatec-Pharma, Switerzland
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fluorescence microscope	Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil mask			any other
Glucose (5%)			any other
Heating pad	Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England		any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Isoflurane			any generic
Longuettes			any other
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Medetomidine	Virbac, Switzerland	QN05CM91
Micro needle holder			any other
Midazolam	Roche, Switzerland
Monitoring-system	Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States
Needle holder			any other
O2-Face mask			any other
Operation microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany		any other
Oxygen			any other
Rectal temperature probe			any other
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Small animal shaver			any other
Smartphone			any other
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)	Sigma-Aldrich	11667289001
Soft feed	Emeraid Omnivore		any generic
Soft tissue forceps			any other
Soft tissue spreader			any other
Stainless steel sponge bowls			any other
Stent-Device	Biotroni, Bülach, Switzerland		modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Sterile micro swabs			any other
Straight and curved microforceps			any other
Straight and curved microscissors			any other
Straight and curved forceps			any other
Surgery drape			any other
Surgical scissors			any other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL			any other
Tape			any other
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Yasargil titan standard clip (2x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	temporary