التصوير الجزيئي الحيوي للامتصاص الخلوي للجسيمات النانوية باستخدام المجهر البصري غير الخطي متعدد الوسائط

Summary

تقدم هذه المقالة تكامل وحدة التركيز الطيفي وليزر النبض ثنائي الإخراج ، مما يتيح التصوير الطيفي السريع لجسيمات الذهب النانوية والخلايا السرطانية. يهدف هذا العمل إلى إظهار تفاصيل التقنيات البصرية غير الخطية متعددة الوسائط على مجهر المسح الضوئي بالليزر القياسي.

Abstract

يعد فحص جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) في الأنظمة الحية أمرا ضروريا للكشف عن التفاعل بين AuNPs والأنسجة البيولوجية. علاوة على ذلك ، من خلال دمج الإشارات الضوئية غير الخطية مثل تشتت رامان المحفز (SRS) ، والتألق المثار ثنائي الفوتون (TPEF) ، والامتصاص العابر (TA) في منصة التصوير ، يمكن استخدامه للكشف عن التباين الجزيئي الحيوي للهياكل الخلوية و AuNPs بطريقة متعددة الوسائط. تقدم هذه المقالة مجهرا ضوئيا غير خطي متعدد الوسائط وتطبقه لإجراء تصوير كيميائي محدد ل AuNPs في الخلايا السرطانية. توفر منصة التصوير هذه نهجا جديدا لتطوير AuNPs وظيفية أكثر كفاءة وتحديد ما إذا كانت داخل الأوعية الدموية المحيطة بالورم أو المساحات المحيطة بالخلية أو الخلوية.

Introduction

أظهرت جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) إمكانات كبيرة كمجسات تصوير متوافقة حيويا ، على سبيل المثال ، كركائز فعالة لمطيافية رامان (SERS) المحسنة سطحيا في مختلف التطبيقات الطبية الحيوية. تشمل التطبيقات الرئيسية مجالات مثل الاستشعار الحيوي والتصوير الحيوي والتحليل الطيفي المعزز للسطح والعلاج الحراري الضوئي لعلاج السرطان¹. علاوة على ذلك ، يعد فحص AuNPs في الأنظمة الحية أمرا بالغ الأهمية لتقييم وفهم التفاعل بين AuNPs والأنظمة البيولوجية. هناك العديد من التقنيات التحليلية ، بما في ذلك التحليل الطيفي^للأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) 2 ، وقياس الطيف الكتلي المقترن بالحث بالاجتثاث بالليزر (LA-ICP-MS⁾³ ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)⁴ التي تم استخدامها بنجاح للتحقيق في توزيع AuNPs في الأنسجة. ومع ذلك ، تعاني هذه الطرق من العديد من العيوب مثل كونها تستغرق وقتا طويلا وتتضمن تحضيرا معقدا^{للعينة 3} ، أو تتطلب أوقات اكتساب طويلة ، أو عدم وجود دقة مكانية دون الميكرون ^2,4.

بالمقارنة مع تقنيات التصوير التقليدية ، يوفر الفحص المجهري البصري غير الخطي العديد من المزايا لفحص الخلايا الحية و AuNPs: يحقق المجهر البصري غير الخطي عمق تصوير أعمق ويوفر قدرة التقسيم البصري 3D الجوهرية باستخدام الليزر فائق السرعة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء. مع التحسن الكبير في سرعة التصوير وحساسية الكشف ، تم إثبات مضان متحمس ثنائي الفوتون (TPEF) ⁵،⁶،⁷ والجيل التوافقي الثاني (SHG) ⁸،^9،10 المجهري لزيادة تحسين التصوير غير الجراحي للجزيئات الحيوية الداخلية في الخلايا والأنسجة الحية. علاوة على ذلك ، باستخدام تقنيات بصرية غير خطية جديدة لمسبار المضخة مثل الامتصاص العابر (TA) ¹¹،12،13،¹⁴ وتشتت رامان المحفز (SRS) 15،16،^{17،18 ،} من الممكن اشتقاق تباين كيميائي حيوي خال من الملصقات للهياكل الخلوية و AuNPs. يعد تصور AuNPs دون استخدام الملصقات الخارجية ذا أهمية كبيرة لأن الاضطرابات الكيميائية للجسيمات النانوية ستعدل خصائصها الفيزيائية وبالتالي امتصاصها في الخلايا.

يقدم هذا البروتوكول تنفيذ وحدة توقيت التركيز الطيفي وإعادة التركيب (SF-TRU) لليزر النبضي ثنائي الطول الموجي ، مما يتيح التصوير السريع متعدد الوسائط ل AuNPs والخلايا السرطانية. يهدف هذا العمل إلى إظهار تفاصيل تقنيات TPEF و TA و SRS المتكاملة على مجهر المسح بالليزر.

Protocol

1. تشغيل نظام الليزر

1. قم بتشغيل نظام التعشيق وحدد ليزر الذراع قبل بدء تشغيل النظام.
2. قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر باستخدام البرنامج للتحكم في ليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج.
3. قم بتحميل البرنامج لليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج ؛ يتيح هذا البرنامج تشغيل الليزر وإيقاف تشغيله ويتحكم مباشرة في الطول الموجي لحزمة المضخة.
4. قم بتشغيل انبعاث الليزر عن طريق الضغط باستمرار على أيقونة الطاقة للعد 3.
5. انتظر حتى يسخن الليزر ويضيء الضوء الجاهز بالليزر باللون الأخضر في البرنامج.
6. يتم التحكم في الطول الموجي لحزمة المضخة مباشرة من خلال البرنامج ؛ يمكن أن يتراوح هذا من 680-1300 نانومتر. للتصوير الخلوي في منطقة اهتزاز C-H Raman ، حدد 802 نانومتر.
7. افتح مصاريع شعاع المضخة القابل للضبط وشعاع Stokes 1,045 نانومتر عن طريق الضغط باستمرار على صور الفتحة لمدة 3 ثوان.
   تنبيه: إرشادات السلامة بالليزر ليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج هو ليزر نابض بالأشعة تحت الحمراء من الفئة الرابعة ويمكن أن يتسبب في تلف دائم للبصر. لذلك ، يجب اتباع جميع القواعد المحلية لسلامة الليزر أثناء تنفيذ هذا الإجراء: (i) يمكن فقط للمستخدمين المصرح لهم الذين تلقوا تدريبا على سلامة الليزر تنفيذ الإجراء. (ii) يتم الدخول إلى المختبر عن طريق الوصول إلى البطاقة الممغنطة مع قفل على باب الغرفة. (iii) بالنسبة لمعظم العملية ، تكون أشعة الليزر مغلقة بالكامل. (iv) عند تعرض شعاع الليزر ، يجب ارتداء نظارات واقية من الليزر (استخدم نظارات السلامة بالليزر LG9 ، والتي توفر OD 7+ حجبا لكل من المضخة وحزم Stokes).

2. تشغيل وحدة توقيت التركيز الطيفي وإعادة التركيب (SF-TRU)

1. قم بتحميل برنامج ATM على نفس جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج الليزر ، الذي يتحكم في مراحل التأخير وموهنات الليزر في وحدة SF-TRU.
   ملاحظة: هذه الوحدة مسؤولة عن التأكد من تداخل المضخة وعوارض ستوكس مكانيا ، والتحكم في التشتت في المضخة وعوارض ستوكس ، والتحكم في التأخير الزمني بين المضخة وعوارض ستوكس. استقطاب كل من المضخة وعوارض ستوكس عمودي. لاحظ أن كل شعاع مجهز بلوحة نصف موجة للتحكم بشكل مستقل في الاستقطابات قبل الخروج من SF-TRU.
2. تأكد من تخفيف كل من المضخة وليزر ستوكس إلى <10٪ (مضخة) و <15٪ (أشعة ستوكس). إذا لم يتم تخفيف الحزم ، يمكن أن تتسبب طاقة الليزر في تلف النظام وستحرق العينات البيولوجية.
3. بالنسبة للتصوير الخلوي ، اضبط إعدادات الليزر المثلى على 6٪ (مضخة) و 10٪ (ستوكس) ، أي ما يعادل 12 ميجاوات و 30 ميجاوات في العينة.
4. يحتوي SF-TRU على إعدادين: وضع الفيمتو ثانية (fs) ووضع بيكو ثانية (ps).
5. بالنسبة لوضع fs ، ادفع المقابض على جانبي الصندوق (وهذا يزيل حواجز شبكية التشتت من مسار الشعاع).
6. بالنسبة لوضع ps ، اسحب المقابض الموجودة على جانبي الصندوق (وهذا يضع حواجز شبكية التشتت في مسار الشعاع).
7. للتصوير فوق الطيفي، حدد وضع ps.
8. تأكد من أن مرحلة التأخير في الموضع الصحيح للمضخة وحزم ستوكس لتكون متداخلة مؤقتا لتصوير C-H على هذا النظام.
9. تأكد من صحة إعدادات تشتت المضخة وشعاع ستوكس ؛ بالنسبة لمضخة 802 نانومتر ، يكون هذا 5 مم لشعاع المضخة و 30 مم لشعاع Stokes.

3. تعديل شعاع ستوكس لتصوير SRS

1. للكشف عن SRS ، قم بتعديل شدة شعاع Stokes.
2. قم بتشغيل مولد الإشارة لتعديل الحزمة.
3. أذكر الإعدادات السابقة ، وهي كما يلي:
   المخرج 1: موجة مربعة: التردد = 19.5 ميجا هرتز ، السعة = 1.4 فولت.
   الناتج 2: الموجة المربعة: التردد = 19.5 ميجا هرتز ، السعة = 300 مللي فولت.
4. قم بتشغيل المخرجات 1 و 2.
5. قم بتوصيل الإخراج 1 بمكبر صوت ل EOM في صندوق SF-TRU عبر كابل BNC.
6. قم بتوصيل المخرج 2 بمضخم القفل المستخدم للكشف عن SRS عبر كابل BNC.
7. قم بتشغيل مصدر الطاقة لمكبر الصوت على القنطرة.

4. تشغيل مكبر الصوت المقفل

1. لتصوير SRS ، استخدم وحدة الكشف SRS التي تشتمل على صمام ثنائي ضوئي كبير المساحة ومضخم قفل مصمم لهذا الغرض.
2. قم بتشغيل مصدر الطاقة إلى مكبر الصوت المقفل على القنطرة.
3. قم بتحميل البرنامج لمكبر الصوت المقفل "وحدة اكتشاف SRS" على جهاز الكمبيوتر.
4. في البرنامج ، اختر الإعدادات التالية: المرحلة = 0 درجة ، الإزاحة = -80 ميغاواط ، الكسب = 58 ديسيبل.
5. حدد ثابت وقت تكامل مكبر الصوت المقفل في البرنامج: بالنسبة للتصوير الخلوي ، فإن ثابت الوقت البالغ 2 μs يعطي صورا عالية الجودة.

5. تعمل على مجهر المسح الضوئي بالليزر

1. قم بتشغيل مقابس جميع المعدات باستثناء صندوق التحكم عن بعد. انتظر حتى يضيء وضع الاستعداد في صندوق التحكم الموجود أعلى القنطرة.
2. قم بتشغيل صندوق التحكم عن بعد على القنطرة وقم بتشغيل الجزء الخلفي من الصندوق. انتظر حتى يتحول ضوء جهاز التحكم عن بعد إلى اللون الأزرق (في مربع التحكم) ، واضغط على بدء التشغيل.
3. قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر الخاص بمجهر المسح بالليزر.
4. قم بتشغيل برنامج المجهر متحد البؤر.
5. تحقق من مسار ضوء المجهر عبر برنامج الكمبيوتر.
   ملاحظة: تم إجراء بعض التعديلات على المجهر لجعله مناسبا لتصوير SRS: (i) في مسار الشعاع ، تمت إضافة ممر قصير 775 نانومتر إلى عجلة المرشح حيث تدخل أشعة الليزر إلى وحدة المسح ، ويمكن تحديد ذلك في علامة التبويب Lightpath في برنامج الكمبيوتر. (ii) بدلا من استخدام PMTs المدمجة في المجهر متحد البؤر للكشف ، تمت إضافة كاشف مفصل إلى مسار الضوء المرسل ، والذي يسمح باكتشاف كل من SRS و CARS. (iii) يتم توصيل المخرجات من هذه الكواشف بالصندوق التناظري على القنطرة. يتم توصيل إشارة CARS من PMT عبر كابل BNC ب CD1 ويتم توصيل إشارة SRS من مضخم القفل عبر كابل BNC ب CD2.
6. تحكم في التركيز من خلال شاشة اللمس أو مقابض التحكم عن بعد أو برنامج الكمبيوتر.
7. حدد إعدادات الصورة المطلوبة في البرنامج ؛ يتضمن ذلك التكبير / التصغير وحجم الصورة بالبكسل ووقت بقاء البكسل.
8. تأكد من أن سرعة التصوير (وقت السكون بالبكسل) أكبر من وقت التكامل المحدد في برنامج مضخم صوت القفل.
   ملاحظة: تم استخدام هدف الغمر في الماء NA 1.2 للتصوير.

6. تركيب عينة في مرحلة المجهر

1. تحضير عينات الخلية للتصوير على النحو التالي.
   1. زراعة خلايا سرطان الثدي للفأر 4T1 في RPMI-1640 تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS). تغيير الوسط كل 2 أيام وتمرير الخلايا في التقاء 70٪ -80٪.
      ملاحظة: تم استخدام المقاطع 8-10 طوال التجارب الموصوفة هنا.
   2. لتجارب التصوير ، احتضان 1 × 10 5 خلايا على أغطية مربعة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ،⁵ ٪ CO₂. بعد ذلك ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) واحتضانه بجسيمات الذهب النانوية (تخفيف 1: 100 في وسط زراعة الخلية ، تركيز المخزون: 2.3 ×^{10 10} جسيمات / مل ، القطر: 60 نانومتر) لمدة 4 ساعات.
   3. قبل التصوير ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج وقم بإصلاحها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). اغسل الخلايا باستخدام PBS 3x ، ثم قم بالتركيب بين غطاءين للتصوير.
2. ضع قطرة من الماء المقطر فوق هدف الغمر في الماء الذي يركز أشعة الليزر في العينة بين الهدف والعينة. ثم ضع العينة على مرحلة المجهر.
3. يجمع المكثف مع NA 1.4 الضوء المنتشر إلى الأمام. ضع قطرة ماء بين المكثف والعينة للتصوير. اضبط ارتفاع المكثف على حوالي 1 مم فوق العينة لجمع أكبر قدر ممكن من الضوء.
4. كاشف SRS موجود على حامل متحرك ، مما يسمح بانزلاقه للداخل والخارج من المسار البصري للمجموعة. من أجل التركيز على العينة باستخدام الضوء الأبيض ، حرك كاشف SRS خارج مسار الحزمة.
5. ضع الكاشف مرة أخرى في مسار الحزمة ، جاهزا لتصوير SRS.

7. تغيير إزاحة رامان وجمع مكدس بيانات فائق الطيفية

ملاحظة: يعتمد تحول رامان الذي يحدث فيه التصوير على موضع مرحلة التأخير في صندوق SF-TRU والطول الموجي لشعاع المضخة من نظام الليزر.

1. للتغييرات الكبيرة في إزاحة رامان ، قم بتغيير الطول الموجي لليزر. على سبيل المثال ، لتصوير اهتزازات CH بين 2,800-3,100 سم -1 ، حدد 802 نانومتر ، بينما ، للتصوير حوالي 1,600 سم ^-1 لذروة الأميد I ، حدد شعاع المضخة عند 898 نانومتر. اضبط هذا عبر البرنامج.
2. لتحقيق تعديلات صغيرة في إزاحة Raman ، قم بمسح مرحلة التأخير في وحدة SF-TRU.
3. يعطي SF-TRU مواضع مرحلة التأخير بالمليمترات (مم). لتحويل موضع مرحلة التأخير من مم إلى ^سم-1 ، قم بإجراء مسح المعايرة الطيفي باستخدام عينة من حبات البوليسترين وقارن مواضع الذروة الموجودة في مسح المعايرة مع تلك المأخوذة في إعداد رامان التلقائي. سيوفر هذا معادلة خطية ، والتي تحول موضع مرحلة التأخير بالملليمتر إلى إزاحة رامان في سم ^-1.
4. لإنشاء مسح فائق الطيفية ، التقط سلسلة زمنية من الصور في مواضع مختلفة لمرحلة التأخير.
5. لمزامنة الحصول على الصور وحركة مرحلة التأخير ، استخدم الوحدة التناظرية لإرسال واستقبال إشارات TTL من وإلى نظام SF-TRU.
   ملاحظة: للقيام بذلك ، يحتوي المربع التناظري على التوصيلات التالية: (i) TRIG OUT VD1 - يتم توصيله ب SF-TRU عبر BNC ويرسل إشارة TTL لإخبار مرحلة التأخير بتحريك زيادة +1. (ii) TRIG في 1 - هنا ، يتم استقبال إشارة عبر BNC عندما تنتهي مرحلة التأخير من حركتها ، ويستخدم هذا لتشغيل الصورة التالية في السلسلة الزمنية.
6. بالنسبة لمجموعة البيانات الطيفية ، حدد الإعدادات التالية في برنامج المجهر متحد البؤر:
   1. في علامة التبويب المشغل ، حدد البدء بمشغل TTL (تشغيل) والمشغل (كل إطار).
   2. في علامة التبويب سلسلة، قم بتعيين تشغيل السلسلة الزمنية وإيقاف تشغيل السلسلة z.
   3. قم بتعيين عدد الإطارات في السلسلة الزمنية لمطابقة عدد الخطوات في برنامج ATM (يتم استخدام 101 خطوة هنا).
7. في برنامج ATM ، انتقل إلى علامة التبويب تشغيل .
   1. اضبط مواضع مرحلة التأخير بالمليمترات لبدء وإيقاف المسح الطيفي. بالنسبة لمنطقة الرقم الموجي العالي CH ، استخدم موضع البدء = 90.25 مم وموضع التوقف = 92.25 مم.
   2. تأكد من أن عدد الخطوات يطابق عدد الإطارات في برنامج المجهر متحد البؤر.
8. بعد التحقق من الإعدادات الصحيحة ، ابدأ تشغيل المكدس الطيفي في برنامج المجهر متحد البؤر أولا. انتقل إلى اكتساب وانقر فوق بدء المسح الضوئي. ثم ، في برنامج ATM ، انقر فوق ابدأ. يؤدي هذا إلى بدء جمع سلسلة من الصور ، مع زيادات تدريجية في موضع مرحلة التأخير بين مواضع البدء والإيقاف المحددة
9. قم بتصدير سلسلة الصور الطيفية كملف .tif متعدد الإطارات واستخدم حزمة برامج مناسبة لإجراء المعايرة.
10. بمجرد اكتمال المعايرة، استخدم معادلة المعايرة الخطية لتحويل موضع مرحلة التأخير إلى إزاحات رامان.
11. للتبديل بين التصوير في المنطقة الاهتزازية CH (2800-3100 سم -1) إلى منطقة أميد I الاهتزازية 1500-1700 سم ^-1) ، قم بما يلي.
    1. قم بتغيير الطول الموجي للمضخة في برنامج الليزر من 802 نانومتر إلى 898 نانومتر.
    2. قم بتغيير إعداد تشتت Stokes في برنامج ATM من 30 مم إلى 5 مم.
    3. قم بإجراء تعديل بسيط على المرآة في مسار تشتت شعاع المضخة داخل صندوق SF-TRU. يتم ذلك عن طريق ضبط المقبض السفلي على حامل المرآة ، والذي يغير زاوية المرآة بمقدار متزايد.
    4. عند إجراء مسح فائق الطيفية فوق منطقة amide I ، اضبط مواضع البدء والإيقاف في برنامج ATM على 89 و 91 مم ، على التوالي
       تنبيه: يجب ارتداء نظارات واقية من الليزر لهذه الخطوة حيث سيتم الكشف عن شعاع الليزر.

النتائج

يتم تقديم وحدة توقيت التركيز الطيفي وإعادة التركيب (SF-TRU) بين ليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج ومجهر المسح الضوئي بالليزر المعدل. يحتوي نظام الليزر فائق السرعة القابل للضبط المستخدم في هذه الدراسة على منفذي إخراج يوفران شعاعا واحدا بطول موجي ثابت يبلغ 1045 نانومتر والحزمة الأخرى قابلة للضب?...

Discussion

قدمت هذه الدراسة مزيجا من وحدة SF-TRU ونظام الليزر ثنائي الإخراج فائق السرعة الذي أظهر تطبيقاته في التحليل الطيفي متعدد الوسائط. بفضل قدرتها على التحقيق في امتصاص الخلايا السرطانية لجسيمات الذهب النانوية (AuNPs) ، يمكن لمنصة التصوير متعدد الوسائط تصور الاستجابات الخلوية لعلاجات السرطان شديدة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APE SRS Detection Unit	APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)	APE Lock-in Module	Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning Unit	Olympus	FV 3000	Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm	Invitrogen	C37483	Polystyrene microspheres
Coverslips	Thorlabs	CG15CH2	22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBS	Gibco	10500-064	Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
Flouview	Olympus	FV31S-SW	Laser scanning microscope control software
Function Generator	BX precision	40543	Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
Gold Nanoparticles	Nanopartz	A11-60	Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output Interface	Olympus	FV30 ANALOG	This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3	Newport	Spectra-Physics	Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope Frame	Olympus	IX83	Inverted microscope
Mouse 4T1 cells	ATCC	CRL-2539	Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion Objective	Olympus	UPLSAPO60XW/IR	The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 Condenser	Nikon	CSC1003	Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMT	Hamamatsu	R3896	PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT Connector	Hamamatsu	C13654-01-Y002	Connector for PMT
Power Supply	RS	RSPD-3303 C	Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640	Gibco	A10491-01	Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRU	Newport Spectra Physics	SF-TRU	System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS