JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تعديلات المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) مع نظام إضاءة الضوء ، وتصنيع الخلايا السائلة ، وملاحظات TEM في الموقع للتفاعلات الناجمة عن الضوء بين الخلايا البكتيرية والمحسس الضوئي. كما تتم مناقشة طرق تحضير العينات وتلف شعاع الإلكترون والتصوير.

Abstract

يصف البروتوكول الحالي تعديلات إعداد المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) للملاحظات التي يسببها الضوء في الموقع . تم إدخال ألياف بصرية زجاجية في عمود الإلكترون فوق قطب العدسة الموضوعي ، وتم استخدام الليزر ، وهو مصدر ضوء قابل للتعديل ، لتصنيع الجهاز. بعد معايرة المصباح باستخدام نظام قياس خارجي ، فإنه يسمح للمرء بضبط شدة الإضاءة وفقا لاحتياجات العملية المرصودة. تم استخدام نظام الإضاءة هذا لتصوير ظواهر العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات ، والتي تخضع حاليا لبحث مكثف. تم تحضير العينة عن طريق اكتشاف تعليق البكتيريا على ركيزة الكربون أو الجرافين أو نيتريد السيليكون ، ونشاف المحلول الزائد ، واكتشاف محلول التحسس الضوئي ، ونشاف السائل الزائد مرة أخرى ، ثم تجميع الخلية السائلة مع ركيزة ثانية أو فيلم جرافين. تتضمن عملية تجربة التصوير نفسها اختيار المكان المناسب للمراقبة باستخدام تكبير منخفض وجرعة دنيا من الإلكترونات ، ثم التنشيط الدوري لمصدر الضوء لالتقاط صور لاحقة على فترات زمنية محددة بأقل قدر ممكن من الإلكترونات اللازمة. يجب تسجيل جرعة الإلكترون لكل تعرض ووقت وشدة الإضاءة المستخدمة بعناية بسبب تعقيد الظواهر المرصودة ، حيث أن العملية ، في الوقت نفسه ، مدفوعة بالضوء والإلكترون. بعد إجراء التجربة الفعلية ، يجب إجراء ملاحظات تحكم إضافية ، حيث يتم استخدام نفس جرعات الإلكترونات ولكن دون تأثير ضوئي إضافي ويتم استخدام جرعات أصغر من الإلكترونات لجرعات أعلى من الضوء. وهذا يجعل من الممكن التمييز بين التأثيرات الهيكلية المجهرية الناجمة عن الضوء وتلك التي تسببها الإلكترونات في كل من مجالات الحياة وعلوم المواد.

Introduction

الظواهر التي يسببها الضوء بدقة عالية مثيرة للاهتمام في العديد من المجالات مثل الهندسة النانوية1،2،3 ، والتحفيز4،5 ، والضوئيات الحيوية6. يمكن العثور على بعض التصاميم الأصلية التي تسمح بمثل هذه التجارب في الأدبيات ، بما في ذلك تعديلات أصحاب العينات1،4،7،8،9 والألياف البصرية المرفقة بالمجهر10،11.

إن الجمع بين الإضاءة الضوئية والبيئة السائلة والمجهر الإلكتروني الناقل (TEM) يعطي فرصة كبيرة للدراسات التفصيلية والديناميكية للعمليات المستحثة بالصور. ومع ذلك ، فإن حالة الفراغ العالي داخل المجهر غير مواتية إلى حد ما للعديد من السوائل ، وخاصة المحاليل المائية. يمكن تحقيق التغليف السائل ، الذي يحميه من البيئة ، باستخدام بعض التقنيات التي تعتمد بشكل أساسي على ركائز الجرافين 12 أو نيتريد السيليكون13 أو الكربون14. بالإضافة إلى الأبحاث في علوم المواد2 ، توفر ما يسمى بالخلايا السائلة إمكانيات لإجراء ملاحظات مجهرية غير تقليدية على العينات البيولوجية بالقرب من ظروفها الأصلية15. هذه الملاحظات صعبة للغاية ، خاصة بالنسبة للكائنات الحية الدقيقة مثل الخلايا البكتيرية. تسبب حزمة الإلكترون كإشعاع مؤين أضرارا لا رجعة فيها للعينات المائية ، لذلك يجب تحديد جرعة الإلكترون16. هذا ضروري لتقليل الآثار غير المواتية ، والتحكم في الضرر ، وتجنب القطع الأثرية المربكة. لا تزال الجرعة القصوى المثلى للإلكترون التي تسمح بمراقبة الخلايا الحية موضوعا مشكوكا فيه16 ، ولكن يبدو أن جرعة 30 e− / nm2 هي قيمة العتبة ، على الأقل بالنسبة للبكتيريا17.

بعض الموضوعات ذات الاهتمام لمثل هذه الدراسات المجهرية هي عمليات أثناء العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (APDT)18. باختصار ، يستمر العلاج على النحو التالي. الخلايا البكتيرية محاطة بسائل حساس للضوء يسمى المحسس الضوئي. عندما يتم إعطاء إضاءة ضوئية بطول موجي محدد ، يتم توليد أنواع الأكسجين التفاعلي السام للخلايا (ROS) من الطاقة أو نقل الشحنة من جزيئات المحسس الضوئي المثارة إلى الأكسجين الموجود بشكل طبيعي في المحلول. يتم تعطيل مسببات الأمراض المعرضة ل ROS بسرعة بكفاءة عالية جدا ، دون أي آثار جانبية19. تختلف الاستجابة للعلاج بالنسبة للميكروبات المتميزة - على سبيل المثال ، قد يكون تأثير نفس المحسس الضوئي مختلفا تماما بالنسبة للبكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام20. بشكل عام ، ثبت أن الهدف الرئيسي ل ROS هو الهياكل الخارجية للخلايا ، حيث يؤدي الضرر إلى اضطرابات وظيفية في غشاء الخلية ، وبالتالي يؤدي إلى وفاة البكتيريا21,22. ومع ذلك ، فإن تلف الأحماض النووية والبروتيناتيمكن اعتباره أيضا سببا للتعطيل18 ، لذلك لا يزال من غير المعروف أي هياكل الخلايا هي الأهداف الرئيسية خلال هذه العملية19. يمكن أن يساعد الفهم الأعمق للعمليات الضارة في تحسين هذا العلاج النهائي. بالمقارنة مع طرق الفحص المجهري الضوئي المستخدمة في أبحاث APDT23 ، توفر تقنيات TEM المزيد من الإمكانيات للنظر إلى آلية APDT بدقة أعلى وتكبير24. تم بالفعل استخدام TEM بنجاح لمراقبة الخلايا أثناء العلاج المستمر ، مما سمح لنا بدراسة تلف البكتيريا إيجابية الجرام ووصف التغييرات التي تحدث داخل جدار الخلية بالتفصيل 6,25.

يقدم البروتوكول الحالي إعدادا تجريبيا مناسبا للتصوير عالي الدقة لتعطيل البكتيريا المستحثة بالضوء باستخدام TEM ، والذي يتطلب نظاما مناسبا لإضاءة الضوء ، وتغليف الخلايا بسائل ، والتحكم الصارم في جرعة الإلكترون. كانت البكتيريا المستخدمة في الملاحظة هي المكورات العنقودية الذهبية ، وتم استخدام محلول أزرق الميثيلين كمحسس للضوء. يتكون إعداد الإضاءة الضوئية الخاص من ليزر أشباه موصلات قابل للضبط متصل مباشرة بعمود المجهر باستخدام الألياف الضوئية. يوفر هذا التصميم تشعيعا موحدا في جميع أنحاء العينة بسبب الوضع المتوازي تقريبا للألياف البصرية على محور المجهر. يمكن بعد ذلك استخدام الضوء أحادي اللون ذي الكثافة العالية الناتج عن الليزر لدراسة التأثيرات الكيميائية الضوئية المختلفة. كان للضوء المستخدم في التجربة طول موجي يساوي 660 نانومتر لأنه في المنطقة المرئية ، يكون للميثيلين الأزرق قمم امتصاص عند 613 نانومتر و 664 نانومتر26. يعتمد بروتوكول تغليف السائل على ركائز الكربون ، مما يجعل الإجراء سريعا وغير معقد. أخيرا ، يتم تقديم طريقة لجرعة منخفضة في الموقع TEM مراقبة الخلايا في السائل. وتناقش الصعوبات المتعلقة بإعداد العينة، وتأثيرات جرعة الإلكترون على العينة الحساسة، وتفسير الصورة المعقول.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تعديل المجهر الإلكتروني الناقل

  1. قم بتعديل المجهر الإلكتروني الناقل عن طريق توصيل الألياف البصرية (انظر جدول المواد) بعمود المجهر في الجزء العلوي من العدسة الموضوعية. اترك بضعة سنتيمترات من المساحة بين العدسة الموضوعية والعدسة المكثفة، بالإضافة إلى فتحة مجانية للملحقات.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام حامل عينة مخصص4 أو حامل لملاحظات الكاثودولومينيسنت في التكوين العكسي1 .
  2. تحقق من النظام بحثا عن التسريبات باستخدام مضخات تفريغ خشنة. إذا لم يظهر النظام تسربا للفراغ ، فاختبر النظام تحت فراغ عال.
    1. تحقق من أن تشغيل نظام التفريغ لا ينحرف عن بدء تشغيل المجهر القياسي المهواة. في حالة وجود مشاكل في تنفيذ الوحدة النمطية أو تجميعها أو تشغيلها ، اتصل بموظفي الخدمة المعتمدين أو الشركة المصنعة للجهاز.
      ملاحظة: لن يحجب المصباح المصنوع والمثبت بشكل صحيح شعاع الإلكترون. إذا تحول الشعاع على التوالي أثناء تشغيل المجهر ، فلن يتم تغطية الألياف البصرية غير الموصلة بشكل كاف بدرع معدني وستتراكم شحنة كهربائية. في هذه الحالة ، حرك الألياف البصرية بعمق في سترة التوصيل.
  3. قم بقياس شدة الضوء باستخدام مستشعر طاقة الصمام الثنائي الضوئي (انظر جدول المواد). إذا كانت المسافة بين قطع القطب من العدسة الموضوعية لا تسمح بالقياس داخل المجهر ، فقم بقياس هندسة العينة والإضاءة وإعادة إنتاج هذه الظروف في إعداد قياس خارجي.
  4. إذا لم يكن المجهر مجهزا بنظام قياس جرعة الإلكترون ، فقم بإجراء المعايرة عن طريق قياس تيار الحزمة باستخدام كوب فاراداي (انظر جدول المواد) وحساب كثافة الإلكترونات التي تصطدم بالعينةرقميا 27.

2. تغليف البكتيريا مع المحسس الضوئي

  1. ضع شبكتي TEM غير المعالجتين المغطاة بالكربون غير المتبلور بين ملاقط متقاطعة تواجه الجانب المطلي بالكربون إلى الأعلى. أمسك الشبكات بالقرب من الحافة قدر الإمكان.
    ملاحظة: بالنسبة لبعض مجموعات الركيزة والمحلول والعينات، قد يكون من المفيد استخدام تفريغ التوهج على أحد الشبكات أو كليهما لإزالة شوائب المصنع والحصول على أقصى سطح محب للماء28. باستخدام مثال بكتيريا S. aureus ومحلول الميثيلين الأزرق ، تم تحديد أنه تم الحصول على أفضل النتائج وأكثرها قابلية للتكرار على الكربون الجديد غير المعالج على الشبكات النحاسية دون تفريغ توهج إضافي أو تنظيف البلازما6.
  2. ضع 4 ميكرولتر من محلول البكتيريا على إحدى الشبكات. يجب أن تكون الكثافة البصرية للعينة في حدود 5-10.
    ملاحظة: تم تنقية البكتيريا المستخدمة في الدراسة من الثقافة وتشتت في مخزن PBS المؤقت. يوصى بشدة بالتحقق من تركيز البكتيريا في العينة الطازجة في كل مرة تستخدمها ، على سبيل المثال ، باستخدام طرق التلطيخ السلبية ، باتباع البروتوكولات المعمول بها المتاحة29،30،31.
  3. انتظر لمدة 60 ثانية وقم بمسح السائل بعناية باستخدام ورق الترشيح. حاول نشر السائل في جميع أنحاء سطح الشبكة بأكمله أثناء هذه العملية.
  4. ضع 4 ميكرولتر من المحسس الضوئي على نفس الشبكة.
    ملاحظة: تم استخدام الميثيلين الأزرق بتركيز 2 ميكروغرام / مل كمحسس للضوء لهذه الدراسة.
  5. بعد 5 ثوان ، قم بمسح السائل. اترك طبقة رقيقة جدا من السائل على الركيزة.
  6. ضع الشبكة الجافة بسرعة فوق الشبكة المغطاة بالسائل.
  7. حرك الشبكة العلوية برفق إلى حافة الشبكة الثانية واضغط على الركائز عند الحواف باستخدام ملاقط.
    ملاحظة: قد يتدفق بعض السائل خارج العينة في هذه المرحلة، مما يعني أنه لم يتم تصريف ما يكفي منه. ومع ذلك ، هذا لا يعني بالضرورة أن تكوين الخلية السائلة لن ينجح.
  8. كرر الضغط بعناية.
    ملاحظة: من الأسهل تنفيذ هذه الخطوة عن طريق تدوير الملقط بمقدار 90 درجة بحيث تقع عموديا على الطاولة وتبقى أطراف الملقط على نفس الارتفاع ، ولا تعتمد على موضع الفتح / الإغلاق.
  9. اترك الخلية السائلة بين الملقط لمدة 1 دقيقة.
  10. أدخل العينة في حامل TEM مباشرة بعد الانتهاء من التحضير.
    ملاحظة: سيساعد توتر لوحة / حلقة تركيب الحامل الركائز على الالتصاق بالسائل والحفاظ عليه في الداخل.
    1. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بضخ حامل العينة في محطة ضخ خارجية لتقليل تلوث المجهر عن طريق تبخير السائل.

3. في الموقع ملاحظات TEM للخلايا البكتيرية في تأثير جرعة الإلكترون السائل

  1. أدخل العينة في المجهر.
  2. ابدأ عمليات الرصد في وضع التكبير المنخفض للعثور على منطقة مراقبة مناسبة.
    ملاحظة: من المرجح أن تكون المناطق الداكنة سائلة بسبب تشتت شعاع الإلكترون.
    1. أثناء الملاحظات ، حافظ على جرعة الإلكترون منخفضة قدر الإمكان. قم بتوسيع وقت التعرض (حتى 2 ثانية لجهد متسارع يبلغ 150 كيلو فولت وتكبير 5000 ضعف). إن تكبير 5000x للكاميرا المثبتة في الأسفل (مجال الرؤية التقريبي هو 10 ميكرومتر) يكفي لتصوير البكتيريا التي يبلغ قطرها ~ 1 ميكرومتر.
      ملاحظة: في بعض الأحيان ، ليس من السهل التمييز بين السائل ، لذلك ، في بداية الملاحظات ، من المفيد تركيز حزمة الإلكترون حيث من المحتمل أن يكون سائلا. يجب أن يتحرك السائل على حزمة إلكترون مركزة ، وستظهر الفقاعات. بعد هذا التحقق ، من الضروري العثور على منطقة أخرى لمزيد من الملاحظات.
  3. ابحث عن الخلايا المحاطة بالسائل عند التكبير المناسب مع وقت التعرض الممتد والتقط الصورة الأولى على الفور. حافظ على جرعة الإلكترون ثابتة وجمع الصور كل 30 ثانية لمراقبة التغييرات.
  4. افحص الصور بعناية واحسب إجمالي جرعة الإلكترون27 التي تتوافق مع التغيرات المرئية الأولى في الخلايا.

4. ملاحظات TEM في الموقع للعمليات التي يسببها الضوء بين الخلايا البكتيرية والمحسس الضوئي

  1. قبل البدء في التجربة، اضبط شدة ضوء الليزر عن طريق ضبط القيمة الحالية. اختر الطول الموجي المناسب وفقا لطيف امتصاص المحسس الضوئي. وفقا لمخطط المعايرة السابق (الخطوة 1.4)، اختر القيمة الحالية المقابلة لأقل كثافة ضوء.
    ملاحظة: كان الطول الموجي للضوء المستخدم في هذه الدراسة 660 نانومتر.
  2. أدخل العينة في المجهر وابحث عن منطقة المراقبة باتباع الخطوة 3.2. في القسم السابق.
  3. التقط الصورة الأولى للخلية قبل بدء إضاءة العينة واستخدم فراغ الشعاع لإيقاف تشغيل شعاع الإلكترون لتجنب تأثيرات تشعيع الإلكترون.
  4. قم بتشغيل الليزر. ابدأ بوقت إضاءة قصير (هنا 30 ثانية) لأن ضوء الليزر له كثافة عالية نسبيا. بعد ذلك الوقت ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء.
  5. قم بإيقاف تشغيل فراغ الشعاع والتقاط الصورة على الفور. إذا كان ذلك ممكنا، استخدم خوارزمية تلقائية لعرض العينة فقط للوقت اللازم لالتقاط الصورة. قم بقياس وقت تشعيع الإلكترون بعناية لحساب جرعة الإلكترون27 المستخدمة في التصوير.
  6. كرر الخطوة 4.4. والخطوة 4.5. للحصول على وقت الإضاءة المتوقع للضوء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم تصميم الإعداد التجريبي لمراقبة العمليات التي يسببها الضوء والتي تحدث في سائل عالي الدقة. سمح لنا التحليل التنافسي للصور بالتمييز بين الضرر الناجم عن شعاع الإلكترون والتغيرات المتعلقة بالتفاعل الكيميائي الضوئي. كان تأثير شعاع الإلكترون على العينة الحساسة (في هذه الحالة ، الخلايا المغ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يتطلب تركيب وتشغيل المصباح معرفة أساسية بالخدمة ويمكن أن يتلف المجهر. أبسط طريقة لإدخال الضوء إلى المجهر هي توصيل الألياف البصرية من أعلى العدسة الموضوعية ، حيث يوجد عادة مجال لملفات انحراف TEM وأجهزة الكشف الإضافية. يمكن أيضا توقع المزيد من المساحة الحرة من أجهزة الدخول العلوية القديمة ، ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم البحث من خلال منحة Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100 ، المركز الوطني للعلوم ، بولندا).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Carbon film on 200 mesh copper gridAgar ScientificAGS160The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover TweezersDumontN5The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power SensorThorLabsS130CThe sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode FiberThorlabsFG400UEPMust be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron MicroscopeHitachiH-800Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode LaserCNIMRL-III-660DThe light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum

References

  1. Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
  2. Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
  3. Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
  4. Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705(2012).
  5. Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308(2019).
  6. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463(2021).
  7. Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
  8. Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
  9. Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
  10. Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
  11. Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
  12. Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
  13. Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
  14. Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
  15. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  16. De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
  17. Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
  18. Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
  19. Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
  20. Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
  21. Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
  22. Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
  23. Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
  24. Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185(2020).
  25. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388(2021).
  26. Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
  27. Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058(2021).
  28. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
  29. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  30. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  31. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).
  32. Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
  33. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  34. Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved