JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تماشيا مع الحاجة الملحة لفحص مرض السكري من النوع 1 ومرض الاضطرابات الهضمية ومرض فيروس كورونا 2019 ، قمنا بتطوير اختبار تلألؤ كهروكيميائي 6-Plex عالي الإنتاجية للكشف في وقت واحد عن جميع الأجسام المضادة الذاتية الأربعة للجزيرة ، والأجسام المضادة الذاتية للأنسجة transglutaminase ، والأجسام المضادة لمجال ربط المستقبلات لفيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة.

Abstract

تعد التجربة السريرية الجارية ، فحص المناعة الذاتية للأطفال (ASK) ، أول دراسة فحص في عموم السكان لمرض السكري من النوع الأول (T1D) ومرض الاضطرابات الهضمية في الولايات المتحدة. مع جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) ، هناك حاجة ماسة إلى وبائيات COVID-19 لدى عامة السكان والمعرفة حول العلاقة بين عدوى COVID-19 وتطوير T1D. واجهت طريقة الفحص القياسية الحالية لفحص الربط الإشعاعي (RBA) تحديين كبيرين: الكفاءة المنخفضة مع شكل فحص واحد وخصوصية المرض المنخفضة مع نسبة كبيرة من الأجسام المضادة منخفضة التقارب المتولدة في الفحص. باستخدام منصة اختبار التلألؤ الكهروكيميائي متعدد الإرسال (ECL) الذي أنشأناه سابقا ، تم تطوير اختبار جديد ل 6-Plex ECL يجمع ، في بئر واحد ، بين جميع الأجسام المضادة الذاتية الأربعة للجزر (IAbs) إلى الأنسولين ، وحمض الجلوتاميك ديكاربوكسيلاز (GAD65) ، ومستضد insulinoma 2 (IA-2) ، وناقل الزنك 8 (ZnT8) ل T1D ، والأجسام المضادة الذاتية transglutaminase (TGA) لمرض الاضطرابات الهضمية ، ومتلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) المجال الموثق للمستقبلات (RBD) مرض كوفيد 19. تم التحقق من صحة الفحص في المكفوفين باستخدام 880 عينة من دراسة ASK ، بما في ذلك 325 عينة إيجابية و 555 جميع العينات السلبية للأجسام المضادة ، ومقارنتها مع RBAs القياسية وفحص ECL واحد. مع مزايا الكفاءة العالية والتكلفة المنخفضة وانخفاض حجم المصل ، تم قبول هذا الفحص كأداة فحص أساسية لدراسة ASK.

Introduction

تظهر الدراسات الوبائية الكبيرة في جميع أنحاء العالم أن معدل الإصابة بمرض السكري من النوع الأول (T1D) يزداد بسرعة بنسبة 3٪ -5٪ سنويا ، وقد تضاعف انتشار T1D في السنوات العشرين الماضية ، خاصة في الأطفال الصغار 1,2. عادة ما تظهر الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة (IAbs) قبل سنوات من الأعراض السريرية وهي حاليا المؤشرات الحيوية التنبؤية والتشخيصية الأكثر موثوقية ل T1D3. يمكن لفحص الأجسام المضادة الذاتية T1D تحديد الأشخاص المعرضين لخطر التقدم إلى T1D السريري ، وتثقيف الجمهور ، والحد إلى حد كبير من المضاعفات التي تهدد الحياة من الحماض الكيتوني ، والاستفادة من التجارب السريرية للعلاجات الوقائية. تبذل حاليا جهود الوقاية من T1D في جميع أنحاء العالم ويتم إجراء تجارب تدخلية متعددة بين الأشخاص الذين لديهم IAbs إيجابي لتأخير التقدم إلى T1D السريري ، وأطلق مركز باربرا ديفيس للسكري أول تجربة سريرية أمريكية للفحص في عموم السكان في عام 2016 لمرض T1D والاضطرابات الهضمية ، فحص المناعة الذاتية للأطفال (ASK)4 . مرض الاضطرابات الهضمية (CD) هو مرض التهابي معوي مزمن مرتبط بالعوامل المناعية والوراثية. يمكن أن يصل انتشار CD لدى الأطفال المصابين ب T1D إلى 24.5٪ 5. قد لا يعاني أكثر من نصف الأفراد المصابين ب CD من أعراض نموذجية في العرضالتقديمي 6 ، لذلك يعد الفحص المصلي لمرض الاضطرابات الهضمية ضروريا للغاية.

منذ بدء جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) ، تم الإبلاغ عن أكثر من 200 مليون حالة على مستوى العالم ، ويمثل الأطفال ما يصل إلى 16٪ من الحالات المؤكدة مختبريا7. أظهرت العديد من الدراسات تأثير T1D الحالي على شدة ووفيات عدوى COVID-198 ، في حين أن تأثير عدوى COVID-19 على تطور T1D غير واضح. هناك حاجة ماسة إلى التحقيق في المعدل الإجمالي لعدوى COVID-19 لدى عامة السكان من خلال تحديد الأجسام المضادة لفيروس كورونا 2 (SARS-COV-2) للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة ودراسة العلاقة بين عدوى COVID-19 وتحفيز المناعة الذاتية T1D أو تسريع تقدم T1D ومهم للغاية ، في حين أن دراسة ASK المستمرة هي منصة ممتازة لذلك. نظرا لشكل الفحص الفردي وتوليد نسبة كبيرة من إيجابية الأجسام المضادة منخفضة التقارب ، فقد واجه الفحص القياسي المرتبط بالإشعاع (RBA) عنق الزجاجة من الكفاءة المنخفضة وخصوصية المرض المنخفضة9. في هذه الورقة ، نقدم اختبارا جديدا للتألق الكيميائي الكهربائي 6-Plexed (ECL) مبني على منصة فحص ECL متعددة الإرسال السابقة باستخدام لوحة متعددة البلكس ، يجمع بين ستة اختبارات للأجسام المضادة الذاتية في بئر واحد ، بما في ذلك جميع IAbs الأربعة الرئيسية للأنسولين (IAA) ، وحمض الجلوتاميك decarboxylase-65 (GADA) ، ومستضد insulinoma -2 (IA-2A) ، ونقل الزنك -8 (ZnT8A) ، والأجسام المضادة الذاتية إلى transglutaminase (TGA) لمرض الاضطرابات الهضمية ، والأجسام المضادة لمجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2 (RBD) (COVID-19A). هذا هو أول فحص متعدد الإرسال قام بتوظيف لجنة كاملة من أربعة IAbs رئيسية ودمج هذا مع TGA و COVID-19A. وقد تم التحقق من صحته وقبوله رسميا كأداة فحص أولية تحل محل RBA القياسي في دراسة ASK.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المتعددة في كولورادو.

1. إعداد المخزن المؤقت

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لوضع العلامات (2x PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.9): أضف 100 مل من 10x PBS إلى 400 مل من الماء المقطر واضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام NaOH إلى 7.9.
  2. جعل 3 mM من البيوتين و Ru Sulfo-NHS: إذابة 1 ملغ من البيوتين في 588 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات وإذابة 150 نانومول من Ru Sulfo-NHS في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لوضع العلامات.
  3. تحضير المخزن المؤقت للمستضد (1٪ BSA): قم بإذابة 5 جم من ألبومين مصل البقر (BSA) في 500 مل من 1x PBS.
  4. تحضير المخزن المؤقت للطلاء (3٪ مانع A): قم بإذابة 15 جم من Blocker A في 500 مل من 1x PBS.
  5. قم بإعداد أول مخزن مؤقت للغسيل (0.05٪ Tween 20 ، PBST): امزج 2.5 مل من Tween 20 في 5000 مل من 1x PBS.
  6. تحضير المخزن المؤقت الثاني للغسيل (0.4 مليون كلوريد الصوديوم): امزج 50 مل من 5 ملايين كلوريد الصوديوم في 575 مل من الماء المقطر لصنع محلول كلوريد الصوديوم 0.4 متر.
    ملاحظة: للحصول على وسم فعال، استخدم دائما حلول البيوتين الطازجة و Ru Sulfo-NHS وليس تلك المخزنة المصنوعة سابقا.

2. وضع العلامات على بروتين المستضد مع البيوتين و Ru Sulfo-NHS بشكل منفصل

ملاحظة: يوصى بتركيز أعلى من بروتين المستضد ≥0.5 ملغم/مل لزيادة كفاءة وضع العلامات.

  1. قم بإعداد ستة حلول مستهدفة لبروتين المستضدات ، بما في ذلك البروأنسولين ، GAD-65 ، IA-2 ، ZnT8 ، TG ، ومجال ربط المستقبلات (RBD) لبروتين سبايك من SARS-CoV-2. احسب مولات كل بروتين مستضد وفقا لوزنه الجزيئي وقم بعمل نسب مولية مناسبة من البيوتين أو Ru Sulfo-NHS. ستكون نسبة المستضد إلى مجموع البيوتين أو Ru Sulfo-NHS 1: 5 للمستضدات الجزيئية الصغيرة (الوزن الجزيئي ≤10 كيلو ديسيبل) ، مثل بروتين البروأنسولين. بالنسبة للمستضدات الجزيئية المتوسطة (الوزن الجزيئي 10-50 كيلو ديسي) ، مثل ZnT8 ، سيتم ضبط النسبة إلى 1:10. بالنسبة لمستضدات الوزن الجزيئي الكبيرة (الوزن الجزيئي >50 كيلو ديسي) ، مثل GAD ، ستكون النسبة المولية 1:20.
  2. قسم بروتين المستضد إلى جزأين متساويين واخلطه بشكل منفصل مع البيوتين و Ru Sulfo-NHS باستخدام النسبة المولية المحسوبة في الخطوة 2.1. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1.5 ساعة ، وتجنب الضوء.
    ملاحظة: يجب إزالة جميع المواد الكيميائية المختزلة مثل Tris أو glycine في المخزن المؤقت لبروتين المستضد بواسطة عمود دوران كبير الحجم مجهز بمخزن مؤقت من 2x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.9).
  3. قم بتعبئة أعمدة الدوران باستخدام 2x PBS (يعتمد حجم عمود الدوران ، 2 مل أو 5 مل ، على حجم بروتين مستضد الوسم): أضف 1 مل من المخزن المؤقت 2x PBS إلى عمود الدوران ، وقم بطرده المركزي عند 1000 × g لمدة دقيقتين ، وكرر الخطوة 2x أكثر.
  4. دع خليط بروتين المستضد - البيوتين أو - Ru Sulfo-NHS يمر عبر عمود الدوران الجاهز 1x (الطرد المركزي للعمود عند 1000 × g لمدة دقيقتين) لتنقية وإيقاف تفاعل وضع العلامات.
  5. قم بقياس الحجم النهائي لبروتين المستضد المسمى المستخرج من أعمدة الدوران ، مع حساب تركيزات بروتين المستضد المسمى البيوتين أو Ru Sulfo-NHS. اصنع أليكوتات أصغر من بروتين المستضد المسمى (50 ميكرولتر / أنبوب) وخزنها عند -80 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل.
    ملاحظة: ستكون تغطية البروتين بعد كل عمود دوران بمعدل احتفاظ تقريبي يتراوح بين 90٪ و 95٪.

3. تحديد أفضل تركيز ونسب للمستضدات الموسومة بالبيوتين و Ru Sulfo-NHS لفحص 6-Plex ECL (فحص رقعة الشطرنج)

ملاحظة: فحص رقعة الشطرنج لكل مستضد ضروري قبل الاندماج في الفحص متعدد الإرسال.

  1. قم بتطبيق فحص رقعة الشطرنج لكل مستضد على حدة.
    ملاحظة: الخطوات 3.2.-3.7. سوف تستخدم TGA كمثال موجز. عملية فحص رقعة الشطرنج TGA هي محاكاة عملية الفحص ولكن مع نوع واحد فقط من المستضدات.
  2. قم بإجراء التخفيف التسلسلي ل tTG البيوتينيل و Ru Sulfo-NHS المسمى tTG. تبدأ تركيزات العمل الموصى بها لمحلول الخليط الأول من 240 نانوغرام / مل لكل من البيوتينيل و tTG المسمى Ru Sulfo-NHS. افترض أن تركيزات كل من tTG الأصلي البيوتينيل و Ru Sulfo-NHS المسمى هي 1.0 ميكروغرام / ميكرولتر. قم بإجراء تخفيف 10x ل tTG الأصلي المسمى Ru Sulfo-NHS وتخفيف 5x من tTG البيوتينيل الأصلي مع 5٪ BSA.
  3. امزج 4 ميكرولتر من بروتين tTG البيوتينيل مع 156 ميكرولتر من 5٪ BSA (مخزن مستضد عازل) و 240 ميكرولتر من الرابط المترافق مع الستربتافيدين في أنبوب واحد واحتضن المحلول في RT لمدة 30 دقيقة. ثم ، أضف 160 ميكرولتر من محلول التوقف ، واحتضن في RT لمدة 30 دقيقة أخرى. خذ 400 ميكرولتر من الخليط واخلطه مع 2 مل من محلول الإيقاف. تركيز tTG البيوتينيل في الخليط هو 240 نانوغرام / مل.
  4. لإجراء تخفيف تسلسلي لمستضد ZnT8 المسمى بالبيوتين ، قم بإعداد خمسة أنابيب جديدة أخرى ، وخذ 1 مل من الأليكوت من الخليط في الخطوة 3.3. وتخلط مع 1 مل من محلول التوقف في أنبوب جديد ، واحصل على الخليط بتركيز 120 نانوغرام / مل. كرر هذه الخطوة ، وقم بإجراء تخفيفات تسلسلية بنسبة 1: 1 ، واحصل على tTG المسمى بالبيوتين عند 60 نانوغرام / مل ، و 30 نانوغرام / مل ، و 15 نانوغرام / مل ، و 7.5 نانوغرام / مل.
  5. أضف 4 ميكرولتر من tTG المسمى Ru Sulfo-NHS مع 1.6 مل من محلول التوقف ، واحصل على مزيج من tTG المسمى Ru Sulfo-NHS بتركيز 240 نانوغرام / مل. بنفس الخطوات من 3.4.، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بنسبة 1:1 واحصل على مستضد ZnT8 المسمى Ru Sulfo-NHS عند 60 نانوغرام/مل، و30 نانوغرام/مل، و15 نانوغرام/مل، و7.5 نانوغرام/مل، و3.75 نانوغرام/مل. التركيز الأخير هو 0 نانوغرام / مل ، مع محلول إيقاف فقط وعدم وجود مستضد يحمل علامة Ru Sulfo-NHS.
  6. قم بإعداد عينات مصل التحكم الإيجابي والتحكم السلبي tTG (المؤهلة مسبقا والموحدة بواسطة فحص ECL tTG واحد) ولوحة PCR 96 جيدا. Aliquot عينات مصل التحكم الإيجابية والسلبية إلى النصف الأيسر والنصف الأيمن من اللوحة ، على التوالي ، مع 7 ميكرولتر في كل بئر. أضف 1x PBS إلى اللوحة ، مع 33 ميكرولتر لكل بئر.
  7. على النصف الأيسر من لوحة PCR ، أضف 24 ميكرولتر من محلول tTG-linker المخفف التسلسلي المسمى بالبيوتين إلى كل بئر ، عمود واحد بتركيز واحد بترتيب من الأعلى إلى الأدنى. بنفس الطريقة ، أضف 16 ميكرولتر من مستضد Ru Sulfo-NHS المخفف التسلسلي المسمى tTG إلى كل بئر ، صف واحد بتركيز واحد ، ثم اخلطه جيدا. كرر الخطوة الموجودة على النصف الأيمن من لوحة PCR.
  8. تابع بقية خطوات الفحص الموضحة في الخطوات 5.3.-9.1. حتى يتم الحصول على بيانات العد الخام.
  9. حساب نسب إشارات التحكم الإيجابية إلى إشارات التحكم السلبية المقابلة. حدد أفضل تركيز للمستضد المسمى بالبيوتين والمستضد المسمى Ru Sulfo-NHS مع قيم نسبة أعلى وخلفية أقل لعينة التحكم السلبية. وترد أدناه تركيزات العمل المثلى للبيوتين وبروتين المستضد المسمى Ru Sulfo-NHS: 16.0 نانوغرام/مل و8.0 نانوغرام/مل ل GAD65 و 18.8 نانوغرام/مل و 9.4 نانوغرام/مل ل SARS-CoV-2 RBD و 42.0 نانوغرام/مل و 42.0 نانوغرام/مل ل IA-2 و 60.0 نانوغرام/مل و 60.0 نانوغرام/مل ل tTG و 4.2 نانوغرام/مل و 4.2 نانوغرام/مل ل ZnT8، و 31.3 نانوغرام / مل و 31.3 نانوغرام / مل للبروأنسولين.

4. إنشاء حل مستضد مقترن بالوصلة

  1. قم بتخفيف المستضدات التي تحمل علامة البيوتين و Ru Sulfo-NHS بنسبة 5٪ BSA إلى تركيزات العمل المثلى وفقا للخطوة 3.9.
  2. ربط الروابط المختارة مسبقا بكل بروتين مستضد البيوتينيلات. بالنسبة لفحص لوحة واحد مكون من 96 بئرا ، أضف 4 ميكرولتر من GAD65 الحيوي ، و SARS-CoV-2 RBD ، و IA-2 ، و tTG ، و ZnT8 ، وبروتين مستضد البروأنسولين في أنبوب منفصل يحتوي على 156 ميكرولتر من 1٪ BSA واخلطه مع 240 ميكرولتر من الروابط المقابلة المترافقة مع الستربتافيدين 1 و 2 و 3 و 8 و 9 و 10 (الشكل 1). احتضني الخليط لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. Aliquot 160 ميكرولتر من محلول التوقف في كل أنبوب واحتضان الخليط في RT لمدة 30 دقيقة. أخرج 400 ميكرولتر من محلول الخليط من كل أنبوب وامزجها معا.
  4. أضف 4 ميكرولتر من مستضد Ru Sulfo-NHS المسمى GAD65 و SARS-CoV-2 RBD و IA-2 و tTG و ZnT8 ومستضد البروأنسولين إلى الخليط أعلاه ، ثم أضف 1.6 مل من محلول التوقف و 3.2 مل من 1x PBS واخلط. الآن حل المستضد جاهز للاستخدام في الفحص.

5. احتضان عينات المصل مع المستضد المسمى

  1. Aliquot 7 ميكرولتر من المصل لكل بئر للوحة PCR 96 بئر وتغطي مع فيلم الختم. سخني الأمصال مسبقا على درجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على جهاز PCR. الطرد المركزي لفترة وجيزة لوحة في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة.
  2. أضف 63 ميكرولتر من محلول المستضد (المحضر في الخطوة 4.4) لكل بئر ، واخلطه مع المصل. قم بتغطية لوحة PCR بورق مانع للتسرب لتجنب الضوء.
  3. رج اللوحة على الخلاط عند 450 دورة في الدقيقة عند RT لمدة 2 ساعة ثم احتضن اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة 18-24 ساعة.

6. إعداد لوحة 6-Plex

  1. خذ لوحة 6-Plex من الثلاجة 4 درجات مئوية ، مما يسمح للصفيحة بالوصول إلى RT. أضف 150 ميكرولتر من 3٪ Blocker A إلى كل بئر من لوحة 6-Plex.
  2. ضع الطبق مرة أخرى في ثلاجة 4 درجات مئوية ، وقم بتغطية الطبق بورق القصدير لتجنب الضوء ، واحتضنه طوال الليل.
    ملاحظة: تتضمن خطوات الفحص في اليوم 1 الأقسام من 4.إلى 6.

7. نقل مصل / مستضد يحتضن في لوحة 6-Plex

  1. في اليوم التالي ، خذ لوحة 6-Plex المحتضنة من الثلاجة وقم بتفريغ كل المخزن المؤقت خارج اللوحة. ربت على الطبق على المناشف الورقية حتى يجف.
  2. اغسل لوحة 6-Plex 3x مع 150 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت لكل بئر في كل مرة. جفف اللوحة على مناشف ورقية ، ويحضن مصل / مستضد aliquot من كل بئر من لوحة PCR المحتضنة بين عشية وضحاها إلى بئرين من لوحة 6-Plex (30 ميكرولتر لكل بئر للتكرارات).
  3. قم بتغطية اللوحة بورق القصدير، ثم ضع اللوحة على شاكر اللوحة، ورجها بسرعة 450 دورة في الدقيقة عند RT لمدة 1 ساعة.

8. اغسل لوحة 6-Plex وأضف المخزن المؤقت للقراءة

  1. قم بتفريغ المحلول في لوحة 6-Plex واغسل اللوحة 3x ب 150 ميكرولتر من 0.4 M NaCl المخزن المؤقت للغسيل لكل بئر في كل مرة.
  2. بعد اكتمال الغسيل الثالث ، جفف اللوحة على المنشفة الورقية وأضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للقراءة في كل بئر.
    ملاحظة: تؤثر فقاعات الهواء في البئر على دقة آلة قارئ الألواح ويجب تجنبها بأي ثمن.

9. قراءة اللوحة وتحليل البيانات

  1. عد اللوحة على محلل التلألؤ الكهروكيميائي. سيتم عرض نتائج القراءة مع القيم في العد في الثانية (CPS). احسب مؤشر الأجسام المضادة النسبي لكل عينة باستخدام CPS الخام الذي تم الحصول عليه من آلة القراءة مقابل CPS للضوابط الإيجابية والسلبية القياسية الداخلية لكل جسم مضاد محدد (قيمة المؤشر = [CPS (العينة) - CPS (المعيار السلبي)] / [CPS (المعيار الإيجابي) - CPS (المعيار السلبي)]).
  2. تحديد نتائج الأجسام المضادة السلبية أو الإيجابية باستخدام قيم القطع التي تم تحديدها عند النسب المئوية 99.5إلى 99.8 من 555 عينة تحكم سلبيةمن دراسة ASK (جميع عينات الأجسام المضادة السلبية دون تاريخ أو تاريخ عائلي لمرض السكري أو أي نوع آخر من أمراض المناعة الذاتية).
    ملاحظة: تتضمن خطوات الفحص في اليوم 2 الأقسام من 7 إلى 9.

النتائج

ويوضح الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3 النتائج التمثيلية. ويبين الجدول 1 نظام CPS الخام الذي تم الحصول عليه من آلة القراءة. في الجدول 2 ، تم ترتيب CPS الخام وفرزه بواسطة الروابط الستة والأجسام المضادة المقابلة. ويبين الجدول 3 قيم الفهرس المحسوبة مع CPS كما هو موضح في بروتوكول المقايسة. يجب التحقق من جميع قيم العد الخام لتجنب نتائج الفهرس النهائية الخاطئة الناجمة عن التكرارات السيئة. وفي الجدول 1، ترد أمثلة على التكرارات السيئة، مما أدى إلى حدوث خطأ في الحساب النهائي للفهرس في الجدول 3.

تم التحقق من صحة هذا الفحص بطريقة عمياء باستخدام 880 عينة مختارة من دراسة ASK مع 325 عينة إيجابية IAbs و 555 جميع عينات ABS السلبية. تمت مقارنة مستويات الأجسام المضادة الذاتية من فحص 6-Plex ECL للعينات 880 نقطة بنقطة مع مستويات اختبارات ECL المفردة المقابلة (الشكل 2) ومع RBA القياسي الواحد المقابل (الشكل 3). يتم سرد القطع والحساسية والخصوصية لكل جسم مضاد في الجدول 4. تم تحديد حساسية وخصوصية اختبار ECL-COVID-19A هذا بنسبة 100٪ و 99.9٪ على التوالي10.

figure-results-1302
الشكل 1: رسم توضيحي لفحص ECL 6-Plex. تقوم الأجسام المضادة الذاتية في المصل بتوصيل المستضد المسمى Ru Sulfo-NHS بالمستضد الحيوي ، والذي يقترن برابط محدد ويشكل مجموعة من رابط المستضد والأجسام المضادة والمستضدات. يتم التقاط المجمعات من خلال كل رابط محدد على البقع المحددة في لوحة 6-Plex. لكل مستضد ، تم تعيين أرقام الارتباط المحددة: GAD-linker-1 و Covid-19-linker-2 و IA-2-linker-3 و tTG-linker-8 و ZnT8-linker-9 و Proinslulin-linker-10. وقد عدل هذا الرقم بإذن من هو وآخرون.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2141
الشكل 2: مقارنة ستة مستويات من الأجسام المضادة في 880 عينة من دراسة ASK بين فحص ECL الفردي وفحص ECL 6-Plex. تعرض اللوحات مقارنات لمستويات الأجسام المضادة ل GADA و IAA و IA-2A و ZnT8A و TGA و COVID-19A ، على التوالي (تم تقديم مؤشر COVID-19A على أنه (100 × قيمة المؤشر المحسوبة)). تمثل الخطوط المنقطة قطع الفحص لكل فحص للأجسام المضادة. وقد عدل هذا الرقم بإذن من هو وآخرون.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2880
الشكل 3: مقارنة خمسة مستويات من الأجسام المضادة في 880 عينة من دراسة ASK بين RBA و 6-Plex ECL فحص. تعرض اللوحات مقارنات لمستويات الأجسام المضادة ل GADA و IAA و IA-2A و ZnT8A و TGA ، على التوالي. تمثل الخطوط المنقطة قطع الفحص لكل فحص للأجسام المضادة. وقد عدل هذا الرقم بإذن من هو وآخرون.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: عدد CPS الخام (النصف الأيسر من اللوحة). يتم الحصول على حساب CPS الخام من النصف الأيسر من لوحة الفحص. يتم تنفيذ كل عينة في نسختين. يمثل كل حساب CPS داخل نفس العمود (A1 ، A2 ، A3 ، إلخ) بيانات القراءة من 10 نقاط في نفس البئر (يتم وضع علامة على أرقام الروابط المقابلة). يتم تمييز أمثلة التكرارات السيئة باللون الرمادي، كما هو موضح في الصف D-linker 3 العمود 5 والعمود 6. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: ترتيب بيانات الجدول 1، مرتبة بستة روابط. وأعيد ترتيب قيم CPS من الجدول 1، مع حساب القيم المتوسطة للقراءات المكررة ل CPS وحذف القيم غير المستخدمة للروابط 4-7. يتم تمييز قيم الضوابط القياسية الداخلية الإيجابية العالية والإيجابية المنخفضة والسلبية لكل فحص للأجسام المضادة الذاتية بخط غامق داكن. الكمبيوتر الشخصي ، والسيطرة الإيجابية. NC ، السيطرة السلبية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: نتائج قيم المؤشر. تم حساب قيم المؤشر لكل عينة لجميع الأجسام المضادة الستة مقابل الضوابط الإيجابية والسلبية المقابلة. تم تعريف قيمة المؤشر الأكبر من قيمة القطع على أنها موجبة ، تم تمييزها بخط غامق داكن. أدت قيم CPS المكررة السيئة في الجدول 1 ، الصف D-linker 3-columns 5 و 6 ، إلى قيمة فهرس IA-2A إيجابية للعينة 11 (مظللة باللون الرمادي) ، والتي ربما كانت نتيجة إيجابية خاطئة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: فحص القطع والحساسية والخصوصية ل GADA و IA-2A و ZnT8A و IAA و TGA من بين 880 عينة ASK ، بما في ذلك 325 عينة إيجابية IAbs و 555 عينة سلبية لجميع الأجسام المضادة. تم تعيين قيمة مؤشر القطع الأمثل لفحص GADA و IA-2A و ZnT8A و IAA و TGA على الأقل إلى النسبة المئوية 99th على الأقل من عينات التحكم العادية البالغ عددها 555. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

دخل التدخل ل T1D عصر ما قبل T1D ، مع استمرار برامج الفحص الوطنية والدولية واسعة النطاق ل T1D والتجارب السريرية المزدهرة التي يتم تطبيقها في المرحلة الأولى T1D لإلغاء أو إبطاء التقدم إلى T1D السريري12,13. إن قياسات أربعة IAbs باستخدام RBA القياسي الحالي بتنسيق فحص IAb واحد شاقة وغير فعالة لبرنامج الفحص الشامل. مع الطلب الملح على فحص IAbs متعدد الإرسال عالي الإنتاجية ، ظهر فحص ECL متعدد الإرسال ، و ICA ELISA 3-Screen ، والكشف عن الأجسام المضادة عن طريق التراص - PCR (ADAP) كتقنيات تنافسية حاليا. في دراسة Fr1da لفحص T1D في مجموعة من الأطفال الصغار في ألمانيا ، تم استخدام 3-Screen ICA ELISA التي تجمع بين 3 IAbs (GADA و IA-2A و ZnT8A) كاختبار رئيسي14. أحد القيود الرئيسية على ICA ELISA ذات الشاشات الثلاثية هو عدم وجود IAA ، وهو في الغالب أول IAb يظهر مع انتشار مرتفع في الأطفال الصغار المصابين ب T1D. وعلاوة على ذلك، فإن الفحص غير قادر على التمييز بين أي من IAbs الثلاثة إيجابي من إشارة إيجابية، ويجب تكرار كل عينة إيجابية مع ثلاثة اختبارات واحدة للتأكيد. يجمع ADAP15 بين GADA و IA-2A و IAA ويوضح حساسية وخصوصية عالية للفحص في ورشة عمل IASP ولكنه يفتقر إلى البيانات المتعلقة بمدى تنبؤه في الفحص القائم على السكان لدراسات T1D ، والتي لا تستطيع ورشة عمل IASP تحديدها. تم بناء اختبار ECL متعدد الإرسال في هذه الدراسة على منصة اختبار ECL واحد تم التحقق من صحته مقابل RBA القياسي الحالي في تجارب سريرية متعددة مثل TrailNet 9,16 و DAISY 17,18,19 و ASK4,20,21 درس. تم التحقق من صحة الفحص الحالي مقابل كل من RBA و ECL واحد باستخدام 880 عينة مصل من المشاركين في دراسة ASK. كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3 ، كانت مستويات الأجسام المضادة بين 6-Plex و ECL الفردي أو بين 6-Plex و RBA متطابقة في الغالب مع بعضها البعض من أجل إيجابية الأجسام المضادة. كانت معدلات المصادفة ل IAbs التي تم اختبارها بواسطة RBA و 6-Plex 91.7٪ -97.8٪ ، وكانت معدلات المصادفة ل IAbs التي تم اختبارها بواسطة ECL واحد و 6-Plex 95.3٪ -99.2٪. كان الخلاف بين فحص ECL و RBA بشكل رئيسي من أولئك الذين لديهم IAb واحد. كانت مستويات IAbs التي تم اختبارها بواسطة 6-Plex و ECL الفردي (r = 0.6431-0.9434 ، وكلها p < 0.0001) و 6-Plex و RBA (r = 0.5775-0.8576 ، وكلها p < 0.0001) مرتبطة بشكل جيد أيضا. ارتبطت TGA التي تم اختبارها بواسطة فحص 6-Plex ارتباطا وثيقا بنتائج كل من RBA (99.4٪) وفحص ECL الفردي (99.4٪). بالإضافة إلى ذلك ، وصل COVID-19A الذي تم اختباره بواسطة 6-Plex إلى امتثال بنسبة 99.8٪ لنتائج فحص ECL الفردي.

ونتيجة لذلك ، تم قبول فحص 6-Plex ECL رسميا كطريقة فحص أولية لدراسة ASK الجارية وحل محل RBA22 القياسي. أظهر هذا الفحص حساسيته وخصوصيته الممتازة مع إنتاجية أعلى وتكلفة أقل وحجم أصغر من المصل مقارنة ب RBA القياسي.

وقد تم توثيق أنه في دراسة فحص T1D ، تم اكتشاف IAb واحد من قبل RBA ، والذي تناول نسبة كبيرة من إيجابيات IAb ، وكان ذو تقارب منخفض ، مع انخفاض خطر الإصابة بالأمراض ، وأدى إلى انخفاض القيمة التنبؤية الإجمالية 19,21,23,24,25,26. تسبب هذا التنبؤ المنخفض المخاطر في تكاليف إضافية ضخمة لزيارات المتابعة وأدى إلى صعوبات في الدراسات الوقائية T1D. وقد ثبت أن منصة فحص ECL الراسخة في تجارب سريرية متعددة تميز IAbs عالية التقارب عن IAbs منخفضة التقارب الناتجة عن RBA وتعزز بشكل كبير القيم التنبؤية لجميع IAbs الأربعة ، خاصة مع إيجابية IAb واحدة16,17,18,21 . تم بناء تقنية فحص ECL متعددة الإرسال على منصة فحص ECL الفردي ، مع هذه الميزة المميزة للكشف عن القيمة المطلقة عالية التقارب. في هذه الدراسة ، أوضح فحص 6-Plex ECL تشابهه مع اختبارات ECL الفردية المقابلة في الحساسية والخصوصية.

وقد تمت بالفعل تغطية بعض القيود والشواغل التقنية لفحص ECL المتعدد باستخدام لوحات Plex متعددة في المنشورات السابقة27,28. مع وجود ستة مستضدات موسومة في بئر واحد ، قد يكون هناك بعض التأثيرات بين المستضدات المختلفة ، ويمكن أن تزداد خلفية الفحص عند إضافة كل فحص للأجسام المضادة لتعدد الإرسال في نفس البئر. هناك حاجة إلى كمية كبيرة من أعمال تحسين المقايسة لضبط ظروف الفحص ، خاصة لضبط التركيزات النهائية لكل بروتين مستضد مسمى بناء على فحص رقعة الشطرنج لكل مستضد ، للحفاظ على الحساسية والخصوصية لكل فحص للأجسام المضادة. كما ذكرنا في الدراسات السابقة27,28 ، فإن عددا صغيرا من العينات (<1٪) يؤدي إلى إيجابية خاطئة على لوحة Plex المتعددة دون سبب أساسي واضح. وينبغي تكرار جميع النتائج الإيجابية وتأكيدها عن طريق فحص واحد للتحليل الإلكتروني للكفاءة كضمان روتيني لجودة المختبرات؛ عادة ، سيتم إزالة الإيجابيات الكاذبة. لم يتم ملاحظة النتائج السلبية الكاذبة الناجمة عن "تأثير البروزون" الذي لوحظ في فحص 7-Plex ECL السابق 27,28 في هذه الدراسة. في الفحص الموصوف هنا ، قمنا بإزالة خطوة العلاج الحمضي لعينات المصل من البروتوكول السابق ؛ بدلا من ذلك ، قمنا بتسخين عينات المصل مسبقا عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الخطوة 5.1). في اليوم الثاني من غسل الطبق، استخدمنا عازلا للغسيل يحتوي على 0.4 مليون نانوكلوريد الصوديوم (الخطوة 8.1) بدلا من مخزن الغسيل العادي لغسل اللوحة بشكل أكثر صرامة. جعلت هذه التعديلات فحص ECL المتعدد الإرسال أبسط وأقل خلفية دون فقدان حساسية المقايسة.

في الختام ، يتمتع هذا الفحص بأداء متميز للكشف عن أربعة IAbs و TGA و COVID-19A في وقت واحد. ميزة تعدد الإرسال ، بالإضافة إلى الإنتاجية العالية والتكلفة المنخفضة ومتطلبات حجم المصل الصغيرة ، تجعل الفحص واسع النطاق ل T1D والأمراض المصاحبة له أكثر جدوى في عموم السكان. المرضى الذين يعانون من T1D أو أي أمراض المناعة الذاتية لديهم خطر أعلى بكثير لأمراض المناعة الذاتية الأخرى. يوفر فحص ECL المتعدد الإرسال منصة ممتازة للكشف عن T1D وأمراض المناعة الذاتية المتعددة في وقت واحد.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم الدراسة من خلال منحة JDRF 2-SRA-2019-695-S-B ، و 2-SRA-2020-965-S-B ، و 1-SRA-2017-564-M_N ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة DK32083 ، ومنحة مركز أبحاث السكري (DRC) P30 DK116073.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mM NaClThermoFisher1070832
96-well Plate ShakerVWR12620-926
96-well round bottom plateFisher8408220
BiotinThermoFisherPI21329
Blocker AMSDR93AA
Bottle-Top 500 ml-Filter UnitsFisher0974064A
Bovine Serum AlbuminSigmaA-7906
GAD65 proteinDiamyd Medical10-65702-01
IA-2 protein (aa 605-979)Creative BioMart283309
MESO QuickPlex SQ120MSDR31QQ-3Electrochemiluminescence analyzer
PBS 10xThermoFisher70011044
PBS 1xThermoFisher10010023
Proinsulin proteinAmideBio20160118B3
Read buffer BMSDY0800019
SARS-CoV-2 RBD proteinCreative BiomartSpike-190V
Stop SolutionMSDY0090019
Sulfo-TAGMSDR91AO-1
tTG proteinDiarect AG15201
Tween 20SigmaP-1379
U-Plex 6-Assay SECTOR plateMSDZ00U0142E6-plex plate
U-PLEX Linker 1MSDL0010022
U-PLEX Linker 10MSDL0100020
U-PLEX Linker 2MSDL0020015
U-PLEX Linker 3MSDL0030018
U-PLEX Linker 8MSDL0080018
U-PLEX Linker 9MSDL0090014
ZeBa ColumnThermoFisher89892Spin columns
ZnT8 proteinResearch Laboratoryn/a

References

  1. Group, T. S. The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study. Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).
  2. Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
  3. Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  4. Stahl, M. G., et al. Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study. The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).
  5. Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study. BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).
  6. Agardh, D., et al. Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort. Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).
  7. COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate Available from: https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print (2021)
  8. Barron, E., et al. Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).
  9. Miao, D., et al. Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
  10. Jia, X., et al. Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).
  11. He, L., et al. High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease. Diabetes Technology & Therapeutics. , (2022).
  12. McQueen, R. B., et al. Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado. Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).
  13. Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. General population screening for type 1 diabetes: has its time come. Current Opinion in Endocrinology & Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).
  14. Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
  15. Cortez, F. J., et al. Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR. PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).
  16. Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
  17. Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  18. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  19. Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  20. Zhao, Z., et al. Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).
  21. Jia, X., et al. High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).
  22. He, L., et al. A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay. Diabetes. 70, 158 (2021).
  23. Achenbach, P., et al. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).
  24. Schlosser, M., et al. In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk. Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).
  25. Mayr, A., et al. GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes. Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).
  26. Siljander, H., et al. Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).
  27. Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
  28. Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases. Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185 1 COVID 19

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved