إثارة التفاعل بين الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا العصبية المستقبلة للألم

Summary

تتفاعل الخلايا العصبية المستقبلة للألم والخلايا القاتلة الطبيعية بنشاط في سياق التهابي. يتيح نهج الثقافة المشتركة دراسة هذا التفاعل.

Abstract

تطورت الخلايا العصبية الحسية الجسدية للكشف عن المنبهات الضارة وتنشيط ردود الفعل الدفاعية. من خلال مشاركة وسائل الاتصال ، تقوم الخلايا العصبية المستقبلة للألم أيضا بضبط دفاعات المضيف من خلال التحكم في نشاط الجهاز المناعي. يكون الاتصال بين هذه الأنظمة في الغالب تكيفيا ، مما يساعد على حماية التوازن ، ويمكن أن يؤدي أيضا إلى ظهور الأمراض المزمنة أو يعززها. تطور كلا النظامين معا للسماح بمثل هذا التفاعل المحلي ، كما هو موجود في الأنسجة اللمفاوية الأولية والثانوية والغشاء المخاطي. أظهرت الدراسات الحديثة أن مستقبلات الألم تكتشف وتستجيب مباشرة للمستضدات الأجنبية والسيتوكينات المشتقة من الخلايا المناعية والميكروبات.

لا يؤدي تنشيط مستقبلات الألم إلى فرط الحساسية والحكة فحسب ، بل يقلل من عتبة إطلاق مستقبلات الألم ، مما يؤدي إلى إطلاق الببتيدات العصبية محليا. يمكن للببتيدات التي تنتجها الطرفيات الطرفية لمستقبلات الألم وتنطلق منها أن تمنع الانجذاب الكيميائي واستقطاب الخلايا الليمفاوية ، وتتحكم في توطين الالتهاب ومدته ونوعه. تظهر الأدلة الحديثة أن الخلايا العصبية الحسية تتفاعل مع الخلايا المناعية الفطرية عن طريق الاتصال بالخلايا الخلوية ، على سبيل المثال ، إشراك مستقبلات المجموعة 2D (NKG2D) على الخلايا القاتلة الطبيعية (NK).

بالنظر إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية تعبر عن المستقبلات المشابهة لمختلف الوسطاء الذين ينتجهم مستقبلات الألم ، فمن المتصور أن مستقبلات الألم تستخدم الببتيدات العصبية للتحكم في نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية. هنا ، نبتكر طريقة زراعة مشتركة لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية القاتلة الطبيعية في طبق. باستخدام هذا النهج ، وجدنا أن الخلايا العصبية القطنية المستقبلة للألم تقلل من تعبير السيتوكين في الخلايا القاتلة الطبيعية. بشكل عام ، يمكن أن تكون هذه الطريقة الاختزالية مفيدة لدراسة كيفية تحكم الخلايا العصبية المعصبة للورم في الوظيفة المضادة للسرطان للخلايا القاتلة الطبيعية وكيف تتحكم الخلايا القاتلة الطبيعية في القضاء على الخلايا العصبية المصابة.

Introduction

تنشأ الأجسام الخلوية للخلايا العصبية الحسية في العقد الجذرية الظهرية (DRG). تقع DRG في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) ، بين القرن الظهري للحبل الشوكي وأطراف الأعصاب الطرفية. تسمح الطبيعة الزائفة أحادية القطب للخلايا العصبية DRG بنقل المعلومات من الفرع المحيطي ، الذي يعصب الأنسجة المستهدفة ، إلى الفرع المركزي ، الذي يحمل المعلومات الحسية الجسدية إلى الحبل الشوكي¹. باستخدام مستقبلات القناة الأيونية المتخصصة ، تستشعر الخلايا العصبية من الدرجة الأولى التهديدات التي تشكلها مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية والملوثات² ، مما يؤدي إلى تدفق الكاتيونات (Na ⁺ ، Ca²⁺) وتوليد جهد الفعل³،^4،5.

ترسل هذه الخلايا العصبية أيضا إمكانات عمل مضادة للدروم نحو المحيط ، حيث حدث استشعار الخطر الأولي ، مما يؤدي إلى الإطلاق المحلي للببتيدات العصبية ^1,4. لذلك ، تعمل الخلايا العصبية مستقبلات الألم كآلية وقائية ، تنبه المضيف إلى الخطر البيئي⁴،⁵،^6،7.

للتواصل مع الخلايا العصبية من الدرجة الثانية ، تطلق مستقبلات الألم العديد من الناقلات العصبية (مثل الغلوتامات) والببتيدات العصبية (على سبيل المثال ، الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) ، والمادة P (SP) ، والببتيد المعوي النشط في الأوعية (VIP)^)6,7. تعمل هذه الببتيدات على الشعيرات الدموية وتعزز تسرب البلازما والوذمة والتدفق المحلي وتعديل الخلايا المناعية²،^4،7.

يستخدم الجهاز الحسي الجسدي والجهاز المناعي نظام اتصال مشترك يتكون من السيتوكينات والببتيدات العصبية ، ومستقبلاتها المشابهة⁴. في حين أن هذا الاتصال ثنائي الاتجاه يساعد على الحماية من الخطر والحفاظ على التوازن ، فإنه يمكن أن يساهم أيضا في الفيزيولوجيا المرضية^{للأمراض 4}.

تصنف الخلايا القاتلة الطبيعية على أنها خلايا لمفاوية فطرية وهي متخصصة في القضاء على الخلايا المصابة بالفيروس. تخضع وظيفة الخلية القاتلة الطبيعية لتوازن المستقبلات التحفيزية والمثبطة ، بما في ذلك المستقبل المنشط NKG2D⁸. يتم التعبير عن الرباط الداخلي ل NKG2D ، حمض الريتينويك المحرض المبكر 1 (RAE1) ، من خلال الخلايا التي تخضع للإجهاد مثل تكوين الورم والعدوى ^8,9.

أظهرت التحقيقات الحديثة أن إصابة الأعصاب الطرفية تدفع الخلايا العصبية الحسية للتعبير عن جزيئات غير قادرة على التكيف مثل stathmin 2 (STMN2) و RAE1. وهكذا ، عن طريق الاتصال بالخلية الخلوية ، تم تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية المعبرة عن NKG2D عن طريق التفاعل مع الخلايا العصبية المعبرة عن RAE1. في المقابل ، تمكنت الخلايا القاتلة الطبيعية من القضاء على الخلايا العصبية المصابة مستقبلات الألم وفرط الحساسية الحاد للألم المرتبط عادة بإصابة الأعصاب¹⁰. بالإضافة إلى محور NKG2D-RAE1 ، تعبر الخلايا القاتلة الطبيعية عن المستقبلات المشابهة لمختلف الوسطاء الذين ينتجهم مستقبلات الألم. لذلك من الممكن أن يقوم هؤلاء الوسطاء بتعديل نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية. تقدم هذه الورقة طريقة استزراع مشترك للتحقيق في بيولوجيا تفاعل الخلايا العصبية القاتلة الطبيعية مستقبلات للألم. سيساعد هذا النهج في تعزيز فهم كيفية تعديل الخلايا العصبية المستقبلة للألم لاستجابات الخلايا المناعية الفطرية للإصابة أو العدوى أو الورم الخبيث.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وافقت لجان رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة مونتريال (# 22053 ، # 22054) على جميع إجراءات الحيوانات. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بالمحاليل وتكوينها وجدول المواد للحصول على قائمة بالمواد والمعدات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية والثقافة والتحفيز

1. توليد الخلايا العصبية nociceptor سليمة (السيطرة على littermate; TRPV1^بالوزن: :D TA fl / wt) والفئران المستأصلة (TRPV1 cre: :D TA fl / wt) عن طريق عبور الفئران السامة lox-stop-lox-diphtheria (DTA fl /^fl) مع الفئران TRPV1^{cre / wt}.
2. باستخدام استنشاق CO₂ ، قم بالقتل الرحيم لماوس التحكم في القمامة الساذج (TRPV1 wt: :D TA^{fl / wt}).
3. اجمع الطحال في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
4. تجانس الطحال باستخدام مدقة.
5. تمييع الخلايا مع 1 مل من PBS معقمة.
6. قم بتصفية الخليط من خلال مصفاة خلية 50 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
7. قم بتعبئة مستوى الصوت (10 مل) باستخدام PBS معقم.
8. جمع 10 ميكرولتر وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
9. جهاز طرد مركزي للخلايا (500 × جم ، 5 دقائق) وإزالة المادة الطافية.
10. أعد تعليق الخلايا بتركيز 10⁸ خلايا / مل في وسط RPMI 1640 المكمل .
11. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية خلايا الطحال القاتلة الطبيعية مغناطيسيا باستخدام مجموعة عزل الخلايا القاتلة الطبيعية للفأر. تأكد من نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام قياس التدفق الخلوي¹¹.
12. جمع 10 ميكرولتر وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
13. أجهزة الطرد المركزي للخلايا (500 × جم ، 5 دقائق) وإزالة المادة الطافية.
14. أعد تعليق الخلايا القاتلة الطبيعية في وسط ثقافة RPMI 1640 المكمل (يحتوي على IL-2 و IL-15).
15. الثقافة 2 × 10⁶ خلايا NK / مل في لوحة قاع U ذات 96 بئرا لمدة 48 ساعة.

2. عزل الخلايا العصبية DRG والثقافة

1. قبل 24 ساعة من نهاية تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية (الخطوة 1.15) ، قم بتغطية صفيحة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر / بئر من اللامينين (1 نانوغرام / مل) واحتضانها لمدة 45 دقيقة (37 درجة مئوية).
2. بعد الحضانة ، قم بإزالة المحلول واترك الآبار تجف في الهواء في خزانة السلامة البيولوجية.
3. باستخدام استنشاق CO₂ ، القتل الرحيم الخلايا العصبية nociceptor سليمة (السيطرة على littermate; TRPV1^بالوزن: :D TA fl / wt) أو الفئران المستأصلة (TRPV1^cre: :D TA^{fl / wt}).
   ملاحظة: يفضل استنشاق CO₂ على خلع عنق الرحم لأنه يتجنب تعطيل الأعصاب الشوكية المتصلة ب DRG.
4. ثبت الماوس على السبورة في وضع الانبطاح ، وارفع الجلد ، وشق الجلد على طول العمود الظهري. ارجع إلى Perner et al. للحصول على فيديو مفصل¹².
5. قطع المفصل القطني العجزي وفصل العجز عن العمود الفقري القطني بالمقص.
6. افصل العمود الفقري عن طريق قطع العضلات والأضلاع على جانبي العمود الفقري في اتجاه الجمجمة حتى يتم الوصول إلى قاعدة الجمجمة.
7. باستخدام مقص ، وقطع العمود الفقري في المفصل القذالي الأطلسي.
8. إزالة العضلات والأنسجة الدهنية من العمود الفقري.
9. دبوس وفتح العمود الفقري لإزالة الحبل الشوكي والوصول إلى DRG. ابحث عن DRG في الثقبة الفقرية المتصلة بالحبل الشوكي من خلال الجذر الظهري ولكنها منفصلة عن السحايا.
10. احصد DRGs في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مملوء ب 10 مل من DMEM المكمل بالثلج البارد.
11. جهاز طرد مركزي التحضير (200 × جم ، 5 دقائق ، درجة حرارة الغرفة) وإزالة المادة الطافية.
12. أضف 250 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على كولاجيناز IV (1 مجم / مل) و Dispase II (2.4 وحدة / مل).
13. احتضان DRG بمحلول كولاجيناز IV / Dispase II (C / D) (80 دقيقة ، 37 درجة مئوية ، تقليب خفيف). عند تجميع العقد من عدة فئران ، حافظ على نسبة 125 ميكرولتر من محلول C / D لكل عقدة.
14. لتعطيل الإنزيمات ، أضف 5 مل من وسط DMEM المكمل .
15. جهاز طرد مركزي المحلول (200 × جم ، 5 دقائق) وقم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام ماصة.
16. لتجنب فقدان الخلايا غير المرغوب فيه ، اترك ~ 100 ميكرولتر من المادة الطافية.
17. أضف 1 مل من وسط DMEM المكمل.
18. باستخدام مسدس ماصة وثلاثة ماصات باستور زجاجية ذات أحجام متناقصة ، قم بسحن بلطف (~ 10 لأعلى / لأسفل لكل حجم ماصة باستور) DRG في إعداد خلية واحدة.
19. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتخفيف ألبومين مصل الأبقار (BSA) في PBS المعقم إلى تركيز نهائي بنسبة 15٪. قم بتخزين 1 مل من القسمة عند -20 درجة مئوية.
20. قم بإنشاء تدرج BSA في أنبوب مخروطي سعة 15 مل عن طريق إضافة 2 مل من PBS المعقم والاستغناء ببطء عن 1 مل من محلول BSA بنسبة 15٪ في الجزء السفلي من الأنبوب. تجنب تعطيل التدرج عن طريق إزالة الماصة برفق.
21. باستخدام ماصة P200 ، ماصة ببطء تعليق العقد المستحن (الذي يحتوي على الخلايا العصبية) على جانب الأنبوب في التدرج.
22. جهاز طرد مركزي لتدرج BSA المحتوي على الخلايا العصبية (200 × جم ، 12 دقيقة ، درجة حرارة الغرفة). اضبط تسارع وتباطؤ أجهزة الطرد المركزي على الحد الأدنى للسرعة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، ستكون الخلايا العصبية في قاع الأنبوب بينما سيتم احتجاز حطام الخلية في تدرج BSA.
23. قم بإزالة كل المادة الطافية برفق باستخدام ماصة.
24. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من Neurobasal.
25. لوحة 10⁴ خلايا عصبية لكل بئر (200 ميكرولتر من القاعدية العصبية / البئر) في صفيحة 96 بئرا مطلية بالصفيحة ذات القاع المسطح 96.
    ملاحظة: في المتوسط ، سيتمكن المحقق من ملء ~ 8 آبار لكل فأر.
26. استزرع الخلايا العصبية (37 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها) للسماح بالتعلق.

3. الثقافة المشتركة وقياس التدفق الخلوي

1. إزالة ببطء neurobasal من ثقافة الخلايا العصبية.
2. بعد 48 ساعة من التحفيز باستخدام IL-2 و IL-15 (انظر الخطوات 1.14-1.15) ، أعد تعليق الخلايا القاتلة الطبيعية وأضف 10⁵ خلايا NK / بئر إلى مزرعة الخلايا العصبية (96 صفيحة سفلية مسطحة).
   ملاحظة: في المتوسط ، سيكون المحقق قادرا على ملء ~ 6 آبار لكل فأر.
3. شارك في زراعة الخلايا في MX العصبي القاعدي المكمل (37 درجة مئوية ، 48 ساعة).
4. اجمع الخلايا واغسلها باستخدام PBS (3x) وأجهزة الطرد المركزي (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية).
5. تخلص من المادة الطافية وقم بتلطيخ الخلايا باستخدام صبغة الصلاحية eFlour-780 (1:1,000 ، 15 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
6. اجمع الخلايا واغسلها باستخدام PBS (3x) وأجهزة الطرد المركزي (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية).
7. حظر المواقع غير المحددة على الخلايا باستخدام CD16 / 32 (1: 100 ، 15 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
8. اجمع الخلايا واغسلها باستخدام PBS (3x) وأجهزة الطرد المركزي (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية).
9. صبغ (15 دقيقة ، 4 درجات مئوية) الخلايا مع BV421 anti-NK-1.1 (1: 100) ، فلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) anti-NKp46 (1: 100) ، و phycoerythrin (PE) anti-GM-CSF (1: 100).
10. اجمع الخلايا واغسلها باستخدام PBS (3x) وأجهزة الطرد المركزي (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية).
11. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS (500 ميكرولتر) والنمط المناعي للخلايا القاتلة الطبيعية عن طريق قياس التدفق الخلوي¹¹. انظر الشكل 1 أ لاستراتيجية البوابات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية مغناطيسيا من خلايا الطحال في الفئران (TRPV1 wt: :D TA^{fl / wt}) وتحفيزها (48 ساعة) باستخدام IL-2 و IL-15. ثم تم استزراع الخلايا القاتلة الطبيعية بمفردها أو استزراعها مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من الخلايا العصبية المستقبلة للألم سليمة (التحكم في القمام?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وجد Davies et ^al.11 أن الخلايا العصبية المصابة تنظم RAE1. من خلال الاتصال بالخلايا الخلوية ، تمكنت خلايا NKG2D التي تعبر عن NKG من تحديد الخلايا العصبية ^{RAE1 +} والقضاء عليها ، والتي بدورها تحد من الألم المزمن¹¹. بالنظر إلى أن الخلايا القاتلة الطبيعية تعبر أيضا عن مستقب?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse CD16/32	Jackson Laboratory	Cat no: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm)	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
Collagenase IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl	Fisher Scientific	Cat no: SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit	Sigma	Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	Cat no: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46	Sigma	Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate	Sigma	Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette	Sigma	Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)	VWR	Cat no: 02-0131
Laminin	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-Glutamine	Gibco	Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF)	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal media	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin	PeproTech	Cat no: 210-15
Pestles	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biolegend	Cat no: 108732	Clone PK136
RPMI 1640 media	Biolegend	Cat no: 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat no: 505406	Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools.	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate	Biolegend	Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson