JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تسهل طريقة التنقية البيوكيميائية هذه مع التحليل البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي التوصيف القوي لنوى ألياف الأميلويد ، مما قد يسرع من تحديد الأهداف للوقاية من مرض الزهايمر.

Abstract

شوائب الألياف البروتينية هي السمات المميزة المرضية الرئيسية للأمراض العصبية التنكسية المتعددة. في المراحل المبكرة من مرض الزهايمر (AD) ، تشكل ببتيدات أميلويد بيتا بدائيات في الفضاء خارج الخلية ، والتي تعمل كبذور تنمو تدريجيا وتنضج إلى لويحات أميلويد كبيرة. على الرغم من هذا الفهم الأساسي ، فإن المعرفة الحالية ببنية ألياف الأميلويد وتكوينها وأنماط ترسبها في الدماغ محدودة. كان أحد الحواجز الرئيسية هو عدم القدرة على عزل ألياف الأميلويد عالية النقاء من مستخلصات الدماغ. وقد استخدمت في السابق أساليب تنقية التقارب والتقاط التشريح المجهري بالليزر لعزل الأميلويد ولكنها محدودة بسبب الكمية الصغيرة من المواد التي يمكن استردادها. يصف هذا البروتوكول الجديد القوي التنقية الكيميائية الحيوية لنوى لوحة الأميلويد باستخدام ذوبان كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) مع الطرد المركزي بتدرج كثافة السكروز والموجات فوق الصوتية وينتج ألياف عالية النقاء من مرضى AD وأنسجة المخ نموذج AD. يمثل التحليل البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي (MS) للمواد النقية من أسفل إلى أعلى استراتيجية قوية لتحديد جميع مكونات البروتين الأولية تقريبا من ألياف الأميلويد. كشفت الدراسات البروتينية السابقة للبروتينات في إكليل الأميلويد عن مجموعة كبيرة بشكل غير متوقع ومتنوعة وظيفيا من البروتينات. والجدير بالذكر أنه بعد تحسين استراتيجية التنقية ، تم تقليل عدد البروتينات المشاركة في التنقية بأكثر من 10 أضعاف ، مما يشير إلى النقاء العالي للمواد غير القابلة للذوبان SDS المعزولة. سمح التلطيخ السلبي والمجهر الإلكتروني المناعي الذهبي بتأكيد نقاء هذه المستحضرات. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم السمات المكانية والبيولوجية التي تسهم في ترسب هذه البروتينات إلى شوائب أميلويد. هذه الاستراتيجية التحليلية مجتمعة في وضع جيد لزيادة فهم بيولوجيا الأميلويد.

Introduction

الأميلويد هو ترتيب فوق جزيئي مستقر للغاية يوجد في مجموعة متنوعة من البروتينات ، بعضها يؤدي إلى تغيرات مرضية1. لوحظ تراكم مجاميع الأميلويد داخل أو خارج الخلايا في العديد من الأمراض العصبية التنكسية2. مجاميع الأميلويد غير متجانسة ويتم إثراؤها بعدد كبير من البروتينات والدهون3. في السنوات الأخيرة ، ولد الاهتمام ببروتينات الأميلويد اهتماما كبيرا بين علماء الأعصاب الأساسيين والانتقاليين. تم تطوير العديد من الطرق لاستخراج وتنقية مجاميع الأميلويد من أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة والفئران. التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، والترسيب المناعي ، وإزالة الخلايا ، والعزل الكيميائي الحيوي لمجاميع الأميلويد هي طرق تستخدم على نطاق واسع لاستخراج وتنقية لويحات الأميلويد والألياف والأوليغومرات4،5،6،7. وقد ركزت العديد من هذه الدراسات على تحديد تكوين البروتين لهذه الرواسب الليفية المعبأة بإحكام باستخدام مرض التصلب العصبي المتعدد شبه الكمي. ومع ذلك ، فإن النتائج المتاحة غير متسقة ، والعدد الكبير بشكل مدهش من البروتينات التي تم تنقيتها بشكل سابق والتي تم الإبلاغ عنها سابقا يصعب تفسيرها.

القيد الأساسي للأدبيات الموجودة التي تصف بروتيوم الأميلويد الأساسي في أدمغة نموذج الفئران AD و AD هو أن المادة النقية تحتوي على عدد لا يمكن التحكم فيه من البروتينات المشتركة في التنقية. الهدف العام من هذه الطريقة هو التغلب على هذا القيد وتطوير تنقية كيميائية حيوية قوية لعزل نوى ألياف الأميلويد. تستخدم هذه الاستراتيجية طريقة كيميائية حيوية قائمة على الطرد المركزي لتدرج كثافة السكروز الموصوفة سابقا لعزل أجزاء الأميلويد المخصب غير القابلة للذوبان في SDS من أنسجة المخ البشرية والفئران بعد الوفاة 8,9. تعتمد هذه الطريقة على الأدبيات الموجودة ولكنها تذهب إلى أبعد من ذلك مع الموجات فوق الصوتية وغسل SDS لإزالة معظم البروتينات المرتبطة بالأميلويد المرتبطة بشكل فضفاض ، مما يؤدي إلى عزل ألياف الأميلويد عالية النقاء (الشكل 1). تتغلب الألياف التي تم تنقيتها بواسطة هذا البروتوكول على العديد من التحديات الحالية التي كثيرا ما تواجهها الدراسات الهيكلية للألياف الأميلويد المعزولة من مستخلصات الدماغ. يؤكد تصور هذه الألياف باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) سلامة ونقاء المواد النقية (الشكل 2). في هذه الدراسة ، يتم إذابة الألياف المعزولة وهضمها إلى الببتيدات مع التربسين ، ويمكن لتحليل MS الخالي من الملصقات أن يكشف بسهولة عن هوية البروتينات التي تشكل قلب الليف. والجدير بالذكر أن بعض هذه البروتينات لديها ميل متأصل لتشكيل تجمعات فوق جزيئية في عضيات غير مرتبطة بالغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط العديد من البروتينات المحددة في تحليل ألياف أميلويد بيتا (Aβ) أيضا بأمراض تنكسية عصبية أخرى ، مما يشير إلى أن هذه البروتينات قد تلعب دورا رئيسيا في اعتلالات البروتينات المتعددة.

من غير المرجح أن تغير طريقة SDS / الموجات فوق الصوتية هذه بنية نوى الألياف أو تعطلها. المواد النقية مناسبة أيضا لمجموعة واسعة من نهج التحليل البروتيني من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى واستراتيجيات التحليل الهيكلي الإضافية القائمة على MS ، مثل الربط الكيميائي المتبادل أو تبادل الهيدروجين والديوتيريوم. الاسترداد الكلي باستخدام هذه الطريقة مرتفع نسبيا ، وبالتالي ، فهو مناسب للدراسات الهيكلية التفصيلية ، والتي تتطلب ميكروغرام إلى ملليغرام من المواد النقية. المواد النقية مناسبة أيضا للدراسات الهيكلية باستخدام cryoEM ومجهر القوة الذرية. ويمكن لهذا البروتوكول، بالاقتران مع وضع العلامات النظيرية المستقرة للثدييات، أن يسهل دراسات الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (NMR) لبنية الأميلويد10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتضمن هذا البروتوكول استخدام أنسجة المخ البشرية أو الفقارية. تم إجراء جميع الأبحاث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة لجامعة نورث وسترن. يتم توحيد سير العمل الحالي باستخدام APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F) مستخلصات دماغ الفأر القشرية ومنطقة الدماغ الحصين11. تم تحسين هذا البروتوكول لمقتطفات الدماغ من الفئران في عمر 6-9 أشهر ، ويمكنه تنقية الأميلويد بشكل فعال من الحيوانات الذكور والإناث.

ملاحظة: للحصول على فهم أفضل للإجراء التجريبي الكلي، راجع الشكل 1 للحصول على مخطط لسير العمل.

1. حصاد الأنسجة وتنقية الأميلويد

ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب عزل ألياف الأميلويد عن مناطق الدماغ التي تم تشريحها حديثا. ومع ذلك ، تعمل هذه الطريقة أيضا بشكل جيد مع أنسجة المخ المجمدة المفاجئة أو الفلاش. فيما يلي مخطط موجز لأنسجة المخ المتجمدة المفاجئة لتخزينها لاستخدامها في وقت لاحق.

  1. حصاد أنسجة المخ وتخزينها: تشريح أدمغة الفئران وحصاد المناطق المحملة بالأميلويد بسرعة (أي القشرة والحصين) ، تليها تجميد مفاجئ في النيتروجين السائل أو حمام كحول ثلجي جاف.
    ملاحظة: يساعد التجميد المفاجئة في الحفاظ على السمات الهيكلية لمكونات الأنسجة. يتم القتل الرحيم للفئران عن طريق الأيزوفلوران وخلع عنق الرحم12,13. ينصح بتجنب استخدام CO2 لأن ذلك يمكن أن يضر بسلامة بروتين الدماغ.
  2. بعد التشريح ، قم بقطع وتخزين الأنسجة الطازجة في كتل صغيرة (على سبيل المثال ، 5 مم × 5 مم) ، لأن هذا يسهل التجانس الأكثر كفاءة قبل استخراج الأميلويد. انقل الأنسجة إلى القارورة المبردة المعقمة ، وشد غطاءها ، واغمرها بسرعة.
  3. حافظ على تجميد الأنسجة في ظروف شديدة البرودة (أي -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل). إذا كان من المقرر إجراء الاستخراج بعد بضعة أيام ، فقم بتخزين الأنسجة عند -20 درجة مئوية وتجنب دورات التجميد والذوبان. قم بإذابة الأنسجة المجمدة على الثلج الرطب عندما تكون جاهزة للاستخراج والتنقية.
    ملاحظة: الاتصال المباشر للأنسجة بالنيتروجين السائل يمكن أن يسبب تلف الأنسجة والبروتين. لاحظ أن حمام الكحول يمكن أن يزيل العلامات الدائمة من ملصقات الأنبوب.

2. إثراء المواد غير القابلة للذوبان SDS

ملاحظة: نفذ جميع الخطوات على الجليد وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية، ما لم ينص على خلاف ذلك. يتم توفير تفاصيل جميع المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول في الملف التكميلي 1. يتم توفير الشركات المصنعة وأرقام كتالوج المواد الكيميائية والأدوات في جدول المواد.

  1. ابدأ بمناطق أنسجة المخ المشوهة حديثا أو المجمدة (المذابة على الجليد) الموضوعة في أنبوب سعة 2 مل يحتوي على 6-8 حبات خزفية ومخزن مؤقت للتجانس على الجليد البارد (1 مل ل 0.25-1 جم من كتلة الأنسجة الرطبة).
  2. انقل الأنابيب إلى مجانس مطحنة الخرز وطحن محتويات الأنسجة عند 4000 دورة في الدقيقة ، مع دورتين مدة كل منهما 30 ثانية وفاصل زمني قدره 30 ثانية بينهما.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام أنظمة التقليب أو المجانس الآلية لطحن الأنسجة وتجانسها.
  3. أضف 9 مل من المخزن المؤقت للتجانس البارد إلى 1 مل من أنسجة المخ الكاملة المتجانسة في أنابيب 15 مل ، وختم بشرائط فيلم الشمع المختبري ، وقم بالتدوير من طرف إلى طرف بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية لضمان ذوبان قوي.
    ملاحظة: لإزالة الحطام الخلوي الكبير والدهون غير المرغوب فيها ، في صباح اليوم التالي ، قم بتدوير الأنابيب عند 800 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وجمع supernatant في أنبوب جديد. أعد تعليق الكريات المتبقية في 2 مل من المخزن المؤقت للتجانس على الجليد البارد ، واخلطها جيدا ، وتدور مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وامزج بين الخارقين.
  4. أضف السكروز الصلب ببطء إلى تعليق مستخلص الأنسجة إلى تركيز نهائي يبلغ 1.2 متر ، واخلطه جيدا ، وجهاز طرد مركزي عند 250000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant باستخدام ماصة. أعد تعليق الكريات في 2 مل من العازلة للتجانس التي تحتوي على 1.9 متر من السكروز عن طريق المثلثات ، تليها الطرد المركزي عند 125000 × g لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن ضبط حجم المخزن المؤقت استنادا إلى كمية المواد المستردة من الخطوة السابقة. بشكل عام ، يعد 10 مجلدات من المخزن المؤقت للتجانس (V / V) مثاليا لهذه الخطوة.
  6. اجمع الطبقة الصلبة البيضاء العليا باستخدام ماصة ، وانقلها إلى أنبوب جديد ، وقم بالذوبان في 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل البارد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات ، دون إدخال فقاعات الهواء.
  7. بصرف النظر عن الطبقة العليا ، يتم إثراء الكريات أيضا بألياف الأميلويد. للحصول على عائد أعلى ، اجمع بين الكسرين وتابع. قم بإزالة الطبقة المائية الوسطى بعناية باستخدام ماصة وتخلص منها.
  8. الطرد المركزي للكسور مجتمعة عند 8000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  9. أضف 1 مل من عازل الهضم البارد إلى الكريات المغسولة ، وقم بالإنعاش ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 ساعات.
  10. جهاز طرد مركزي عند 8000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant باستخدام ماصة.
  11. أعد تعليق وغسل (نفس الخطوة 2.8) الكريات المهضومة مرتين في 1 مل من المخزن المؤقت Tris البارد المثلج.
  12. أعد تعليق الكريات المغسولة في 1 مل من المخزن المؤقت للذوبان الذي يحتوي على 1٪ SDS و 1.3 M sucrose عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. جهاز طرد مركزي بسرعة 200,000 × g لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: على الرغم من أن ألياف الأميلويد مقاومة للغاية للمنظفات والمستنشقات ، إلا أن التعرض الطويل جدا للمنظفات (1٪ SDS) قد يؤثر على سلامة الألياف أو يزيل البروتينات المرتبطة بإحكام ، مما سيضر بالتحليلات اللاحقة. لذلك ، مباشرة بعد تعليق الكريات ، انتقل إلى الطرد المركزي.
  13. احفظ الكريات وقم بزيادة حجم المادة الفائقة المتبقية عن طريق إضافة مخزن مؤقت Tris 50 mM (بنسبة 1: 0.3) لتقليل تركيز السكروز من 1.3 إلى 1 M وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 200000 × g لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  14. قم بإذابة الكريتين في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris الذي يحتوي على 0.5٪ SDS وتجمع لتنقية الأميلويد. الكريات المرئية صغيرة ويجب أن تظهر معتمة وغير بيضاء (انظر الشكل 2 أ).

3. تنقية الأميلويد

ملاحظة: الجمع بين الكريتين ، وتذوب عن طريق السحب حتى الحصول على حل موحد والمضي قدما في الخطوات التالية لتنقية الأميلويد.

  1. للذوبان الكامل للمواد الغنية بالأميلويد الموجودة في الكريات ، قم بإخضاع الأنبوب للقص الميكانيكي الناتج عن الموجات فوق الصوتية في جهاز صوتنة الحمام الذي يعمل لمدة 30 ثانية ON و 30 s OFF بتردد متوسط المدى لمدة 20 دورة.
  2. قم على الفور بالطرد المركزي للمادة عند 20000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وأعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من 0.5٪ SDS Tris buffer.
  3. كرر الخطوة 3.1. والخطوة 3.2. أربع مرات لما مجموعه خمس غسلات. يمكن زيادة عدد الغسلات لتحسين النقاء.
    ملاحظة: يتم تحسين خطوات الصوتنة والغسيل بنسبة 0.5٪ SDS حيث قد تؤثر التركيزات العالية على بنية الألياف أو سلامتها أو تكوينها البروتيني. لا ينصح بزيادة تركيز SDS في هذه الخطوة.
  4. بعد خطوة الطرد المركزي النهائية ، اغسل الكريات في 200 ميكرولتر من الماء فائق النقاء وأجهزة الطرد المركزي عند 20000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة أي منظف متبقي. تبدو الكريات المغسولة التي تحتوي على ألياف أميلويد نقية شبه شفافة في اللون ويصعب رؤيتها في بعض الأحيان.
  5. قم بإذابة الكريات النهائية التي تحتوي على ألياف أميلويد النقية في 100 ميكرولتر من الماء فائق النقاء. انتقل إلى الخطوة التالية على الفور للمعالجة النهائية أو احفظ تعليق الألياف عند -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل. إذا تم تجميده ، فقم بإذابته على الجليد قبل البدء في هطول الأمطار.

4. هطول الأمطار كلوروفورم الميثانول

ملاحظة: إذا كان الهدف النهائي هو إجراء تحليل البروتين ، فمن المستحسن إزالة الملح وإزالة الشوائب الإضافية غير البروتينية.

  1. أضف 400 ميكرولتر من الميثانول إلى 100 ميكرولتر من ألياف الأميلويد النقية في أنبوب 1.5 مل وبئر دوامة.
  2. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الأنبوب والدوامة جيدا.
  3. أضف 300 ميكرولتر من الماء فائق النقاء والدوامة جيدا. هذا يحول الخليط إلى غائم بسبب هطول الأمطار البروتينية.
  4. جهاز طرد مركزي عند 12000 × g لمدة 2 دقيقة في RT.
  5. قم بإزالة الطبقة المائية بعناية (أي الأعلى) دون إزعاج طبقة الواجهة التي تحتوي على رقائق البروتين.
  6. أضف نفس الحجم من الميثانول مرة أخرى وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 × g لمدة دقيقتين في RT.
  7. تخلص من المادة الفائقة باستخدام ماصة وجفف الكريات في الهواء في RT. تجنب الإفراط في التجفيف. من الصعب إعادة إذابة جزء الأميلويد إذا تم تجفيفه بشكل مفرط.

5. هضم التربسين

  1. قم بإذابة الكريات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهيدروكلوريد جوانيدين (GuHCl). سونيك في حمام مائي بارد والحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، إذا لزم الأمر.
  2. دوامة تماما في RT لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة لإذابتها تماما. لن تكون الكريات مرئية بعد هذه الخطوة ، ويبدو الحل واضحا في المظهر.
  3. أضف نفس الحجم من محلول الفاعل بالسطح بنسبة 0.2٪. قابل للذوبان في RT مع دوامة لمدة 60 دقيقة. هذه الخطوة تعزز النشاط الأنزيمي التربسين.
  4. أضف 1 ميكرولتر من tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) من محلول المخزون 500 mM. احتضان لمدة 60 دقيقة.
  5. أضف 2 ميكرولتر من يودواسيتاميد 500 مللي متر (IAA) واحتضنه في الظلام لمدة 20 دقيقة.
  6. قم بإخماد IAA باستخدام 5 ميكرولتر من محلول TCEP لمدة 15 دقيقة.
  7. أضف الحجم المطلوب من محلول بيكربونات الأمونيوم 50 mM إلى الأنبوب لتقليل تركيز guanidine إلى 1.5 m.
  8. أضف محلول الفاعل بالسطح بنسبة 1٪ إلى الأنبوب (1 ميكرولتر / 50 ميكروغرام من البروتين).
  9. أضف التربسين (1 ميكروغرام / 100 ميكروغرام من البروتين) واترك الأنبوب يختلط عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

6. تنظيف الببتيد

  1. في صباح اليوم التالي ، قم بتحمض محلول الببتيد المهضوم عن طريق خفض درجة الحموضة إلى 2.0 عن طريق إضافة حمض الفورميك.
  2. قم بتنشيط عمود الدوران C18 (n-octadecyl) في أنبوب استقبال 2 مل عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول الميثانول بنسبة 50٪ والدوران عند 1500 × g لمدة دقيقتين في RT. كرر خطوة التنشيط.
  3. قم بموازنة أسرة راتنج العمود C18 عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوازن والدوران لمدة دقيقتين بنفس الشروط. كرر هذه الخطوة.
  4. قم بتحميل محلول الببتيد المحمض على عمود C18 وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × g لمدة 2 دقيقة في RT. اجمع التدفق وإعادة تحميله مرة أخرى. تجاهل التدفق الثاني.
  5. اغسل الببتيدات المرتبطة براتنج C18 باستخدام مخزن الغسيل المؤقت 2x ، كما هو الحال في الخطوة 6.3. استخدم نفس المخزن المؤقت للتوازن لغسل العمود.
  6. قم بالتخلص من الببتيدات عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإزالة متبوعا بالطرد المركزي عند 1500 × g ، لمدة 2 دقيقة في RT. كرر خطوة الاستخلاص ثلاث مرات لزيادة إنتاجية الببتيدات المستردة.
  7. جفف الببتيدات في مكثف فراغ السرعة عن طريق تبخير المحلول المائي. يمكن حفظ الكريات الجافة عند -20 درجة مئوية لبضعة أسابيع قبل تحليل التصلب المتعدد.

7. إعداد مطياف الكتلة لتحليل الببتيد

ملاحظة: للاطلاع على معلمات MS، راجع الملف التكميلي 1 (مقتبس من منشور سابق من المختبر)14.

  1. قبل تحميل عينات الببتيد لتحليل MS ، قم بإذابة كريات الببتيد الجافة في 20 ميكرولتر من مخزن تحميل العينات المخزن المؤقت وإجراء BCA الصغير لتحديد تركيز الببتيدات المستردة.
  2. انقل الببتيدات الذائبة في قارورة زجاجية وقم بتحميل 3 ميكروغرام (تم تحديدها كميا من BCA الصغير) من الببتيدات إلى جهاز أخذ العينات التلقائي لنظام UPLC.
  3. قم بتحميل العينات على عمود مصيدة مهواة (عمود C18 HPLC، 0.075 مم × 20 مم) بمعدل تدفق يبلغ 250 نانولتر/دقيقة.
  4. رتب عمود الملائمة بما يتماشى مع عمود تحليلي (0.075 ميكرومتر × 500 مم) وقم بتجميع طرف باعث إلى مصدر تأين الرش الكهربائي (ESI) الخاضع لجهد رش يبلغ 2000 فولت.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم إجراء ESI ، حيث يخضع الطور المحمول لتأين عالي الجهد في مرحلة الغاز. يتم توجيه الرذاذ الناتج عن هذا إلى غرفة الفراغ في MS من خلال الشعيرات الدموية الساخنة. أثناء الفراغ ، يحدث ذوبان القطرات وطرد الأيونات في وجود الحرارة والجهد. بعد ذلك ، يتم تسريع الأيونات نحو محلل الكتلة في وجود بيئة عالية الجهد.
  5. تحليل العينات مع 2 ساعة تشغيل الاستحواذ. يتم إجراء هذه الدراسة باستخدام الاكتساب المعتمد على البيانات مع نموذج اختيار أيون السلائف الأكثر كثافة 20.
    ملاحظة: في الاكتساب المعتمد على البيانات، يتم الكشف عن عدد محدود من ببتيدات السلائف في فحص MS1 وإخضاعها للتجزئة لتحليل MS2. ومع ذلك ، فإن الاستبعاد الديناميكي يمثل مشكلة هنا لأن الببتيدات Aβ الوفيرة للغاية سيتم حذفها للتجزئة وتؤدي إلى التقليل من كميتها.
  6. للقياس الكمي المطلق لببتيدات Aβ ، قم بتشغيل نفس العينات مرة أخرى باستخدام طريقة MS / MS المستهدفة. بالنسبة لهذه الدراسة ، تم إعداد قائمة شاملة بجميع نسب m / z لمختلف الببتيدات Aβ التريبتية المحتملة لنماذج الماوس APP (انظر الجدول التكميلي 1). يجب على المجموعات الأخرى إعداد قائمة مماثلة وفقا لنموذج الماوس المتاح والببتيدات المحتملة الناتجة عن البروتين محل الاهتمام (على سبيل المثال ، Aβ for AD).
    ملاحظة: لمعالجة استبعاد الببتيدات عالية الوفرة، استخدم نهجا مستهدفا من خلال توفير قائمة بقيم m/z المختارة المقابلة للببتيدات التربتيكية Aβ. يعالج هذا النهج مشكلة الاستبعاد المعتمد على البيانات لببتيدات Aβ ويمكنه تحديد الكميات المطلقة للمونومرات المختلفة (Aβ38 و 40 و 42 الببتيدات) بدقة عالية.
  7. يولد مطياف الكتلة أطياف MS لعينات الببتيد ويحفظ ملفات البيانات الخام في الدليل المستهدف. استخدم هذا الملف لإجراء المطابقة الطيفية باستخدام أدوات إحصائية ومعلوماتية حيوية راسخة. تتوفر العديد من أدوات البحث والتحليل في قاعدة البيانات عبر الإنترنت وغير المتصلة بالإنترنت.

8. تحليل بيانات التصلب المتعدد

  1. استخراج ملفات MS1 و MS2 باستخدام أداة Rawconverter دون اتصال (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
  2. إجراء تحديد وقياس كمي وتحليلات مفصلة للبيانات على محرك بحث بيانات MS على شبكة الإنترنت. في هذه الدراسة ، تم استخدام خط أنابيب البروتينات المتكامل - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
    ملاحظة: تتوفر العديد من أدوات تحليل بيانات MS الأخرى عبر الإنترنت وغير المتصلة ويمكن استخدامها أيضا ، مثل MaxQuant (https://www.maxquant.org/).
  3. بعد تحميل ملفات MS1 وMS2، حدد قاعدة بيانات بروتينات الماوس محدثة. هنا ، يتم اختيار قاعدة بيانات ماوس محدثة تحتوي على طفرات إضافية محددة للتطبيق لتحديد الببتيدات باستخدام خوارزميات ProLuCId و SEQUEST11.
  4. في نظام تحليل IP2 ، حدد المعلمات الافتراضية وقم بتعديلها وفقا للمتطلبات التجريبية. في هذه الدراسة ، يتم استخدام تحمل كتلة الببتيد من 50 جزء في المليون للسلائف و 600 جزء في المليون للشظايا (راجع الملف التكميلي 1 للحصول على معلمات أخرى مستخدمة في IP2).
    ملاحظة: يمكن للباحثين تعديل معلمات البحث وفقا للأهداف التجريبية. على سبيل المثال ، لتحديد التعديلات اللاحقة للترجمة ، أضف قيم تعديل تفاضلية لمختلف PTMs (على سبيل المثال ، الانتشار في كل مكان ، SUMOylation ، الفسفرة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

هنا ، يتم تلخيص طريقة مفصلة لعزل وتنقية ألياف الأميلويد باستخدام طريقة تنقية الطرد المركزي المعدلة لتدرج كثافة السكروز (انظر الشكل 1). الابتكار في هذه الطريقة هو تضمين خطوات الغسيل القائم على الموجات فوق الصوتية باستخدام نظام صوتنة الحمام المائي متبوعا بذوبان SDS ، والذي يز...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يعد تطوير فهم واضح لبنية الأميلويد وتكوينه تحديا لعلماء الأحياء الهيكلية وعلماء الكيمياء الحيوية بسبب التعقيدات البيولوجية والقيود التجريبية في استخراج الألياف النقية من أنسجة المخ AD16,17. ألياف الأميلويد متعددة الأشكال على المستوى الجزيئي ، وتظهر مجموعة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01AG061865 إلى R.J.V. و J.N.S. يشكر المؤلفون أعضاء مجموعة أبحاث فاسار وسافاس في جامعة نورث وسترن على مناقشاتهم المدروسة. كما نتقدم بخالص الشكر للدكتور (الدكتورين). أنسجار سايمر ورالف لانغن من جامعة جنوب كاليفورنيا لمدخلاتهما الحاسمة. نشكر الدكتورة فريدة كورابوفا على إعداد العينات والتصوير المجهري الإلكتروني السلبي في مركز جامعة نورث وسترن للفحص المجهري المتقدم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mmThermo Scientific164535Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibodyBiolegend803001
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibodyBiolegend800701
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibodyIBL America10323
anti-amyloid fibril LOC antibody EMD MilliporeAB2287
BCA kitThermo Fisher Scientific23225
Bioruptor Pico PlusDiagenodeB01020001
Calcium ChlorideSigma-Aldrich C1016
CollagenaseSigma-AldrichC0130
Complete  Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich11697498001
Dnase IThermo Fisher ScientificEN0521
EDTASigma-AldrichEDS
Guanidine hydrochlorideSigma-AldrichG4505
HyperSep C18 CartridgesThermo Fisher Scientific60108-302
Integrated Proteomics Pipeline - IP2 http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI1149
K54 Tissue Homogenizing System MotorCole ParmerGlas-Col 099C
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/
Micro BCA kitThermo Fisher Scientific23235
Nanoviper 75 μm x 50 cmThermo Scientific164942
Optima L-90K UltracentrifugeBeckman CoulterBR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass SpectrometerThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin ColumnsThermo Fisher Scientific89870
Precellys 24 tissue homogenizerBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin EnhancerPromegaV2072
RawConverterhttp://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Sodium azideVWR97064-646
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich74255
Sorvall Legend Micro 21R MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002446
Speed Vaccum ConcentratorLabconco7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Tris-HClThermo Fisher Scientific15568025
Trypsin Gold-Mass spec gradePromegaV5280
UltiMate 3000 RSLCnano SystemThermo ScientificULTIM3000RSLCNANO

References

  1. Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
  2. Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
  3. Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
  4. Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433(2014).
  5. Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
  6. Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
  7. Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
  8. Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
  9. Lu, J. -X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
  10. Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
  11. Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
  12. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  14. Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
  15. Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739(2021).
  16. Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
  17. Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574(2021).
  18. Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
  19. Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
  20. Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699(2018).
  21. Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
  22. Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591(2022).
  23. Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
  24. Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
  25. Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
  26. Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
  27. Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193(2018).
  28. Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
  29. Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
  30. Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
  31. Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
  32. Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
  33. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  34. Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved