JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه الدراسة تنقية KIF1A (1-393LZ) ، وهو عضو في عائلة kinesin-3 ، باستخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9. أظهر تحليل الانزلاق أحادي الجزيء ومتعدد المحركات في المختبر لهذه المحركات المنقاة خصائص حركية قوية مماثلة للمحركات من محللة خلايا الثدييات. وبالتالي ، فإن نظام Sf9-baculovirus قابل للتعبير عن البروتين الحركي ذي الأهمية وتنقيته.

Abstract

تشكل البيئة الخلوية المعقدة تحديات لتحليل حركية الجزيء الواحد. ومع ذلك ، فقد أدى التقدم في تقنيات التصوير إلى تحسين دراسات الجزيء الواحد واكتسب شعبية هائلة في اكتشاف وفهم السلوك الديناميكي للجزيئات الموسومة بالفلورسنت. هنا ، نصف طريقة مفصلة للدراسات أحادية الجزيء في المختبر لمحركات عائلة kinesin-3 باستخدام الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF). Kinesin-3 هي عائلة كبيرة تلعب أدوارا حاسمة في الوظائف الخلوية والفسيولوجية التي تتراوح من نقل البضائع داخل الخلايا إلى انقسام الخلايا إلى التنمية. لقد أظهرنا سابقا أن محركات ثنائي الحركة 3 النشطة بشكل أساسي تظهر حركية سريعة وفائقة المعالجة مع تقارب عالي للأنابيب الدقيقة على مستوى الجزيء الواحد باستخدام محللات الخلايا المحضرة عن طريق التعبير عن المحرك في خلايا الثدييات. يدرس مختبرنا محركات kinesin-3 وآلياتها التنظيمية باستخدام الأساليب الخلوية والكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية ، وتتطلب مثل هذه الدراسات بروتينات نقية على نطاق واسع. سيكون التعبير عن هذه المحركات وتنقيتها باستخدام خلايا الثدييات مكلفا ويستغرق وقتا طويلا ، في حين أن التعبير في نظام التعبير بدائي النواة أدى إلى بروتين مجمع وغير نشط بشكل كبير. للتغلب على القيود التي تفرضها أنظمة تنقية البكتيريا وتحلل خلايا الثدييات ، أنشأنا نظام تعبير قوي عن فيروس Sf9-baculovirus للتعبير عن هذه المحركات وتنقيتها. محركات kinesin-3 موسومة بشكل نهائي C ببروتينات فلورية ترادفية ثلاثية (3xmCitirine أو 3xmCit) توفر إشارات محسنة وتقلل من التبييض الضوئي. في المختبر ، يوضح تحليل الانزلاق أحادي الجزيء ومتعدد المحركات للبروتينات المنقاة Sf9 أن محركات kinesin-3 سريعة وفائقة المعالجة تشبه دراساتنا السابقة باستخدام تحلل خلايا الثدييات. تشمل التطبيقات الأخرى التي تستخدم هذه المقايسات المعرفة التفصيلية لظروف oligomer للمحركات ، وشركاء الربط المحددين الموازين للدراسات الكيميائية الحيوية ، وحالتهم الحركية.

Introduction

تشكل بيئة الخلية المزدحمة للغاية العديد من التحديات في فرز البروتينات والجزيئات المتجهة. يتم تسهيل عبء العمل المكثف للتنظيم والتوزيع الزماني المكاني للجزيئات داخل السيتوبلازم بواسطة المحركات الجزيئية والمسارات الهيكلية الخلوية. المحركات الجزيئية هي الإنزيمات التي تحلل عملات الطاقة مثل ATP وتستخدم تلك الطاقة أثناء الحركة وتوليد القوة1. بناء على تشابه تسلسل الأحماض الأمينية ، يتم تجميع الكينيسين في 14 عائلة وعلى الرغم من هذا التشابه ، يساهم كل محرك بشكل فريد في عمل الخلية. تشكل محركات عائلة Kinesin-3 واحدة من أكبر المحركات ، وتضم خمس عائلات فرعية (KIF1 و KIF13 و KIF14 و KIF16 و KIF28) 2 ، المرتبطة بوظائف خلوية وفسيولوجية متنوعة ، بما في ذلك نقل الحويصلة ، والإشارات ، والانقسام ، والهجرة النووية ، والتنمية 3،4،5. ضعف في وظيفة النقل kinesin-3 متورط في العديد من الاضطرابات التنكسية العصبية ، وعيوب النمو ، وأمراض السرطان6،7،8،9.

أظهرت الأعمال الحديثة أن محركات kinesin-3 هي مونومرات ولكنها تخضع للتثبيط الناجم عن البضائع وتؤدي إلى حركة سريعة وفائقة المعالجة مقارنة بالكينيسينالتقليدي 10،11،12،13. يحتاج توصيفها البيوكيميائي والفيزيائي الحيوي إلى كمية كبيرة من البروتينات النقية النشطة. ومع ذلك ، أدى إنتاجها في نظام التعبير بدائي النواة إلى محركات غير نشطة أو مجمعة ، على الأرجح بسبب تخليق البروتين غير المتوافق ، وآلات الطي والتعديل14،15،16،17،18. للتحايل على هذه القيود وزيادة العائد ، أنشأنا هنا نظام تعبير قوي عن فيروس Sf9-baculovirus للتعبير عن هذه المحركات وتنقيتها.

يستخدم نظام تعبير الفيروس البقعي خطوط خلايا الحشرات Sf9 كنظام مضيف لتعبير البروتين المؤتلف حقيقي النواة عالي الإنتاجية19,20. يمتلك Baculovirus محفزا قويا متعدد السطوح يساعد في التعبير الجيني غير المتجانس وإنتاج البروتينات المؤتلفة القابلة للذوبان17. نظرا لفعاليتها من حيث التكلفة وآمنة في التعامل معها وكمية عالية من تعبير البروتين النشط ، فقد أصبحت أداة قوية21. للتعبير عن البروتين محل الاهتمام ، تتمثل الخطوة الرئيسية في توليد باكميد مؤتلف. نظرا لأن مجموعات توليد bacmid المتاحة تجاريا باهظة الثمن وسنعمل مع المزيد من العينات ، فقد طورنا بروتوكولا داخليا لكل من الإدخالات الكبيرة والصغيرة لمحركات kinesin-3 في bacmids. تم استخدام محركات kinesin-3 المنقى Sf9 لتوصيف خصائص انزلاق الأنابيب الدقيقة أحادية الجزيء ومتعددة المحركات في المختبر باستخدام الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF). يتم تمييز المحركات بشكل نهائي C بجزيئات فلورية ترادفية ثلاثية (3xmCit) لتوفير إشارة محسنة وتقليل التبييض الضوئي. نظرا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، والسمية الضوئية الأقل ، والتصوير الانتقائي لمنطقة صغيرة جدا بالقرب من الغطاء ، فقد تم استخدام تصوير TIRF على نطاق واسع لتصور ديناميكيات البروتين على مستوى الجزيء الواحد في الجسم الحي وفي المختبر.

تناقش هذه الدراسة تنقية محركات kinesin-3 من خلال استخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9 والتصوير أحادي الجزيء في المختبر وتحليل الانزلاق متعدد المحركات باستخدام الفحص المجهري TIRF. إجمالا ، تظهر هذه الدراسة أن خصائص الحركة للمحركات المنقاة Sf9 متطابقة مع خصائص المحركات المحضرة من محللات خلايا الثدييات. ومن ثم ، نعتقد أنه يمكن تكييف نظام Sf9-baculovirus للتعبير عن أي بروتين حركي مهم وتنقيته.

Protocol

1. ثقافة Sf9 ، والنقل ، وتوليد الفيروسات

ملاحظة: حافظ على خلايا Sf9 في 30 مل من وسط Sf-900 / SFM في دورق مخروطي معقم 100 مل يمكن التخلص منه بدون أي مضاد حيوي / مضاد حيوي عند 28 درجة مئوية. حافظ على ثقافة التعليق في شاكر مداري عند 90 دورة في الدقيقة. توريد CO2 وصيانة الرطوبة غير مطلوب. عادة ما يتم زراعة الخلايا كل يوم رابع عن طريق تلقيح 0.5 × 106 خلايا / مل للوصول إلى كثافة 2.0 × 106 خلايا / مل في اليوم الرابع.

  1. توليد مخزون فيروس P0
    1. لنقل الخلايا ، خلايا البذور في طبق 35 ملم مع التقاء 4.5 × 105 خلايا / مل والحفاظ عليها عند 28 درجة مئوية دون اهتزاز.
    2. بعد 24 ساعة ، بمجرد أن تعلق الخلايا وتبدو صحية ، تابع النقل كما هو موضح أدناه.
      1. الأنبوب أ: امزج 1 ميكروغرام من ترميز الحمض النووي bacmid لمحرك kinesin-3 الخاص ب KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG مع 100 ميكرولتر من وسائط Grace غير المكملة.
      2. الأنبوب B: امزج 6 ميكرولتر من كاشف النقل مع 100 ميكرولتر من وسائط جريس غير المكملة.
      3. انقل محتوى الأنبوب A بعناية إلى الأنبوب B واخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل (حوالي 20 مرة).
      4. احتضان الخليط لمدة ~ 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. بعد الانتهاء من الحضانة ، أضف 0.8 مل من وسائط جريس غير المكملة إلى الخليط أعلاه واخلطها ببطء عن طريق السحب.
    4. قم بشفط وسائط Sf-900 / SFM برفق من الخلايا (لإزالة أي آثار للمصل قد تؤثر على كفاءة النقل).
    5. أضف خليط النقل من الخطوة 1.1.3 قطرة قطرة على الجزء العلوي من الخلايا واحتضان اللوحة لمدة 6 ساعات عند 28 درجة مئوية.
    6. بعد الحضانة ، قم بإزالة خليط النقل بعناية ، وأضف 2 مل من وسائط Sf-900 / SFM واحتضانها لمدة 48 ساعة عند 28 درجة مئوية.
    7. تحقق من تعبير البروتين الحركي تحت مجهر مضان مقلوب. يتم تمييز البروتين الحركي ببروتين الفلورسنت ، mCitrine ، وهو نوع من بروتين الفلورسنت الأصفر.
      ملاحظة: تم تصور الخلايا المنقولة تحت مجهر مقلوب مزود بتباين التداخل التفاضلي (DIC) وإضاءة فوق التألق مع هدف 20x (تكبير 200 مرة) ومصباح زئبقي وكاميرا EM-CCD. تحقق من كفاءة توليد الفيروس والعدوى من خلال مراقبة تعبير المحركات الموسومة بالسيترين في الخلايا من خلال إثارة mCitrine ومكعب مرشح الانبعاثات. بالإضافة إلى ذلك ، تحقق من التغيرات المورفولوجية للخلايا المصابة ، مثل الخلايا / النوى المتضخمة (الشكل 1A-C).
    8. مرة أخرى ، تحقق من الخلايا بعد 72 ساعة من الإصابة. عادة ، تبدأ الخلايا في الانفصال عن السطح (الشكل 2).
    9. إذا انفصلت >5٪ من الخلايا عن السطح ، فقم بحصاد الوسائط المصابة بالخلايا المصابة في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 1.5 مل وتدور لمدة 5 دقائق عند 500 × جم.
    10. اجمع حصص التجميد الطافي والمفاجئة البالغة 1 مل في النيتروجين السائل وقم بتخزينها كمخزون P0 عند -80 درجة مئوية أو استخدمها لتوليد مخزون فيروس P1.
  2. توليد مخزون فيروس P1
    1. لزيادة تضخيم مخزون الفيروس البقعي P0 وتأكيد تعبير البروتين ، قم بزراعة خلايا Sf9 في ثقافة التعليق السائل.
    2. في دورق مخروطي معقم سعة 100 مل ، أضف 10 مل من وسائط Sf-900 / SFM بكثافة خلية تبلغ 2 × 106 خلايا / مل و 1 مل من مخزون فيروس P0. احتضان عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 90 دورة في الدقيقة.
    3. بعد 72 ساعة من الإصابة، تحقق من تعبير البروتين كما هو موضح سابقا (الخطوة 1.1.7). إذا كان تعبير البروتين جيدا (>90٪ من الخلايا تظهر إشارة مضان mCitrine ساطعة) ويظهر موتا كبيرا للخلايا (حوالي 10٪ -15٪) ، فقم بتدوير الخلايا في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. اجمع القسمة الطافية المتجمدة المفاجئة من 1 مل (مخزون P1) في النيتروجين السائل وخزنها في -80 درجة مئوية أو تابع العدوى على نطاق واسع وتنقية البروتين.
  3. عدوى واسعة النطاق
    1. للتعبير البروتيني على نطاق واسع ، تصيب 30 مل من مزرعة التعليق بكثافة 2 × 106 خلايا / مل مع 1 مل من مخزون فيروس P1 واحتضانها عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 90 دورة في الدقيقة.
    2. بعد ~ 72 ساعة بعد الإصابة ، تحقق من تعبير البروتين (بشكل عام ، يتم تحقيق أقصى تعبير للبروتين بين 65-75 ساعة بعد الإصابة).
    3. إذا أظهرت >90٪ من الخلايا إشارة فلورية ساطعة مع الحد الأدنى من موت الخلايا (<5٪) ، فقم بجمع الخلايا في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل وقم بالدوران لأسفل عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك حد أدنى من موت الخلايا (<5٪) ، لأن الخلايا الميتة تطلق المحتويات الخلوية في الوسائط ، مما يؤدي إلى فقدان البروتين المعبر عنه.
    4. تخلص من المادة الطافية ، واجمع حبيبات الخلية ، واستمر في تنقية البروتين.

2. تنقية Sf9 لمحركات kinesin-3

  1. إلى حبيبات الخلية أعلاه ، أضف 3 مل من محلول تحلل الجليد البارد (الجدول التكميلي 1) مستكمل حديثا ب 5 mM DTT ، و 5 ميكروغرام / مل من الأبروتينين ، و 5 ميكروغرام / مل من الليوبتين ، و 5 ميكروغرام / مل من PMSF وقم بتحليل الخلايا عن طريق السحب 20-25 مرة دون توليد أي فقاعات هواء. لجميع التركيبات والكواشف العازلة ، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 1.
  2. قم بتدوير محللة الخلية عند 150000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. اجمع المادة الطافية في أنبوب طازج ومعقم واخلطها مع ~ 40 ميكرولتر من راتنج التقارب M2 المضاد ل FLAG بنسبة 50٪. احتضن الخليط لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية مع التقليب من طرف إلى طرف.
  4. بعد الحضانة, بيليه راتنج FLAG عن طريق الغزل عند 500 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استنشاق الطافت برفق دون إزعاج الحبيبات بإبرة 26 جم والتخلص منها.
  5. اغسل حبيبات راتنج FLAG ثلاث مرات باستخدام محلول غسيل مثلج بارد (الجدول التكميلي 1) مكمل حديثا ب 2 mM DTT ، و 5 ميكروغرام / مل من الأبروتينين ، و 5 ميكروغرام / مل من الليوبتين ، و 5 ميكروغرام / مل من PMSF. حبيبات الخرز عن طريق الغزل في 500 × غرام لمدة 1 دقيقة عند 4 °C في كل غسلة.
  6. بعد الغسيل الثالث ، قم بتصريف المخزن المؤقت للغسيل بعناية قدر الإمكان دون إزعاج الحبيبات. لشطف البروتين ، أضف ~ 70 ميكرولتر من محلول الغسيل الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من ببتيد FLAG إلى حبيبات الراتنج واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هبوط من طرف إلى طرف.
  7. في اليوم التالي ، قم بتدوير الراتنج عند 500 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على البروتين المنقى في أنبوب طازج واستكمل بنسبة 10٪ من الجلسرين. التقط حصص تجميد 5 ميكرولتر في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  8. قم بتشغيل جل SDS-PAGE لتحديد تركيز البروتين وإنتاجيته. جنبا إلى جنب مع البروتين المنقى من الفائدة ، يتم تحميل عنصر تحكم البروتين القياسي ، BSA بتركيزات معروفة تتراوح من 0.2 ميكروغرام ، 0.4 ميكروغرام ، 0.6 ميكروغرام ، 0.8 ميكروغرام ، و 1 ميكروغرام لتوليد منحنى قياسي. وصمة عار الجل مع Coomassie بريليانت الأزرق (الشكل 3).
  9. قم بتحليل الجل باستخدام أداة قياس كمية الجل المدمجة في برنامج ImageJ. أولا ، قم بقياس شدة النطاق للتركيزات المعروفة ل BSA وإنشاء المنحنى القياسي. بعد ذلك ، قم بقياس شدة شريط البروتين المنقى وتحديد تركيز البروتين. للقيام بذلك ، افتح برنامج Image J ، وانقر فوق خيار التحليل في شريط القائمة وحدد Gels في القائمة المنسدلة.

3. مقايسة حركية الجزيء الواحد في المختبر باستخدام محركات kinesin-3 المنقى Sf9

ملاحظة: يمكن استخدام محركات kinesin-3 المنقى Sf9 لدراسة الخصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية مثل معدل دوران ATP ، وتقارب الأنابيب الدقيقة ، والسرعة ، وطول التشغيل ، وحجم الخطوة ، وتوليد القوة. هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لتحليل حركية الجزيء الواحد في المختبر ل KIF1A (1-393LZ) باستخدام الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF). لجميع مكونات المخازن المؤقتة والكواشف ، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 1.

  1. بلمرة الأنابيب الدقيقة
    1. في أنبوب طرد مركزي دقيق 0.5 مل مبرد مسبقا ، قم بإعداد مزيج بلمرة عن طريق السحب بالترتيب التالي: 12.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت BRB80 ، درجة الحموضة 6.9 ؛ 0.45 ميكرولتر من 100 mM MgCl2 ، 1 ميكرولتر من 25 mM GTP.
    2. أخرج حصة 10 ميكرولتر من 10 مجم / مل توبولين مخزن في النيتروجين السائل ، وقم بإذابة الثلج على الفور ، وأضفه إلى خليط البلمرة أعلاه. تخلط بلطف عن طريق سحب 2-3 مرات دون خلق أي فقاعات الهواء.
      ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه بسرعة وبدقة على الجليد.
    3. دع الخليط أعلاه يجلس على الثلج لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: هذه خطوة حاسمة لمنع تغيير طبيعة التوبولين أو لتجنب تكوين بذور الأنابيب الدقيقة القصيرة.
    4. انقل الأنبوب إلى كتلة حرارية / حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مسبقا واحتضانه لمدة 30 دقيقة لبلمرة الأنابيب الدقيقة.
    5. أثناء بلمرة الأنابيب الدقيقة ، قم بإذابة حصة من المخزن المؤقت P12 وإحضارها إلى درجة حرارة الغرفة.
    6. قبل الانتهاء من 30 دقيقة من الحضانة ، ابدأ في إعداد المخزن المؤقت لتثبيت MT عن طريق سحب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت P12 في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. لهذا ، أضف 1 ميكرولتر من 1 mM taxol ودوامة الخليط على الفور.
      ملاحظة: ابدأ في إعداد المخزن المؤقت لتثبيت MT قبل حوالي 5 دقائق من إكمال الحضانة في الخطوة 3.1.4. يعمل تاكسول على استقرار الأنابيب الدقيقة المبلمرة عن طريق الارتباط ب β-tubulin.
    7. قم بتسخين المخزن المؤقت لتثبيت الأنابيب الدقيقة لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية وأضفه برفق إلى الأنابيب الدقيقة المبلمرة دون إزعاج خليط البلمرة في الأسفل.
      ملاحظة: سيؤدي تسخين مخزن التثبيت المؤقت إلى جعله في نفس درجة حرارة خليط البلمرة.
    8. لا تنقر على الخليط أو تضعه في ماصة وتحتضنه أكثر عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    9. اضغط برفق على الخليط واخلطه بطرف مقطوع مشطوف (سعة 200 ميكرولتر) ببطء باستخدام الماصة.
      ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، تعامل دائما مع الأنابيب الدقيقة بطرف مقطوع مشطوف لتجنب قص الأنابيب الدقيقة.
    10. خذ 10-15 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة المبلمرة في خلية التدفق للتحقق من بلمرة الأنابيب الدقيقة المناسبة.
      ملاحظة: يمكن للمرء أن يتصور الأنابيب الدقيقة غير المسماة باستخدام إعداد الفحص المجهري DIC.
    11. إذا كانت الأنابيب الدقيقة مركزة ، فقم بتخفيفها في المخزن المؤقت P12 المكمل ب 10 ميكرومتر تاكسول.
  2. إعداد غرفة خلية تدفق الحركة
    1. قم بإعداد غرفة الحركة باستخدام شريحة زجاجية وشريط على الوجهين وغطاء زجاجي (22 مم × 30 مم).
    2. خذ شريحة زجاجية ، ضع قطرة (~ 70 ميكرولتر) من الماء المقطر منزوع الأيونات في المنتصف وامسحها بورق مناديل خال من النسالة.
    3. قم بقص شريطين من الشريط على الوجهين (~ 35 × 3 مم) وألصقهما بإحكام على الشريحة الزجاجية بالتوازي ، مع ترك فجوة ~ 4-5 مم بين شريطين لإنشاء ممر ضيق.
    4. بعد ذلك ، خذ غطاء وأضف قطرة (~ 20 ميكرولتر) من الماء المقطر منزوع الأيونات في المنتصف. ضع شريطا من المناديل الورقية لتنظيف العدسات الخالية من النسالة على قطرة الماء حتى تمتص الماء. ثم حركه ببطء نحو أحد طرفي غطاء الغطاء.
      ملاحظة: يجب أن يكون الغطاء جافا تماما. يجب ألا يكون الماء مرئيا على غطاء الغطاء.
    5. ضع الغطاء على الشرائط ذات الوجهين العالقة على الشريحة واضغط على الغطاء بالتساوي على طول الشرائط لتلتصق بإحكام.
      ملاحظة: يرجى التأكد من أن الجانب النظيف من غطاء الغطاء يواجه الشريحة الزجاجية.
    6. تأكد من أن هذا معا يخلق غرفة ضيقة بسعة 10-15 ميكرولتر لأداء فحص الحركة (الشكل 4 أ).
  3. مقايسة حركية الجزيء الواحد في المختبر
    ملاحظة: لدراسة خصائص حركية الجزيئات المفردة القائمة على الأنابيب الدقيقة للمحركات ، يجب امتصاص الأنابيب الدقيقة على سطح الغطاء في غرفة الحركة.
    1. قم بتخفيف الأنابيب الدقيقة المبلمرة المستقرة في المخزن المؤقت P12 المكمل بتاكسول 10 ميكرومتر بنسب 1: 5 واخلطها عن طريق السحب ببطء بطرف مشطوف.
    2. حافظ على غرفة التدفق في وضع مائل (~ 15-20 درجة). تدفق 30 ميكرولتر من محلول الأنابيب الدقيقة المخفف عبر غرفة التدفق من الطرف العلوي مع الحفاظ على مناديل ورقية خالية من النسالة في الطرف السفلي لامتصاص السائل. هذا يخلق قوة قص لمحاذاة الأنابيب الدقيقة في اتجاه التدفق ويساعد على امتصاص الأنابيب الدقيقة بشكل مستقيم ومحاذاة متوازية.
    3. اترك قطرة صغيرة من السائل على طرفي الحجرة واحتفظ بخلية التدفق في وضع مقلوب (غطاء مواجه للأسفل) في غرفة مغلقة ورطبة لمنع جفاف غرفة الحركة.
    4. اتركه لمدة ~ 30 دقيقة حتى تمتز الأنابيب الدقيقة على سطح الغطاء داخل غرفة الحركة.
    5. في غضون ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت للحظر عن طريق خلط 500 ميكرولتر P12-BSA مع 5 ميكرولتر من 1 مللي متر تاكسول.
    6. تدفق 40-50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب واحتضان الشريحة في وضع مقلوب لمدة 10 دقائق في غرفة رطبة.
    7. تحضير خليط الحركة عن طريق سحب المكونات التالية في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 500 ميكرولتر بالترتيب التالي: 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت P12 مع تاكسول ، 0.5 ميكرولتر من 100 مللي متر MgCl2 ، 0.5 ميكرولتر من 100 مللي متر DTT ، 0.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل أوكسيديز الجلوكوز ، 0.5 ميكرولتر من 8 مجم / مل كاتلاز ، 0.5 ميكرولتر من 2.25 M جلوكوز ، و 1.0 ميكرولتر من 100 mM ATP.
      ملاحظة: تم استخدام التصوير الفلوري على نطاق واسع للتطبيقات البيولوجية22،23،24،25،26. يولد الإثارة الضوئية للبروتينات الفلورية أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي يمكن أن تسبب التبييض الضوئي للبروتينات الفلورية وتلف العينات البيولوجية27,28. تستخدم كاسحات الأكسجين مثل الجلوكوز وأوكسيديز الجلوكوز والكاتلاز بشكل روتيني في فحوصات الحركة للحد من التلف الضوئي وإطالة وقت تبييض البروتينات الفلورية.
    8. أخيرا ، أضف 1 ميكرولتر من المحرك المنقى إلى مزيج الحركة أعلاه واخلطه جيدا قبل التدفق إلى غرفة الحركة.
    9. أغلق طرفي غرفة الحركة بشمع البارافين السائل وصورها على الفور تحت إضاءة TIRF باستخدام هدف TIRF 100X 1.49 NA مع تكبير 1.5x.
    10. من أجل تركيز سطح انزلاق الغطاء ، أولا ، ركز على أحد الحواف الداخلية للشريط على الوجهين في غرفة الحركة تحت إضاءة تباين التداخل التفاضلي (DIC).
      ملاحظة: سيكون السطح اللامع وغير المستوي مرئيا.
    11. ثم انقل التركيز إلى غرفة الحركة. باستخدام الضبط الدقيق ، ركز سطح الغطاء وابحث عن الأنابيب الدقيقة الممتصة على سطح غطاء الغطاء.
    12. بمجرد تركيز الأنابيب الدقيقة ، قم بالتبديل إلى إضاءة TIRF باستخدام ليزر إثارة 488 نانومتر واضبط عمق الإضاءة عن طريق تغيير زاوية شعاع الإثارة للحصول على أفضل إضاءة TIRF موحدة (الشكل 4 ب).
    13. ركز المحركات الفردية الموسومة بعلامة mCitrine التي تتحرك بشكل عملي على طول سطح الأنابيب الدقيقة مع التعرض لمدة 100 مللي ثانية وسجل الحركة باستخدام كاميرا EM-CCD.
      ملاحظة: على الرغم من إجراء فحوصات الحركة على الأنابيب الدقيقة غير الموسومة ، يمكن استخدام وظيفة الإسقاط z ذات الكثافة القصوى للكشف عن الخطوط العريضة لمسار الأنابيب الدقيقة. بشكل تفضيلي ، تم النظر في الأحداث على مسارات الأنابيب الدقيقة الطويلة لتحليل التتبع.
    14. تتبع يدويا موضع المحركات الفردية الموسومة بالفلورسنت والتي تسير على مسارات الأنابيب الدقيقة الطويلة إطارا تلو الآخر باستخدام مكون إضافي مكتوب خصيصا في برنامج ImageJ (nih.gov) كما هو موضح سابقا29.
    15. قم بإنشاء الرسوم البيانية للسرعة وطول التشغيل لسكان المحرك عن طريق رسم عدد الأحداث في كل صندوق. قم بتركيب هذه الرسوم البيانية مع دالة ذروة غاوسية واحدة للحصول على متوسط السرعة وطول التشغيل12 (الشكل 4C-E).

4. في المختبر اختبار انزلاق الأنابيب الدقيقة

ملاحظة: لفهم السلوك الجماعي لمحركات kinesin-3 ، تم إجراء اختبار انزلاق الأنابيب الدقيقة في المختبر 18،30،31. عندما يتم تثبيت المحركات على غطاء الغطاء في وضع مقلوب وعند إضافة الأنابيب الدقيقة إلى الغرفة ، تهبط الأنابيب الدقيقة على المحركات وتنزلق على طول بينما تحاول المحركات المشي عليها (الشكل 5 أ ، ب).

  1. بلمرة الأنابيب الدقيقة الفلورية: بلمرة الأنابيب الدقيقة باتباع البروتوكول الموصوف سابقا باستثناء خلط التوبولين المسمى رودامين (3 مجم / مل) مع توبولين غير مسمى (10 مجم / مل) بنسبة 1:10.
  2. بعد 30 دقيقة من البلمرة ، أضف برفق 30 ميكرولتر من مخزن تثبيت الأنابيب الدقيقة قبل التسخين واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. بعد ذلك ، قم بقص الأنابيب الدقيقة عن طريق السحب بطرف التحميل الشعري (~ 25-30 مرة).
  4. قم بإعداد غرفة تدفق الحركة كما هو موضح سابقا ، تدفق 50 ميكرولتر من الأجسام النانوية GF9 المنقى (2.5 ميكرولتر من 100 نانومتر مخففة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت P12) واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع توجيه الغطاء لأسفل في غرفة رطبة.
    ملاحظة: المحركات موسومة بشكل نهائي C ب mCitrine. تستخدم الأجسام النانوية GFP لشل حركة المحركات بسبب انخفاض ثابت تفككها32.
  5. قم بسد سطح انزلاق الغطاء عن طريق تدفق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للكتلة إلى غرفة التدفق لمنع امتصاص البروتين غير المحدد واحتضانه لمدة 5 دقائق.
  6. قم بإعداد مزيج المحرك عن طريق سحب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للكتلة ، و 1 ميكرولتر من 100mM ATP ، و 5 ميكرولتر من محركات kinesin-3 المنقى 100 نانومتر Sf9. تخلط بلطف قبل أن تتدفق إلى الحجرة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
  7. اغسل الحجرة مرتين باستخدام 50 ميكرولتر من الكازين P12.
  8. في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم ، قم بإعداد خليط الفحص المنزلق بالترتيب التالي ، 45 ميكرولتر من P12-casein مع 10 ميكرومتر تاكسول ، 1 ميكرولتر من 100 mM ATP ، 0.5 ميكرولتر من 8 مجم / مل كاتلاز ، 0.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل من أوكسيديز الجلوكوز ، 0.5 ميكرولتر من 2.25 M جلوكوز و 1 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة الفلورية المنفصمة. امزج المحتوى برفق قبل التدفق إلى غرفة الحركة وأغلق نهايات الغرفة بشمع البارافين السائل.
  9. صورة الأنابيب الدقيقة تنزلق تحت إضاءة TIRF عند التعرض 100 مللي ثانية والتقاط الصور باستخدام كاميرا EM-CCD المرفقة.
    ملاحظة: تم تحديد متوسط سرعة انزلاق الأنابيب الدقيقة من خلال تتبع ما يقرب من 100 أنبوب دقيق فردي يدويا إطارا تلو الآخر باستخدام مكون إضافي مكتوب خصيصا في ImageJ29. حدد متوسط سرعة انزلاق الأنابيب الدقيقة عن طريق إنشاء مدرج تكراري وملاءمته لدالة Gaussian (الشكل 5C ، D).

النتائج

للتعبير عن البروتينات الحركية المؤتلفة النشطة والوظيفية وتنقيتها على نطاق واسع باستخدام تعبير Sf9-baculovirus ، يحتاج النظام إلى توليد جزيئات فيروسية تحمل بثبات تسلسل ترميز لإصابة خلايا Sf9. لتحقيق ذلك ، تم نقل خلايا Sf9 بترميز bacmid المؤتلف KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG. بعد 72 ساعة ، أظهرت مجموعة كبيرة من الخلايا...

Discussion

يعد نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9 أحد أكثر الطرق تنوعا ونجاحا لإنتاج البروتين عالي الإنتاجية19،36،37. قدرة التعديل بعد الترجمة لخلايا Sf9 قابلة للمقارنة إلى حد كبير مع نظام الثدييات15. عيب كبير في استخدام هذا النظام هو أنه بطي...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة للإعلان عنها.

Acknowledgements

يشكر V.S. و PS البروفيسور كريستين ج. فيرهي (جامعة ميشيغان ، آن أربور ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية) والبروفيسور روب ماليك (المعهد الهندي للتكنولوجيا في بومباي (IITB) ، مومباي ، الهند) على دعمهم غير المشروط طوال فترة الدراسة. ملاحظة تشكر الدكتورة سيفابريا كيروباكاران على دعمها طوال المشروع. تقر V.S. بالتمويل من خلال DBT (رقم المنحة: BT / PR15214 / BRB / 10/1449/2015 و BT / RLF / Re-entry / 45/2015) و DST-SERB (رقم المنحة: ECR / 2016 / 000913). تقر P.K.N بتمويل ICMR (المنحة رقم 5/13/13/2019 / NCD-III). PS تقر بالتمويل من DST (رقم المنحة: SR / WOS-A / LS-73/2017). يعترف D.J.S بالزمالة من IIT Gandhinagar.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502For protein purification
AprotininSigmaA6279For protein purification
CellfectinInvitrogen10362100For Sf9 transfection
DTTSigmaD5545For motility assays and protein purification
FLAG peptideSigmaF3290For protein purification
GlycerolSigmaG5516To freeze the protein
HEPESSigmaH3375For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896For Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541For buffers preparation
LeupeptinSigmaL2884For protein purification
MgCl2SigmaM2670For buffers preparation
NaClSigmaS7653For preparing lysis buffer
PMSFSigmaP7626For protein purification
Sf9 cellsKind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottlesThermo Scientific4115-0125For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlFor culturing Sf9 cells
SucroseSigmaS1888Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlFor Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATPSigmaA2647For motility and gliding assay
BSASigmaA2153For blocking motility chamber
CatalaseSigmaC9322For motility and gliding assay
DMSOSigmaD5879For dissolving Rhodamine
EGTASigma3777For preparing buffers
GlucoseSigmaG7021For motility and gliding assay
Glucose oxidaseSigmaG2133For motility and gliding assay
GTPSigmaG8877For microtubule polymerization
KOHSigmaP1767Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needleDispovanFor shearing microtubules
CaseinSigmaC3400For microtubule glidning assay
GFP nanobodiesGift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)For attaching motors to the coverslip
RhodamineThermo Scientific46406For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tipsEppendorfFor Sf9 culture and purification
15ml concal tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
35mm cell culture dishCole Palmer15179-39For Sf9 culture
BalanceSartorious0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubatorREMIFor Sf9 suspenculture at 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897For TIRF imaging and acquesition
Double sided tapeScotchFor making motility chamber
Glass coverslipFisherfinest12-548-5Asize; 22X30
Glass slideBlue StarFor making motility chamber
Heating blockNeuationDissolving paraffin wax
Inverted microscopeNikon Eclipse Ti- UTo check protein expression
Lasers488nm (100mW)For TIRF imaging
Liquid nitrogenFor sample freezing and storage
Microcapillary loading tipEppendorfEP022491920For shearing microtubules
MicroscopeNikon Eclipse Ti2-E with DIC set upFor TIRF imaging
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdFor quick spin
Objective100X TIRF objective with 1.49NA oil immersionFor TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterFor protein purification
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430To adjust pH
Pipette-boyVWRFor Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificFor protein purification
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificProtein purification
ThermoMixerEppendorfFor microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubesBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixerNeuationSample mixing
WaxSigmaV001228To seal motility chamber

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved