التقنيات الجزيئية والمناعية في نموذج فأر مهندس وراثيا لورم الجهاز الهضمي اللثوي

Summary

الهدف من هذه المخطوطة هو وصف نموذج الماوس Kit^V558Δ/+ وتقنيات التشريح والمعالجة الناجحة لعينات الماوس.

Abstract

الورم اللحمي المعدي المعوي (GIST) هو الساركوما البشرية الأكثر شيوعا وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مستقبلات KIT. عبر أنواع الأورام ، تم تطوير العديد من نماذج الفئران من أجل التحقيق في الجيل التالي من علاجات السرطان. ومع ذلك ، في GIST ، تستخدم معظم الدراسات في الجسم الحي نماذج فأر xenograft التي لها قيود متأصلة. هنا ، نصف نموذجا للفأر المختص بالمناعة والمعدل وراثيا لورم لحمية الجهاز الهضمي يؤوي طفرة Kit^{V558Δ /} +. في هذا النموذج ، يتم دفع KIT المتحور ، وهو الجين الورمي المسؤول عن معظم GISTs ، بواسطة مروجه الداخلي مما يؤدي إلى GIST الذي يحاكي المظهر النسيجي والتسلل المناعي الذي شوهد في GISTs البشرية. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذا النموذج بنجاح للتحقيق في كل من العلاجات الجزيئية والمناعية المستهدفة. هنا ، نصف تربية وصيانة مستعمرة الفأر Kit^{V558Δ /} +. بالإضافة إلى ذلك ، تفصل هذه الورقة علاج وشراء GIST ، وتصريف العقدة الليمفاوية المساريقية ، والأعور المجاور في الفئران Kit^{V558Δ / +} ، بالإضافة إلى إعداد العينات للتحليلات الجزيئية والمناعية.

Introduction

GIST هو الساركوما الأكثر شيوعا في البشر مع حدوث حوالي 6000 حالة في الولايات المتحدة الأمريكية¹. يبدو أن GIST ينشأ من خلايا تنظيم ضربات القلب المعدية المعوية المسماة الخلايا الخلالية في Cajal ، وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مجموعة التيروزين كيناز أو PDGFRA². الجراحة هي الدعامة الأساسية لعلاج GIST ويمكن أن تكون علاجية ، ولكن يمكن علاج المرضى الذين يعانون من مرض متقدم باستخدام مثبط التيروزين كيناز (TKI) ، إيماتينيب. منذ تقديمه منذ أكثر من 20 عاما ، قام imatinib بتحويل نموذج العلاج في GIST ، مما أدى إلى تحسين البقاء على قيد الحياة في الأمراض المتقدمة من 1 إلى أكثر من 5 سنوات ^3,4,5. لسوء الحظ ، نادرا ما يكون إيماتينيب علاجيا بسبب طفرات KIT المكتسبة ، لذلك هناك حاجة إلى علاجات جديدة لهذا الورم.

نماذج الفئران هي أداة بحثية مهمة في التحقيق في العلاجات الجديدة في السرطان. تم تطوير العديد من نماذج xenograft تحت الجلد و xenograft المشتقة من المريض والتحقيق فيها في GIST ^6,7. ومع ذلك ، فإن الفئران التي تعاني من نقص المناعة لا تمثل GIST البشري بشكل كامل لأن GISTs تؤوي ملفات تعريف مناعية تفاضلية اعتمادا على طفرتها الورمية ، وتغيير البيئة الدقيقة لورم الجهاز الهضمي يحسن من آثار العلاج TKI ^8,9. يحتوي الماوس Kit ^V558Δ/+ على حذف خط جرثومي غير متجانس في Kit exon 11 ، والذي يشفر مجال juxtamembrane ، وهو الموقع الأكثر تحورا شيوعا في GIST¹⁰ البشري. تقوم الفئران^{V558Δ / +} بتطوير GIST سيكال واحد مع اختراق 100٪ ، والأورام لها أنسجة مماثلة ، وإشارات جزيئية ، وتسلل مناعي ، واستجابة للعلاج مثل GIST البشري 8,11,12,13. هنا ، نصف تربية وعلاج وعزل العينات ومعالجتها في الفئران Kit^{V558Δ / +} لاستخدامها في البحوث الجزيئية والمناعية في GIST.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم إيواء جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض في جامعة بنسلفانيا وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة وبموافقة جامعة بنسلفانيا IACUC. تم تنفيذ القتل الرحيم وفقا لإجراءات التشغيل القياسية للموارد الحيوانية في مختبر جامعة بنسلفانيا.

1. كيت^{V558Δ / +} تربية الماوس

1. قم بإرجاع الفئران^V558Δ/+ أكثر من 10 مرات على خلفية C57BL/6J باستخدام الفئران C57BL/6J. للقيام بذلك ، قم بتربية الفئران الذكور ^{V558Δ / +} مع الفئران C57BL / 6J الإناث بنسبة 1: 2.
   ملاحظة: النمط الوراثي لمجموعة متماثلة الزيجوت V558 Δ^/V558Δ قاتل في الرحم. من الممكن تربية إناث كيت^{V558Δ / +} الفئران مع الفئران C57BL / 6J الذكور ، ولكن حجم القمامة حوالي نصف ما شوهد من الفئران البرية C57BL / 6J. علاوة على ذلك ، تنتج الفئران الإناث ^{V558Δ / +} كميات محدودة من الفضلات بعد 4 أشهر من العمر.
2. النمط الوراثي للجراء في عمر 7-14 يوما عن طريق قص إصبع القدم لتأكيد وجود النمط الوراثي Kit^{V558Δ /} +. استخدم التمهيدي الأمامي: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; مراسل 1: CCTCGACAACCTTCCA ؛ عكس التمهيدي: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; والمراسل 2: TCTCCTCGACCTTCCA للتنميط الجيني.

2. كيت^{V558Δ / +} علاج الماوس

1. يتطابق العمر والجنس مع مجموعة^V558Δ/+ الفئران قبل العلاج. استخدم الفئران المتطابقة مع العمر والجنس في الأتراب لأن الأورام من الفئران الإناث ^{V558Δ / +} أكبر من تلك الموجودة في الفئران الذكور. علاج الفئران في عمر 8-12 أسبوعا ، وفي ذلك الوقت يتم إنشاء الأورام (الشكل 1).
2. إعطاء مثبطات التيروزين كيناز عن طريق الفم أو عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p) ؛ مجموعة^{V558Δ / +} الأورام حساسة لمثبطات التيروزين كيناز. توفير إيماتينيب بجرعة 600 ملغم/لتر في مياه الشرب أو حقن 45 مغ/كغ مرتين يوميا. قم بقياس انخفاض وزن الورم باستخدام المقاييس الرقمية بعد تشريح الورم كما هو موضح في الخطوة 3 ، والتي تبلغ حوالي 50٪ في أسبوع واحد و 80٪ في 4 أسابيع بعد العلاج باستخدام إيماتينيب (الشكل 2).

3. كيت^{V558Δ / +} حصاد جهاز الماوس

1. القتل الرحيم للفئران بواسطة مخدر CO₂ بمعدل تدفق 60٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. اترك الفئران في الغرفة لمدة 2 دقيقة على الأقل بعد توقف التنفس ، ثم قم بإجراء خلع عنق الرحم لتأكيد الوفاة.
2. تعقيم جميع الأدوات ، وارتداء القفازات طوال العملية ، والحفاظ على حقل معقم. تحضير الجلد مع 70 ٪ من الإيثانول. قم بعمل شق عمودي في خط الوسط 2 سم باستخدام مقص وأدخل تجويف البطن. قم بتحليل أي التصاقات داخل البطن بشكل حاد.
3. لإزالة العقدة الليمفاوية المساريقية المستنزفة، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
   1. تحديد الأعور ورفع مساريقه بشكل متفوق. في منتصف الطريق تقريبا إلى قاعدة المساريق القولون ، حدد العقدة الليمفاوية المساريقية وتشريحها بحدة. العقدة الليمفاوية بيضاء اللون ويبلغ حجمها حوالي 0.5 سم × 0.5 سم.
   2. قسم أنسجة العقدة الليمفاوية إلى أثلاثين لعزل البروتين والأنسجة وتعليق الخلية الواحدة ، حسب الحاجة. بالنسبة لمعلقات الخلايا المفردة ، ضع أنسجة العقدة الليمفاوية في 20 مل من الوسائط الخالية من المصل (RPMI) واحتفظ بها على الجليد.
4. لعزل GIST والأعور ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
   1. يتم استبدال الأعور في كيت^{V558Δ / +} الفئران في الغالب ب GIST. تقسيم بعناية تقاطع اللفائفي من قاعدة الورم. لجمع الأعور ، قسم القولون مرة أخرى ، 2 سم بالقرب من قاعدة الورم.
   2. في 50٪ -60٪ من الفئران Kit^{V558Δ / +} ، يحتوي رأس الورم على غطاء من الأنسجة السيكالية ، والتي تحتوي عادة على سائل مصلي ولكن نادرا ما تحتوي على القيح (الشكل 3). تشريح أنسجة الغطاء بشكل حاد بعيدا عن أنسجة الورم.
   3. قسم أنسجة الورم و / أو الأعور إلى أثلاثين لعزل البروتين والأنسجة وتعليق الخلية الواحدة ، حسب الحاجة. بالنسبة لتعليق الخلية الواحدة ، ضع أنسجة الورم أو الأعور في HBSS مع 2٪ FCS ، وهو ما يكفي لتغطية العينة والحفاظ على الجليد.

4. تحليل اللطخة الغربية لأنسجة GIST

1. تحضير المخزن المؤقت لتحلل الأنسجة الذي يحتوي على 50 ملليمتر TrisHCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 150 mM NaCl ، 5 mM EDTA ، 1٪ منظف غير محدد ، 2 mM Na₃VO₄ ، 1 mM PMSF ، 10 mM NaF ، و 20 ميكرولتر / مل خليط مثبطات البروتيناز.
2. قم بإعداد محلول ملحي مخزن مؤقتا 1x Tris مع 1٪ Tween 20 (TBST) من خلال الجمع بين 1800 مل من الماء منزوع الأيونات ، و 2 مل من Tween 20 ، و 200 مل من محلول ملحي مخزن مؤقتا 10x Tris (TBS).
3. أعد تعليق الأنسجة من الخطوة 3.4.3 في أنبوب FACS في 5mL / g من المخزن المؤقت لتحلل الأنسجة وتجانس مرتين باستخدام مجانس ميكانيكي عند 15000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية على الجليد. احتضان الليزات لمدة 30 دقيقة على الجليد.
4. نقل الليزات إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 مل. جهاز طرد مركزي بسرعة قصوى لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
5. قم بتشغيل lysates على هلام متدرج بنسبة 4٪ إلى 15٪ ، ثم انقله إلى غشاء نيتروسليلوز ، كما هو موضح في¹⁴.
6. اغسل الغشاء مرة واحدة في 1x TBS لمدة 5 دقائق ثم احجب الغشاء في 5٪ من الحليب لمدة 1 ساعة. مرة أخرى ، اغسل الغشاء مرة واحدة في 1x TBS لمدة 10 دقائق.
7. الغشاء الحاضن في الأجسام المضادة الأولية المخفف 1: 1000 في 5٪ BSA عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اغسل الغشاء 3x في 1x TBST لمدة 10 دقائق لكل منهما. لطخة الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة 1: 2500 في الحليب 2.5 ٪ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
8. اغسل الغشاء مرة واحدة في 1x TBS لمدة 5 دقائق. أضف ما يكفي من ركيزة HRP لتغطية الغشاء ، عادة 200-500 ميكرولتر ، واستخدم جهاز تصوير رقمي للكشف عن التلألؤ الكيميائي وقياسه كميا.

5. الكيمياء النسيجية المناعية لأنسجة GIST

1. إصلاح الأنسجة من الخطوة 3.3.2 أو 3.4.3 في 4٪ بارافورمالديهايد عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تخزين الأنسجة في 70٪ EtOH حتى تصبح جاهزة للمعالجة. قم بتضمين كتل وتقسيمها بسماكة 5 ميكرومتر على شرائح زجاجية ، كما هو موضح^{في 15,16}.
2. الكشف الكامل عن الكيمياء المناعية باستخدام مجموعة أساسية للكشف عن المناعة ، كما هو موضح سابقا¹⁷.

6. تعليق خلية واحدة من العقدة الليمفاوية المساريقية

1. صب وسائط RPMI مع عينة العقدة الليمفاوية من الخطوة 3.3.2 على مرشح 100 ميكرومتر. انقل الفلتر إلى عقدة ليمفاوية مخروطية وهرسية جديدة سعة 50 مل مع الطرف الناعم لمحقنة بلاستيكية سعة 3 مل. فلتر الغسيل مع 20 مل من وسائط RPMI.
2. الطرد المركزي للترشيح عند 450 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت.
3. أعد تعليق الكريات في 20 مل من FBS بنسبة 1٪ في PBS (المخزن المؤقت للخرزة) واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر. جمع ترشيح الخلية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
4. الطرد المركزي للترشيح عند 450 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت. أعد التعليق في المخزن المؤقت للخرزة عند 6 × 10⁷ خلايا/مل لقياس التدفق الخلوي.

7. تعليق خلية واحدة من GIST

1. تحضير الكولاجيناز المخزن المؤقت عن طريق إضافة 250 ملغ من الكولاجيناز الرابع ، قرص واحد من مثبط الأنزيم البروتيني الخالي من EDTA و 100 ميكرولتر من DNase I إلى 50 مل من HBSS. تدور لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب.
2. ضع GIST في طبق معقم وأضف 2.5 مل من الكولاجيناز العازل. افرم الورم باستخدام مشرط معقم ومقص حتى يصبح الورم في شظايا دقيقة. استخدم ماصة كبيرة التجويف لشفط الورم والكولاجيناز في أنبوب سعة 50 مل.
3. احتضن في حاضنة تهتز عند 100 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإخماد التفاعل باستخدام 2 مل من FBS.
4. صب الكولاجيناز مع عينة GIST على مرشح 100 ميكرومتر وهرس الورم مع نهاية ناعمة من حقنة بلاستيكية 3 مل وجمعها في أنبوب 50 مل. اغسل الفلتر ب 20 مل من HBSS. جهاز الطرد المركزي للترشيح عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت.
5. أعد تعليق الكريات في 20 مل من المخزن المؤقت للخرز واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر. جمع الخلايا المرشحة وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. جهاز الطرد المركزي للترشيح عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت. أعد التعليق في المخزن المؤقت للخرزة عند 6 × 10⁷ خلايا/مل لقياس التدفق الخلوي.

8. تعليق خلية واحدة من الأعور

1. تحضير الكولاجيناز المخزن المؤقت كما في الخطوة 7.1. باستخدام المقص ، قم بتقسيم الأعور طوليا لفضح الغشاء المخاطي الداخلي. تقطع إلى أقسام 0.5 سم وتوضع في أنبوب 50 مل مع 5 مل من HBSS مع 2٪ FBS. رج بقوة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة الطرد المركزي في 450 × غرام لمدة 20 ثانية ، ثم استنشق السوبرناتان.
2. أضف 5 مل من HBSS مع 2 mM EDTA. احتضان في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 20 ثانية. شفط السوبرناتانت.
3. أضف 5 مل من HBSS. رج بقوة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة الطرد المركزي في 450 × غرام لمدة 20 ثانية ، ثم استنشق السوبرناتان. كرر مرة أخرى.
4. أضف 5 مل من الكولاجيناز العازل. احتضن في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 100 دورة في الدقيقة. رجه بقوة كل 10 دقائق. قم بإخماد التفاعل باستخدام 2 مل من FBS.
5. صب الكولاجيناز مع عينة الأعور على مرشح 100 ميكرومتر وهرس مع نهاية ناعمة من حقنة بلاستيكية 3 مل. اغسل الفلتر ب 20 مل من HBSS. جمع الترشيح.
6. الطرد المركزي للترشيح عند 450 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط السوبرناتانت. أعد تعليق الكريات في 20 مل من المخزن المؤقت للخرز واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر. جمع الخلايا المرشحة وعدها باستخدام مقياس الدم.
7. الطرد المركزي للترشيح عند 450 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط السوبرناتانت. أعد التعليق في المخزن المؤقت للخرزة عند 6 × 10⁷ خلايا/مل لقياس التدفق الخلوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يسمح نموذج الماوس Kit^V558Δ/+ بالتحقيق في العلاجات في نموذج الماوس المناعي. يبلغ متوسط عمر الفئران ^V558Δ/+ 8 أشهر بسبب انسداد الأمعاء التدريجي (الشكل 4). الأورام من Kit^{V558Δ / +} الفئران تعبر عن العلامات القانونية ل GIST بما في ذلك مجموعة ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يعد نموذج الماوس Kit^V558Δ/+ أداة بحث قوية في التحليل الجزيئي والمناعي ل GIST. على الرغم من أن استراتيجية التربية تتطلب صليبا واحدا ، إلا أن استخدام مجموعات الفئران ^{Kit V558Δ / +} في التجارب التي تحلل استجابة الورم يتطلب تربية واسعة النطاق. يجب أن تكون الفئران متطابقة مع العمر وال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 micron filter	EMSCO	1194-2360
1x RBC lysis buffer	Life Technologies	00-4333-57
3mL syringe	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl	Bio-Rad	4561083
4% Paraformaldehyde Solution	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 micron filter	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 micron filter	EMSCO	1194-2350
AKT antibody (C67E7)	Cell Signaling	4691
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Complete mini edta free protease inhibitor	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 antibody	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate	Selleck Chemicals	S1026
KIT antibody (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotyping	Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm	Rio-Rad	1620145
Nonfat Dry Milk	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
p-AKT antibody (S473)	Cell Signaling	4060
p-ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9101
p-KIT antibody (Y719)	Cell Signaling	3391
PMSF Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 platform	Scanco medical