JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول عزل خلايا الفأر من الدهون تحت الجلد ، وتمايزها إلى خلايا دهنية ناضجة ، وتحريض مقاومة الأنسولين. يتم تقييم عمل الأنسولين عن طريق الفسفرة / تنشيط أعضاء مسار إشارات الأنسولين عبر اللطخة الغربية. تسمح هذه الطريقة بالتحديد المباشر لمقاومة / حساسية الأنسولين في الخلايا الشحمية الأولية.

Abstract

مقاومة الأنسولين هي تأثير منخفض للأنسولين على الخلايا المستهدفة ، وعادة ما يتم اشتقاقه من انخفاض إشارات مستقبلات الأنسولين. تساهم مقاومة الأنسولين في تطور مرض السكري من النوع 2 (T2D) وغيره من الأمراض المشتقة من السمنة ذات الانتشار المرتفع في جميع أنحاء العالم. لذلك ، فإن فهم الآليات الكامنة وراء مقاومة الأنسولين له أهمية كبيرة. تم استخدام العديد من النماذج لدراسة مقاومة الأنسولين في كل من الجسم الحي والمختبر. تمثل الخلايا الشحمية الأولية خيارا جذابا لدراسة آليات مقاومة الأنسولين وتحديد الجزيئات التي تتصدى لهذه الحالة والأهداف الجزيئية للأدوية التي تحسس الأنسولين. هنا ، أنشأنا نموذجا لمقاومة الأنسولين باستخدام الخلايا الشحمية الأولية في المزرعة المعالجة بعامل نخر الورم α (TNF-α).

يتم تمييز خلايا السلائف الشحمية (APCs) ، المعزولة من الأنسجة الدهنية تحت الجلد للفأر المهضومة بالكولاجيناز بواسطة تقنية فصل الخلايا المغناطيسية ، إلى خلايا دهنية أولية. ثم يتم تحفيز مقاومة الأنسولين عن طريق العلاج باستخدام TNF-α ، وهو سيتوكين التهابي يقلل من فسفرة التيروزين / تنشيط أعضاء سلسلة إشارات الأنسولين. يتم قياس انخفاض الفسفرة لمستقبلات الأنسولين (IR) ، وركيزة مستقبلات الأنسولين (IRS-1) ، وبروتين كيناز B (AKT) بواسطة اللطخة الغربية. توفر هذه الطريقة أداة ممتازة لدراسة الآليات التي تتوسط مقاومة الأنسولين في الأنسجة الدهنية.

Introduction

الأنسولين هو هرمون ابتنائي تنتجه خلايا β جزيرة البنكرياس والمنظم الرئيسي لعملية التمثيل الغذائي للجلوكوز والدهون. من بين وظائفه العديدة ، ينظم الأنسولين امتصاص الجلوكوز ، وتخليق الجليكوجين ، وتكوين الجلوكوز ، وتخليق البروتين ، وتكوين الدهون ، وتحلل الدهون1. الإشارة الجزيئية الأولية بعد تفاعل الأنسولين مع مستقبلاته (IR) هي تنشيط نشاط كيناز بروتين التيروزين الجوهري ل IR2 ، مما يؤدي إلى الفسفرة الذاتية3 والتنشيط اللاحق لعائلة من البروتينات تعرف باسم ركائز مستقبلات الأنسولين (IRS) ، والتي ترتبط ببروتينات المحول مما يؤدي إلى تنشيط سلسلة من كينازات البروتين4 . ينشط الأنسولين مسارين رئيسيين للإشارات: فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K) - بروتين كيناز ب (AKT) وبروتين كيناز المنشط راس ميتوجين (MAPK). الأول يشكل نقطة فرع رئيسية أو عقدة 4,5 لتنشيط العديد من المستجيبات النهائية المشاركة في وظائف فسيولوجية متنوعة ، بما في ذلك تنظيم توازن الوقود ، في حين أن الأخير ينظم نمو الخلايا والتمايز 4,6. تعتمد إجراءات الأنسولين في النهاية على نوع الخلية والسياق الفسيولوجي7.

أحد الأنسجة الأيضية الرئيسية المستجيبة للأنسولين هو النسيج الدهني. الأنسجة الدهنية البيضاء هي أكثر أنواع الدهون وفرة في البشر والقوارض ، موزعة داخل الدهون تحت الجلد (بين الجلد والعضلات) والدهون الحشوية (حول الأعضاء في تجويف البطن). نظرا لحجمها الكبير ، فإن الخلايا الشحمية أو الخلايا الدهنية هي أكثر أنواع الخلايا وفرة في الأنسجة الدهنية. يمكن أن تكون هذه الخلايا الدهنية بنية / بيج (مولد للحرارة) ، وردي (في الغدة الثديية) ، وأبيض 8,9. تحافظ الخلايا الشحمية البيضاء على احتياطيات الطاقة الرئيسية في الجسم في شكل دهون ثلاثية ، وهي عملية تعتمد على الأنسولين. يعزز الأنسولين نقل الجلوكوز وتكوين الدهون ، بينما يمنع تحلل الدهون أو انهيار الدهون 7,10. كما أنه يسهل تمايز الخلايا preadipocytes إلى الخلايا الشحمية - الخلايا الناضجة لتخزين الدهون11.

تحدث مقاومة الأنسولين عندما ينتج مستوى الأنسولين الطبيعي استجابة بيولوجية موهنة ، مما يؤدي إلى فرط الأنسولين في الدم التعويضي12. مقاومة الأنسولين هي حالة مرتبطة بزيادة الوزن والسمنة5 ، والتي عندما تؤدي مجتمعة إلى مرض السكري من النوع 2 (T2D) وأمراض التمثيل الغذائي الأخرى13. فرط الأنسولين في الدم يعوض مقاومة الأنسولين في الأنسجة المحيطية للحفاظ على مستويات الجلوكوز في الدم الطبيعية14. ومع ذلك ، فإن فقدان الخلايا β أو استنفادها في نهاية المطاف ، جنبا إلى جنب مع تفاقم مقاومة الأنسولين ، يؤدي إلى ارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم بما يتفق مع T2D5. لذلك ، يمكن أن تسهم مقاومة الأنسولين وفرط الأنسولين في الدم في تطور أمراض التمثيل الغذائي المشتقة من السمنة15. علاوة على ذلك ، قد تسبب السمنة التهابا موضعيا مزمنا منخفض الدرجة يعزز مقاومة الأنسولين في الأنسجة الدهنية15،16،17. بالإضافة إلى ذلك ، تؤدي التغيرات المشتقة من السمنة في الأنسجة الدهنية ، مثل التليف والالتهاب وانخفاض تكوين الأوعية الدموية وتكوين الدهون ، إلى انخفاض مستويات مصل الأديبونيكتين (محسس الأنسولين) وزيادة إفراز عوامل مثل مثبط منشط البلازمينوجين 1 (PAI-1) ، والأحماض الدهنية الحرة ، والإكسوسومات في مجرى الدم ، مما يؤدي إلى تفاقم مقاومة الأنسولين17.

لا تزال العديد من الجوانب الكامنة وراء مقاومة الأنسولين غير معروفة. تم تطوير نماذج في المختبر وفي الجسم الحي لدراسة الآليات التي تتوسط مقاومة الأنسولين في الأنسجة المستهدفة الرئيسية ، بما في ذلك الأنسجة الدهنية. تتمثل ميزة النماذج في المختبر في أن الباحثين لديهم سيطرة أكبر على الظروف البيئية ويمكنهم تقييم مقاومة الأنسولين في أنواع معينة من الخلايا. على وجه الخصوص ، تحتوي خلايا السلائف الشحمية (APCs) على النمط الظاهري الفردي لأنسجة المتبرع ، والتي قد تعكس علم وظائف الأعضاء بشكل أفضل من خطوط الخلايا الشحمية. العامل الرئيسي الذي يحفز مقاومة الأنسولين في المختبر هو عامل نخر الورم α (TNF-α). TNF-α هو سيتوكين التهابي تفرزه الخلايا الشحمية والبلاعم في الأنسجة الدهنية18. في حين أنه مطلوب لإعادة تشكيل الأنسجة الدهنية المناسبة وتوسيعها19 ، فإن التعرض طويل الأمد لعامل نخر الورم α يحفز مقاومة الأنسولين في الأنسجة الدهنية في الجسم الحي وفي الخلايا الشحمية في المختبر20. يؤدي العلاج المزمن α TNF-لعدة أنواع من الخلايا إلى زيادة فسفرة سيرين لكل من IR و IRS-1 ، وبالتالي تعزيز انخفاض فسفرة التيروزين21. زيادة فسفرة IRS-1 على بقايا سيرين يمنع نشاط الأشعة تحت الحمراء التيروزين كيناز وقد تكون واحدة من الآليات الرئيسية التي من خلالها العلاج المزمن TNF-α يضعف عمل الأنسولين22,23. ينشط TNF-α المسارات التي تتضمن مثبط سيرين / ثريونين كيناز للعامل النووي ĸB كيناز β (IKKβ) وكيناز محطة c-Jun N (JNK) 24. يحفز JNK برنامج نسخ التهابي معقد ولكن أيضا يفسفر مباشرة IRS-16.

أصبح فهم التسبب في مقاومة الأنسولين مهما بشكل متزايد لتوجيه تطوير العلاجات المستقبلية ضد T2D. أثبتت APCs أنها نموذج ممتاز لدراسة بيولوجيا الخلايا الدهنية ، بما في ذلك حساسية ومقاومة الأنسولين ، ولتحديد الخصائص الجوهرية للخلايا الشحمية بشكل مستقل عن البيئة الجهازية. يمكن الحصول على APCs بسهولة من مستودعات دهنية مختلفة ، وفي ظل الظروف المناسبة ، يتم تمييزها إلى خلايا دهنية ناضجة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تقييم التأثيرات المباشرة على مقاومة / حساسية الأنسولين في الخلايا الشحمية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع تجارب القوارض من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا التابعة لمعهد البيولوجيا العصبية التابع ل UNAM ، رقم البروتوكول 075.

1. عزل خلايا السلائف الشحمية للفأر

  1. القتل الرحيم لذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-10 أسابيع (على سبيل المثال ، عن طريق استنشاق CO2 وخلع عنق الرحم اللاحق) (أربعة لكل عزلة). تطهير الفئران عن طريق فرك مع 70 ٪ من الإيثانول والحصول على الأنسجة الدهنية مباشرة بعد التضحية.
    ملاحظة: بعد القتل الرحيم للقوارض ، اعزل الأنسجة الدهنية على الفور وقم بتنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء التدفق الصفحي المعقم. يتم الاحتفاظ الفئران تحت 12 ساعة دورات الضوء / الظلام مع حرية الوصول إلى الطعام والماء.
  2. تشريح الأنسجة الدهنية تحت الجلد الأربية من كل فأر. قم بإزالة الأنسجة الدهنية فقط ، وتجنب إزالة العضلات أو الجلد أو أي نسيج آخر ، واجمعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 15 مل من محلول كولاجيناز من النوع الأول (1.5 مجم / مل) على الجليد. قم بإذابة كولاجيناز النوع 1 في مصل الزلال البقري عالي الجلوكوز 1٪ من Dulbecco (DMEM) وقم بالتصفية من خلال مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر.
  3. قطع الأنسجة الدهنية إلى قطع صغيرة بمقص جراحي معقم وهضم العينات عن طريق الحضانة بمحلول كولاجيناز من النوع 1 عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري (150 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة (ضع الأنبوب الذي يحتوي على الدهون والكولاجيناز في وضع أفقي للحصول على سطح اهتزاز أكبر). تحقق من عملية الهضم كل 10 دقائق للتأكد من أنها تعمل (تدهور الأنسجة مرئي) ولمنع فرط الهضم (انظر الشكل التكميلي S1).
  4. قم بالتصفية باستخدام حقنة شبكية 200 ميكرومتر (تم تعقيمها سابقا) للتخلص من الأنسجة غير المهضومة بالكولاجيناز. مرر المرشح على حافة الأنبوب لتصريف أكبر عدد ممكن من الخلايا في المحلول. أضف 15 مل من DMEM-1٪ BSA البارد لإيقاف الهضم والطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. نضح الطبقة العليا التي تحتوي على الخلايا الشحمية الناضجة ومعظم الطبقة السائلة ؛ تجنب لمس أو إزعاج الحبيبات. أضف 20 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) -2٪ مصل بقري جنيني (FBS) وأعد تعليق الحبيبة. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. إزالة طاف ، استنشاق الطبقة العليا أولا للقضاء على الخلايا الشحمية المتبقية والدهون. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول تحلل كلوريد الأمونيوم البوتاسيوم (ACK) (لتحلل خلايا الدم الحمراء) واحتضانها على الثلج لمدة 5 دقائق. أضف 10 مل من PBS-2٪ FBS ، واخلطها ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول مضاد ل Fc (الفئران المنقى المضاد للفأر CD16 / CD32 المخفف في PBS-2٪ FBS [1: 150]) لتقليل الارتباط بوساطة مستقبلات Fc بواسطة الأجسام المضادة ذات الأهمية. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 5 مل يتناسب مع الرفوف المبردة مسبقا لفاصل الخلايا المغناطيسية وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. تخلص من المادة الطافية ، أضف 200 ميكرولتر من خليط CD31 (PECAM-1) الجسم المضاد أحادي النسيلة (390) - البيوتين (1: 100) والجسم المضاد أحادي النسيلة CD45 (30-F11) - البيوتين (1: 100) ، واخلطه جيدا ، واحتضنه على الجليد لمدة 15 دقيقة (تحضير تخفيفات الأجسام المضادة في محلول مضاد ل Fc ؛ انظر الجدول 1). أضف 400 ميكرولتر من PBS-2٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: CD31 و CD45 هي علامات للخلايا البطانية والخلايا المكونة للدم ، على التوالي.
  9. نضح المادة الطافية واحتضانها في 100 ميكروبيدات مضادة للبيوتين (1: 5) لمدة 15 دقيقة على الجليد (تحضير تخفيفات الأجسام المضادة في محلول مضاد ل Fc ، انظر الجدول 1). أضف 400 ميكرولتر من PBS-2٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 350 ميكرولتر من PBS-2٪ FBS. قم بإزالة مجاميع الخلايا أو الجسيمات الكبيرة من المعلقات أحادية الخلية باستخدام مرشح ما قبل الفصل (70 ميكرومتر). أولا ، قم بتنشيط المرشح باستخدام 100 ميكرولتر من PBS-2٪ FBS ، وقم بتمرير تعليق الخلية عبر المرشح (اجمع في أنبوب نظيف) ، وأخيرا اغسل المرشح ب 100 ميكرولتر من PBS-2٪ FBS.
  11. إجراء الفصل المغناطيسي للخلايا باستخدام استراتيجية الفصل السلبي مع فاصل الخلايا المغناطيسية.
    1. ضع العينة في الموضع A من رف التبريد (تأكد من تبريد الحامل مسبقا) وأنبوبين فارغين في الموضع B و C لاستعادة الخلايا غير المصنفة والمصنفة ، على التوالي.
    2. قم بتحميل المخزن المؤقت للغسيل وتشغيل المخزن المؤقت في الزجاجات المقابلة قبل تشغيل الجهاز. قم ببرمجة المعدات لإجراء الفصل المغناطيسي للخلايا باستخدام بروتوكول DEPLETE .
      ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص للاستنفاد في الوضع القياسي لإزالة الخلايا ذات تعبير المستضد الطبيعي (في هذه الحالة ، الخلايا التي تحمل علامة anti-CD31 و anti-CD45) ، إذا كان الاسترداد هو الأولوية القصوى.
    3. في قسم الفصل ، حدد عدد العينات المراد فصلها وحدد بروتوكول DEPLETE . اضغط على تشغيل وابدأ الفصل. في نهاية البرنامج ، استرجع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي غير المصنفة عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  12. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط النمو (الجدول 1).
  13. قم بزرع ناقلات الجنود المدرعة في بئر واحد من صفيحة مكونة من 12 بئرا مطلية مسبقا بمصفوفة غشاء قاعدي بنسبة 2.5٪ (يتم الحصول على حوالي 50000-75000 خلية). أضف 400 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي 2.5٪ لتغطية كامل سطح كل بئر. مباشرة بعد إزالة المحلول الزائد وترك طبقة صغيرة فقط ، اترك اللوحة تجف (بدون غطاء) داخل غطاء التدفق الصفحي لمدة 1 ساعة على الأقل. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 الجو. قم بتغيير الوسط كل 48 ساعة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.
  14. عند التقاء 80٪ ، قم بإزالة الوسط تماما واغسله باستخدام 350 ميكرولتر من PBS-2٪ FBS. احصد الخلايا ب 350 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين-EDTA لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف 2 مل من وسط النمو واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل ، ثم جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
  15. قم بتمرير ناقلات الجنود المدرعة إلى 12 لوحة بئر (10000-20000 خلية لكل بئر) مطلية مسبقا بمصفوفة غشاء قاعدي بنسبة 2.5٪. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2. قم بتغيير الوسط كل 48 ساعة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.
    ملاحظة: يمكن تمرير ناقلات الجنود المدرعة مرة واحدة. بعد ذلك ، يفقدون قدرتهم على التكاثر والتمايز. انظر سير العمل الخاص بعملية عزل APCs في الشكل التكميلي S2.

2. تمايز الخلايا الشحمية وتحريض مقاومة الأنسولين

ملاحظة: الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 وتنفيذ الخطوات التي تنطوي على تغيير الوسط والعلاجات باستخدام TNF-α والأنسولين داخل غطاء معقم.

  1. عند التقاء 80٪ ، ابدأ عملية التمايز ؛ نضح أي وسط نمو واستبدله ب 500 ميكرولتر من وسط التمايز (الجدول 1) يحتوي على 3.3 نانومتر من البروتين المورفولوجي العظمي (BMP4) في كل بئر.
  2. بعد 48 ساعة ، استبدل الوسط بوسط التمايز (500 ميكرولتر لكل بئر) وكوكتيل التمايز (الجدول 1).
  3. قم بإزالة الوسط بعد 72 ساعة وأضف 100 نانومتر من الأنسولين في 500 ميكرولتر من وسط التمايز الطازج.
    ملاحظة: تبدأ الخلايا في إظهار مظهر دائري مع قطرات دهنية صغيرة بالداخل.
  4. نضح أي وسيط تمايز واستبدله ب 500 ميكرولتر من متوسط بسيط -2٪ FBS (الجدول 1) بعد 48 ساعة. تحفيز مقاومة الأنسولين مع 4 نانوغرام / مل من TNF-α. قم بتضمين آبار التحكم دون معالجة α عامل نخر الورم.
  5. بعد 24 ساعة من الحضانة، يضاف 4 نانوغرام/مل TNF-α في FBS متوسط بسيط 0٪ (الجدول 1). الحفاظ على آبار التحكم دون معالجة α عامل نخر الورم.
  6. قم بتنشيط مسار إشارات الأنسولين بعد 24 ساعة عن طريق إضافة 100 نانومتر من الأنسولين واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 5٪. قم بإزالة الوسط واغسله ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. قم بتضمين آبار التحكم دون علاج الأنسولين.

3. تقييم مسار إشارات الأنسولين بواسطة اللطخة الغربية

  1. استخراج البروتين والقياس الكمي
    1. اغسل كل بئر من الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS واحتفظ بها على الثلج لتحلل الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA (الجدول 1) الذي يحتوي على 1٪ كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني يضاف قبل عزل العينة مباشرة. اكشط سطح البئر بالكامل بطرف وانقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.6 مل (احتفظ به على الجليد).
    2. احتضان لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية في شاكر دوار ، واخلطه بواسطة الدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية واستعد المادة الطافية (احتفظ بها على الجليد).
    3. حدد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد (لا تخفف العينة لتحديدها).
    4. خذ الحجم اللازم المقابل ل 40-60 ميكروغرام وقم بتشويهه باستخدام 6x Laemmli buffer (الجدول 1) عن طريق الحضانة عند 97 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أثناء الاهتزاز عند 550 دورة في الدقيقة. تجمد حتى الاستخدام.
  2. SDS-بولي أكريلاميد هلام الكهربائي
    1. أداء SDS-بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) مع هلام بولي أكريلاميد 7.5 ٪ من سمك 1.5 ملم. أدخل الجل في الخزان واملأه بالمخزن المؤقت الجاري (الجدول 1).
    2. أضف 3 ميكرولتر من معيار البروتين الملون مسبقا إلى البئر الأول من الجل وقم بتحميل كل عينة في الآبار اللاحقة.
    3. قم بتشغيل الجل عند 80 فولت لمدة 15 دقيقة تقريبا لضمان دخول العينة إلى مصفوفة هلام مكثف بولي أكريلاميد. بعد ذلك ، قم بزيادة الجهد إلى 90 فولت لمدة 2.5 ساعة أو حتى يمكن رؤية علامة الوزن الجزيئي 37 كيلو دالتون عند الحافة السفلية للهلام.
    4. انقل البروتينات من الجل إلى غشاء النيتروسليلوز في غرفة شبه جافة لمدة 35 دقيقة عند 25 فولت. قبل ذلك ، اغمر الجل والغشاء والمرشحات في مخزن النقل المؤقت (الجدول 1) لبضع دقائق.
  3. لطخة غربية
    1. بعد النقل ، اغسل الغشاء بمحلول ملحي مخزن Tris (TBS) يحتوي على 0.1٪ توين 20 (TBS-T 0.1٪) (الجدول 1) لمدة 3 دقائق مع الرج عند 30 دورة في الدقيقة.
    2. سد الغشاء بمحلول مانع (الجدول 1) عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة في دوران مستمر.
    3. قطع الغشاء إلى ثلاثة أجزاء وفقا لعلامة الوزن الجزيئي لاحتضان بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية المختلفة (المخففة في محلول حجب) عند 4 °C في دوران ثابت: الجسم المضاد Phospho-IRS1 (Tyr608) (1: 1,000) ، النطاق المتوقع عند 180 كيلو دالتون ؛ β مستقبلات الأنسولين الفوسفو (Tyr1150/1151) الجسم المضاد (1: 1000) ، النطاق المتوقع عند 95 كيلو دالتون ؛ الجسم المضاد Phospho-Akt (Ser473) (1: 1,000) ، النطاق المتوقع عند 60 كيلو دالتون.
    4. اغسل الأغشية 5 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام TBS-T 0.1٪.
    5. احتضان الأغشية بالجسم المضاد الثانوي المقابل المقترن بالبيروكسيديز (المخفف في محلول الحظر) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في دوران ثابت: بيروكسيديز أفينيالحمير النقي المضاد للأرانب IgG (H + L) (1: 5000).
    6. اغسل الأغشية 5 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام TBS-T 0.1٪.
    7. الكشف عن البروتينات باستخدام نظام الكشف عن التلألؤ الكيميائي. تحضير الركيزة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    8. ضع اللطخة في كيس بلاستيكي وأضف 200 ميكرولتر من الركيزة الكيميائية لتغطية الغشاء بالكامل. استنزاف الركيزة الزائدة وإزالة أي فقاعات الهواء.
    9. قم بتعريض كل لطخة لمدة 30-60 ثانية في نظام تصوير عالي الأداء متوافق مع التلألؤ الكيميائي.
    10. قم بتجريد الأغشية (الخطوات 10-13 من قسم اللطخة الغربية) لكسر تفاعلات الأجسام المضادة والمستضد وبالتالي السماح بإعادة نفخ أغشية النيتروسليلوز. استرجع الأغشية واغسلها 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام TBS-T 1٪ عند 50 دورة في الدقيقة.
    11. احتضان لمدة 7 دقائق مع 10 مل من 0.2 M NaOH عند 50 دورة في الدقيقة.
    12. اغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها بماء الصنبور عند 50 دورة في الدقيقة.
    13. يغسل لمدة 10 دقائق مع TBS-T 1٪ عند 50 دورة في الدقيقة.
    14. كرر الخطوات 2-9 من قسم اللطخة الغربية لاحتضان الغشاء باستخدام توبولين مضاد بيتا (55 كيلو دالتون) كعنصر تحكم في التحميل باستخدام تخفيف 1: 1000.
    15. قم بإجراء تحليل قياس الكثافة25 لكل بروتين باستخدام برنامج ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

على مدى السنوات القليلة الماضية ، أدى الانتشار المتزايد للسمنة و T2D إلى بحث مكثف عن الآليات التي تتوسط مقاومة الأنسولين في الأنسجة الدهنية. باستخدام البروتوكول الموضح هنا ، يمكن تمييز APCs إلى خلايا دهنية ناضجة لتقييم مقاومة الأنسولين وحساسيته. بمجرد وصول APCs إلى نقطة التقاء ، يستغرق الأمر 10...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تقدم هذه الورقة طريقة لدراسة مقاومة الأنسولين التي تستخدم الخلايا الشحمية الأولية في المزرعة المعالجة بعامل نخر الورم α. يتميز هذا النموذج بأنه يمكن زراعة الخلايا الشحمية الأولية في ظل ظروف محددة لفترات طويلة من الزمن مع تحكم صارم في العوامل البيئية الخلوية26. مدة الفحص هي 15-2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر دانيال موندراغون، وأنطونيو برادو، وفرناندو لوبيز-باريرا، ومارتين غارسيا-سيرفين، وأليخاندرا كاستيلا، وماريا أنتونييتا كارباجو على مساعدتهم التقنية، وجيسيكا غونزاليس نوريس على تحريرها النقدي للمخطوطة. وحظي هذا البروتوكول بدعم المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في المكسيك، والصندوق القطاعي للبحوث في منحة التعليم 284771 (إلى ي. م).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer LONZA10-548E
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi130-090-485
Anti-CD31eBioscience13-0311-85
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)Corning354234
bFGFSigmaF0291Growth factor
BSAEquitech-Bio, Inc.BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin eBioscience13-0451-85
Collagenase, Type 1Worthington BiochemLS004197
DexamethasoneSigmaD1756
DMEMGIBCO12800017
DMEM low glucoseGIBCO31600-034
EGFPeprotech315-09Growth factor
FBSGIBCO26140-079
ITS mixSigmaI3146
L-ascorbic acid 2-phosphateSigmaA8960
LIFMilliporeESG1107Growth factor
Linoleic acid-albuminSigmaL9530
MCDB 201 mediumSigmaM6770
NormocinInvivoGenant-nr-2
PDGF-BB Peprotech315-18Growth factor
Peniciline-StreptomycineBioWestL0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)Miltenyi130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 BD Pharmingen553142
Trypsin-EDTA GIBCO25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]SigmaI5879Differentiation cocktail
BMP4R&D Systems5020-BP-010Differentiation cocktail
DexamethasoneSigmaD1756Differentiation cocktail
InsulinSigmaI9278
RosiglitazoneCayman71742Differentiation cocktail
TNFαR&D Systems210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibodyAbcamab6046
Bromophenol blueBioRad161-0404Laemmli buffer
EDTASigmaE5134RIPA buffer
EGTASigmaE4378RIPA buffer
FluorChem E systemProteinSimple
GlycerolSigmaG6279Laemmli buffer
GlycineSigmaG7126Running and Transfer buffer
IgepalSigmaI3021RIPA buffer
2- mercaptoethanolSigmaM3148Laemmli buffer
MethanolJT Baker907007Transfer buffer
NaClJT Baker3624-05TBS-T
NaFSigma77F-0379RIPA buffer
NaOH JT Baker3722-19
Na4P2O7Sigma114F-0762RIPA buffer
Na3VO4SigmaS6508RIPA buffer
Nitrocellulose membrane BioRad1620112
Nonfat dry milkBioRad1706404Blocking solution
Prestained protein standard BioRad1610395
Protease inhibitor cocktail SigmaP8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β Cell signaling3024
Phospho-Akt (Ser473) AntibodyCell signaling9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibodyMillipore9432
Saccharose JT Baker407205RIPA buffer
SDSBioRad1610302Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
Tris-basePromegaH5135Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HClJT Baker4103-02RIPA buffer - TBS
Tween 20SigmaP1379TBS-T

References

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
  3. Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
  4. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
  5. Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021).
  6. Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  7. Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
  8. Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , Academic Press. 370-384 (2019).
  9. Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
  10. Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
  11. Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
  12. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
  13. Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
  14. James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
  15. Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
  16. Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
  17. Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
  18. Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
  19. Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  20. Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
  21. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  22. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191(2014).
  23. Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
  24. Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
  25. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  26. Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
  27. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
  28. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  29. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  30. Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
  31. Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
  32. Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
  33. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  34. Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
  35. Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
  36. Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
  37. Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192 TNF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved