JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الشراء الجراحي وإزالة الخلايا اللاحقة لسدائل الخنازير الوعائية عن طريق تروية منظف كبريتات دوديسيل الصوديوم من خلال الأوعية الدموية في مفاعل حيوي مخصص للتروية.

Abstract

تؤدي عيوب الأنسجة الرخوة كبيرة الحجم إلى عجز وظيفي ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على نوعية حياة المريض. على الرغم من أنه يمكن إجراء إعادة الإعمار الجراحي باستخدام نقل السديلة الحرة الذاتية أو زرع الأوعية الدموية المركبة (VCA) ، إلا أن هذه الطرق لها أيضا عيوب. تحد مشكلات مثل المراضة في موقع المتبرع وتوافر الأنسجة من نقل السديلة الحرة ذاتية المنشأ ، في حين أن كبت المناعة يمثل قيدا كبيرا على VCA. تمثل الأنسجة المهندسة في الجراحة الترميمية باستخدام طرق إزالة الخلايا / إعادة الخلايا حلا ممكنا. يتم إنشاء الأنسجة منزوعة الخلايا باستخدام طرق تزيل المواد الخلوية الأصلية مع الحفاظ على البنية الدقيقة الأساسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM). يمكن بعد ذلك إعادة تشكيل هذه السقالات اللاخلوية لاحقا بخلايا خاصة بالمستلم.

يفصل هذا البروتوكول طرق الشراء وإزالة الخلايا المستخدمة لتحقيق السقالات اللاخلوية في نموذج الخنازير. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر أيضا وصفا لتصميم وإعداد المفاعل الحيوي للتروية. تشمل اللوحات الثرب الخنزير ، واللفافة الموترة ، والساعد الكعبري. يتم إجراء إزالة الخلايا عن طريق التروية خارج الجسم الحي لمنظف كبريتات دوديسيل الصوديوم منخفض التركيز (SDS) متبوعا بمعالجة إنزيم DNase وتعقيم حمض البيراسيتيك في مفاعل حيوي مخصص للتروية.

تتميز عملية إزالة الخلايا الناجحة للأنسجة بمظهر أبيض معتم من اللوحات بشكل مجهري. تظهر اللوحات اللاخلوية عدم وجود نوى على تلطيخ نسيجي وانخفاض كبير في محتوى الحمض النووي. يمكن استخدام هذا البروتوكول بكفاءة لإنشاء سقالات الأنسجة الرخوة منزوعة الخلايا مع ECM المحفوظة والهندسة المعمارية الدقيقة الوعائية. يمكن استخدام هذه السقالات في دراسات إعادة التشكيل الخلوي اللاحقة ولديها القدرة على الترجمة السريرية في الجراحة الترميمية.

Introduction

يمكن أن تؤدي الإصابة الرضحية وإزالة الورم إلى عيوب كبيرة ومعقدة في الأنسجة الرخوة. يمكن أن تضعف هذه العيوب نوعية حياة المريض ، وتسبب فقدان الوظيفة ، وتؤدي إلى إعاقة دائمة. في حين أن تقنيات مثل نقل رفرف الأنسجة الذاتية قد تم ممارستها بشكل شائع ، فإن المشكلات المتعلقة بتوافر السديلة ومراضة موقع المتبرع هي قيود رئيسية1،2،3. زرع الأوعية الدموية المركب (VCA) هو بديل واعد ينقل الأنسجة المركبة ، على سبيل المثال ، العضلات والجلد والأوعية الدموية ، كوحدة واحدة إلى المتلقين. ومع ذلك ، يتطلب VCA كبت المناعة على المدى الطويل ، مما يؤدي إلى سمية الدواء ، والالتهابات الانتهازية ، والأورام الخبيثة4،5،6.

السقالات اللاخلوية المهندسة بالأنسجة هي حل محتمل لهذه القيود7. يمكن الحصول على سقالات الأنسجة اللاخلوية باستخدام طرق إزالة الخلايا ، والتي تزيل المواد الخلوية من الأنسجة الأصلية مع الحفاظ على البنية الدقيقة الأساسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM). على عكس استخدام المواد الاصطناعية في هندسة الأنسجة ، فإن استخدام السقالات المشتقة بيولوجيا يوفر ركيزة ECM محاكاة حيوية تسمح بالتوافق الحيوي وإمكانية الترجمة السريرية8. بعد إزالة الخلايا ، يمكن أن تؤدي إعادة الخلايا اللاحقة للسقالات بخلايا خاصة بالمتلقي إلى توليد أنسجة وظيفية وعائية مع القليل من المناعة9،10،11. من خلال تطوير بروتوكول فعال للحصول على الأنسجة اللاخلوية باستخدام تقنيات إزالة الخلايا من التروية ، يمكن هندسة مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. في المقابل ، يسمح البناء على هذه التقنية بالتطبيق على أنسجة أكثر تعقيدا. حتى الآن ، تم التحقيق في إزالة الخلايا من الأنسجة الرخوة الوعائية باستخدام أنسجة وعائية بسيطة مثل رفرف لفافة جلدية كامل السماكة في القوارض 12 ، والخنازير13 ، والنماذج البشرية 14 ، وكذلك الخنزير المستقيم البطني العضلات الهيكلية15. بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضا إزالة خلايا التروية من الأنسجة الوعائية المعقدة كما هو موضح في نماذج الخنازير والأذن البشرية 16,17 ونماذج الكسب غير المشروع للوجه البشري18.

هنا ، يصف البروتوكول إزالة الخلايا من اللوحات الحرة الوعائية باستخدام سقالات ECM المشتقة بيولوجيا. نقدم إزالة الخلايا من ثلاث لوحات ذات صلة سريريا: 1) الثرب ، 2) اللفافة الموترة ، و 3) الساعد الكعبري ، وكلها تمثل اللوحات العمود الفقري المستخدمة بشكل روتيني في الجراحة الترميمية ولم يتم فحصها مسبقا في الدراسات التي أجريت على الحيوانات في سياق إزالة الخلايا من الأنسجة. توفر هذه اللوحات المهندسة بيولوجيا منصة متعددة الاستخدامات ومتاحة بسهولة ولديها القدرة على التطبيقات السريرية للاستخدام في مجال إصلاح وإعادة بناء عيوب الأنسجة الرخوة الكبيرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بمواضيع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة للشبكة الصحية الجامعية (IACUC) ويتم تنفيذها وفقا لبروتوكول وإجراءات مركز الموارد الحيوانية التابع لشبكة الصحة الجامعية وإرشادات المجلس الكندي لرعاية الحيوان. تم استخدام خمسة خنازير يوركشاير (35-50 كجم ؛ عمر حوالي 12 أسبوعا) لجميع التجارب.

1. تصنيع المفاعل الحيوي للتروية

  1. انظر الشكل 1 لجميع المكونات المستخدمة في المفاعل الحيوي للتروية. لتصنيع غرفة الأنسجة ، استخدم حاويات البولي بروبلين ذات القفل المفاجئ المتاحة تجاريا مع أغطية مانعة لتسرب الماء ومحكمة الإغلاق تحتوي على بطانة مانعة للتسرب من السيليكون. تأكد من أن الحاويات متوافقة مع الأوتوكلاف.
  2. حفر اثنين 1/4 في ثقوب على طول جوانب الحاوية وخيط جزء قصير من L / S-16 أنابيب السيليكون المغلفة بالبلاتين. سيحمل أحد الأنابيب تدفق perfusate والآخر للتدفق الخارجي.
  3. بالنسبة لأنبوب التدفق ، قم بتوصيل موصل Luer ذكر في الجزء الداخلي الذي سيتم استخدامه للاتصال بقنية الأنسجة. قم بتوصيل موصل Luer أنثى في الطرف الخارجي لأنبوب التدفق الذي سيتم استخدامه للاتصال بمحبس ثلاثي الاتجاهات.
  4. حفر حفرة واحدة 1/4 في غطاء الغرفة وربط جزء قصير آخر من أنابيب السيليكون L / S-16 المغلفة بالبلاتين. سيكون هذا الأنبوب بمثابة فتحة تهوية.
  5. اصنع أنابيب التدفق والتدفق عن طريق قياس حوالي 50 سم من أنابيب السيليكون المطلية بالبلاتين L / S-16. قم بتوصيل أحد طرفيه بأنبوب مضخة أصفر ثلاثي التوقفات والطرف الآخر بماصة مصلية معقمة سعة 2 مل لنقل البيرفوسات من خزانات المنظفات إلى غرفة المفاعل الحيوي.
  6. الأوتوكلاف جميع المكونات (الغرفة والأنابيب) في عبوات معقمة ملفوفة بشكل فردي.

figure-protocol-1720
الشكل 1: تصنيع المفاعل الحيوي للتروية. يتكون المفاعل الحيوي للتروية من (أ) حجرة أنسجة بلاستيكية من مادة البولي بروبيلين (B) مع ثقوب جانبية محفورة لاستيعاب أنابيب التروية بغطاء محكم الغلق للهواء والماء. (ج) يتم توصيل محبس بالأنابيب للسماح بربط أنبوب التروية الذي يحمل عوامل إزالة الخلايا من خزان المنظف إلى النفايات بطريقة أحادية المسار. (د) تستخدم أشرطة المضخات المتوافقة لتوصيل الأنبوب ثلاثي التوقفات بالمضخة التمعجية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. إعداد حلول إزالة الخلايا

  1. تحضير محلول ملحي عادي هيبارين (15 وحدة دولية / مل) عن طريق تخفيف 1.5 مل من محلول مخزون الهيبارين 1000 وحدة دولية / مل في 100 مل من محلول ملحي عادي.
  2. تحضير 0.05٪ وزن / فولت محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) عن طريق إضافة 9 جم من مسحوق SDS ببطء إلى 18 لترا من الماء المقطر منزوع الأيونات. استخدم كاربوي بولي بروبيلين كبير الحجم (PP) لاستيعاب محلول SDS. الحل جاهز للاستخدام عند إذابته بالكامل. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  3. إعداد DNase I حل العمل. أولا ، أعد تكوين DNase I المجفف بالتجميد إلى تركيز مخزون قدره 10 مجم / مل مع 5 mM CaCl 2 في dH2 O. قم بتخزين محلول DNase I المعاد تكوينه كحصص في مجمد −20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. في يوم الاستخدام ، قم بتخفيف DNase I بمخزون 1: 100 مع Mg ++ (1.29 mM) و Ca++ (1.98 mM) في dH2O المعقم إلى تركيز نهائي قدره 0.1 مجم / مل.
    ملاحظة: سوف يتحلل نشاط DNase ما لم يتم تخزينه مجمدا. يجب استخدام محلول DNase الطازج فقط للهضم الأنزيمي للحمض النووي في درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بإعداد محلول 1x PBS عن طريق تخفيف مخزون 10x PBS 1:10 بالماء المعقم المعقم في حجم نهائي 5 لتر في carboy PP. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  5. تحضير 1٪ مضادات حيوية / مضادات الميكروبات (A / A) في برنامج تلفزيوني. تمييع 100x المضادات الحيوية / مضادات الميكروبات 1: 100 مع محلول PBS معقم 1x إلى حجم نهائي من 1 لتر. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  6. تحضير 0.1٪ (v / v) حمض البيراسيتيك (PAA) / 4٪ (v / v) الإيثانول (EtOH) عن طريق إضافة 3.13 مل من PAA + 40 مل من الإيثانول 100٪ + 956 مل من dHالمعقم 2O. ارفع الحجم النهائي إلى 1000 مل واحفظه في درجة حرارة الغرفة.

3. شراء اللوحات الخنازير

ملاحظة: هذا إجراء طرفي. تم استخدام خنزير واحد لشراء اللوحات الثلاثة. القتل الرحيم للحيوان بشكل إنساني بعد شراء جميع اللوحات.

  1. رعاية ما قبل الجراحة
    1. الخنازير السريعة قبل 12 ساعة على الأقل من الجراحة. تخدير الحيوانات بالكيتامين (20 مغ/كغ في العضل، بالحقن العضلي)، والأتروبين (0.04 مغ/كغ بالحقن العضلي)، والميدازولام (0.3 مغ/كغ بالحقن العضلي).
    2. تحفيز التخدير عن طريق استنشاق 5٪ إيزوفلوران من خلال قناع بمعدل تدفق 22-44 مل / كجم / دقيقة لإدخال الخط المحيطي والتنبيب. حافظ على التخدير بنسبة 0.5٪ -2٪ إيزوفلوران عند 22-44 مل / كجم / دقيقة. تأكد من عمق التخدير الكافي عن طريق التحقق من استقرار الدورة الدموية ولاحظ ردود الفعل المنعكسة على انسحاب الجفن / الدواسة أو توتر عضلات الفك للدلالة على مستوى مناسب من التخدير الذي يتم إعطاؤه. تطبيق ريميفنتانيل الوريدي (10-20 ميكروغرام/كغ/ساعة) بالتسريب المستمر أثناء الجراحة لتسكين.
    3. قم بتنبيب الخنزير بأنبوب قصبة هوائية مناسب (7-8 مم) وقم بتوصيل الأنبوب بجهاز تهوية مضبوط على حجم المد والجزر 8 مل / كجم ، PEEP من 5 سم H 2 0 ، FiO2من 0.5 ، ومعدل التنفس من 14.
    4. أدخل قسطرة وعائية 22 G في وريد الأذن. بمجرد الحصول على الوصول عن طريق الوريد (IV) ، قم ببث محلول ملحي طبيعي دافئ بنسبة 0.9٪ عند 5-10 مل / كجم / ساعة طوال الإجراء للحفاظ على متوسط الضغط الشرياني بين 60 مم زئبق و 90 مم زئبق.
    5. راقب باستمرار معدل ضربات القلب وقياس تأكسج النبض وثاني أكسيد الكربون في نهاية المد والجزر2. تقييم ضغط الدم ودرجة حرارة الجسم كل 5 دقائق.
    6. ضع مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء التخدير. تحضير المجال الجراحي بأكمله مع البوفيدون اليود. ثنى المجال الجراحي بمناشف معقمة.
  2. رفرف Omental
    1. ضع الخنزير في وضع ضعيف وقم بإجراء بضع البطن السري xypho.
    2. عند دخول البطن ، قم بتعبئة سيفالاد المعدة لتصور الثرب الأكبر. ضع الثرب بعناية في مجال الجراحة وحدد الأوعية المعدية التي تعمل على طول الانحناء الأكبر للمعدة (الشكل 2 أ).
    3. ابدأ من الجانب الأيسر من الانحناء الأكبر حيث ينضم الشريان المعدي الأيسر إلى الشريان الطحالي. باستخدام مقص ستيفنز المستقيم ، قم بالهيكل العظمي لكل من الشريان المعدي الأيسر والوريد. ثم قم بتقسيم كل منهما بشكل منفصل باستخدام الروابط أو المشابك الجراحية.
    4. المضي قدما على طول انحناء أكبر من المعدة من اليسار إلى اليمين. قم بربط وتقسيم الفروع الوعائية القصيرة الناشئة عن الثرب الذي يوفر انحناءا أكبر للمعدة. احرص على عدم إصابة عنيق المعدة الرئيسي للثرب خلال هذه الخطوة.
    5. استمر في تعبئة الثرب الأكبر حتى يتم مواجهة تقاطع الأوعية المعدية الصحيحة والشريان المعدي المعوي. باستخدام المشابك أو الأربطة ، قم بربط الشريان المعدي الأيمن والأوردة بشكل منفصل لتحرير السديلة العظمية.
    6. بمجرد تحريره ، يمكن تقسيم الثرب على طول الوسط إلى نصفين ، كل نصف مصحوب بشريان ووريد معدي معوي. هذا يسمح بشراء اثنين من اللوحات الحرة omental من عملية واحد. قم بتقليب الأوعية المعدية المعوية بشكل فردي بقنية 20-22 جم ثم قم بتأمينها برباط حريري 3-0.
    7. اغسل محلول ملحي هيباريني (15 وحدة دولية / مل) في القنية الشريانية المعدية حتى يلاحظ تدفق وريدي واضح.
  3. موتر اللفافة لاتا رفرف
    ملاحظة: يعتمد البروتوكول على وصف سابق لرفرف موتر الخنازير بواسطة Haughey et al.19. يتم إجراء تعديل لعزل الجزء اللفافي فقط من رفرف اللفافة الموتر.
    1. ضع الخنزير في وضع الاستلقاء الجانبي وحلق الطرف الخلفي العلوي بالكامل بشكل ثنائي. تحضير وثنى باستخدام الإجراءات المعقمة المعتادة.
    2. حدد الحد الأمامي للسديلة بخط يمتد من العمود الفقري الحرقفي العلوي الأمامي (ASIS) باتجاه الرضفة الجانبية. موقع عنيق حوالي 6-8 سم من ASIS على طول هذا الخط.
    3. ضع علامة على خط خلفي مواز من 8 سم إلى 10 سم تقريبا من الشق الأمامي على طول محور عظم الفخذ ليشمل عرض السديلة. ضع علامة على الحافة البعيدة للرفرف عند الرضفة الجانبية.
    4. ابدأ التشريح عند الهامش البعيد عند الرضفة بشق حاد في الجلد باستخدام مشرط. تعميق شق الجلد مع الكي من خلال الأنسجة تحت الجلد حتى تصادف اللفافة التي تغطي الفخذ المستقيم.
    5. استمر في شقوق الجلد باتجاه ASIS على طول الحدود الأمامية والخلفية الموضحة أعلاه. لعزل السديلة اللفافة وحدها، قم بإزالة مكون الجلد المغطي من الطبقة اللفافة الأساسية. ربط أو كي أي أوعية ثقب صغيرة على الجلد.
    6. العودة إلى الحدود البعيدة للرفرف وشق اللفافة العميقة للسماح بتعبئة العضلة الوعائية الجانبية الكامنة. تعبئة الواجهة نحو مؤشر الإجهاد الزراعي.
    7. أثناء التعبئة ، حدد عنيق الأوعية الدموية الخارجة من بين الأوعية الدموية الجانبية وعضلات الفخذ المستقيمة (الشكل 2 ب). احرص على تجنب الجر المفرط حتى لا تجرح أوعية عنيق.
    8. تشريح الجانب القريب من ASIS مع حماية عنيق الأوعية الدموية. تشريح حتى يتم تعبئة رفرف بما فيه الكفاية حول عنيق لها.
    9. تتبع عنيق نحو الأوعية الفخذية العميقة. الهيكل العظمي لكل من الشريان الفخذي المحيطي الجانبي والوريد الذي يزود السديلة اللفافة. ثم يقسم Ligate كلا الوعاءين بالقرب من بعضهما البعض حيث ينضمان إلى الأوعية الفخذية العميقة.
    10. قم بتهوية أوعية عنيق بشكل فردي باستخدام قسطرة وعائية من 20 جم إلى 24 جم ، مثبتة برباط حريري 3-0. اغسل محلول ملحي هيباريني (15 وحدة دولية / مل) في القنية الشريانية السديلة حتى يلاحظ تدفق وريدي واضح.
  4. رفرف الساعد الكعبري
    ملاحظة: يعتمد البروتوكول أدناه على وصف منشور لنموذج رفرف الساعد الشعاعي الخنزير بواسطة Khachatryan et al.20.
    1. ضع الخنزير على طاولة العمليات في وضع الاستلقاء الجانبي. ضع الطرف الأمامي التابع داخل مجال الجراحة.
    2. ضع علامة على مربع رفرف الجلد التقريبي 3 سم × 3 سم على الساعد الكعبري. ارسم خطا بين نقطة المنتصف لهامش السديلة القريب والحفرة قبل المكعبة للدلالة على المسار التقريبي لعنيق الشريان الكعبري. تأكيد مسار الشرايين مع الجس.
      ملاحظة: في نموذج الخنازير ، توجد الأوعية الشعاعية أعمق نسبيا من البشر. موقعهم بين العضلة المثنية الشعاعية و brachioradialis.
    3. شق الجلد باستخدام مشرط في الجانب البعيد بعمق يصل إلى اللفافة قبل العضدية. تشريح حاد مع مقص بضع الوتر حتى يتم مواجهة الشريان الكعبري البعيد واثنين من الوريد comitantes. ربط الشريان والأوردة مع الروابط الجراحية بشكل فردي وتقسيمها.
    4. استمر في شقوق الجلد على الحواف الشعاعية والزندية لمربع الجلد المحدد. قم بتعبئة السديلة من العظم الكعبري الأساسي بشفرة جراحية تنطلق من اتجاه شعاعي إلى اتجاه الزندي مع رفع رفرف الجلد بالقرب من الحفرة قبل المرفقية.
      ملاحظة: حافظ على مستوى تشريح تحت اللفافة من أجل ضمان بقاء عنيق الشريان الكعبري مرتبطا بالطبقة الجلدية العلوية.
    5. عند الحافة القريبة ، اسحب المسافة بين العضدية الشعاعية والعضلة الشعاعية المثنية مع ضالم ذاتي الاحتفاظ لفضح الشريان الكعبري القريب والوريدات المصاحبة (الشكل 2C).
    6. باستخدام مقص بضع الوتر ، قم بهيكلة الشريان الكعبري والوريد بالقرب من الحفرة قبل المكعبة حيث ينضمون إلى الشريان العضدي والأوردة ، على التوالي. تشريح الأوعية من الأنسجة الدهنية الليفية المحيطة لتحقيق طول عنيق كاف من حوالي 5-6 سم. ربط وتقسيم الشريان والوريد بشكل منفصل لتحرير رفرف الساعد الكعبري.
    7. قنية الأوعية عنيق مع 20 غرام إلى 24 غرام قسطرة ، مؤمنة مع 3-0 أربطة الحرير. اغسل محلول ملحي بالهيبارين (15 وحدة دولية / مل) في القنية الشريانية السديلة حتى يلاحظ تدفق وريدي واضح.
    8. بعد شراء السديلة ، احتفظ باللوحات في محلول ملحي بارد عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة لإزالة الخلايا. تحت التخدير العميق إيزوفلوران ، القتل الرحيم للحيوانات بالحقن الوريدي لكلوريد البوتاسيوم (100 ملغم / كغم IV). تأكيد الوفاة بسبب عدم وجود علامات حيوية.

figure-protocol-11482
الشكل 2: شراء ثلاث لوحات وعائية خنزير . (أ) الثرب. يتم تقليب الشرايين المعدية الصبغية اليمنى (i) واليسرى (ii) في السديلة omental (iii). (ب) لفافة الموترة. عنيق السديلة (iv) هو الفرع الصاعد للشريان المحيطي الفخذي الجانبي (v). ج: رفرف الساعد الكعبري. يعتمد شراء سديلة الساعد الكعبرية (vi) على الشريان الكعبري والوريد (vii) كعنيق وعائي (ملاحظة: تم حذف الستائر لأغراض التوضيح). قضبان المقياس: 3 سم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. إعداد نظام إزالة الخلايا

  1. قم بتجميع غرفة الأنسجة مع اللوحات في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الرقائقي.
  2. قم بتوصيل محبس ثلاثي الاتجاهات بكل من منافذ التدفق والتدفق الخارجي للمفاعل الحيوي. قم بتوصيل مرشح 0.2 ميكرومتر بمنفذ فتحة التهوية على غطاء حجرة الأنسجة. قم بتجهيز أنبوب التدفق بمحلول ملحي معقم من الهيبارين للتخلص من فقاعات الهواء.
  3. ضع اللوحات في الغرفة. باستخدام مرقئ معقم ، قم بتوصيل اللوحات بأنبوب التدفق باستخدام موصل Luer الذكر. قم بربط القنية الشريانية المعنية لكل رفرف على ذكر Luer وتأكد من إحكام الختم.
  4. اغسل محلول ملحي هيبارين من خلال محبس للتحقق من أن وصلة Luer خالية من التسريبات وأن اللوحات يمكن أن تتخلل مع دليل على التدفق الوريدي. أغلق غطاء حجرة الأنسجة.
  5. قم بتوصيل أنبوب التدفق بأنبوب مضخة أصفر ثلاثي التوقفات بمحبس التدفق في حجرة الأنسجة. أيضا ، قم بتوصيل محول مستشعر ضغط مضمن بمحبس التدفق ثلاثي الاتجاهات للسماح بمراقبة ضغط التروية.
  6. قم بتشغيل مضخة التدفق التمعجية. في الشاشة الأولية ، انتقل إلى علامة التبويب الثالثة باستخدام مفتاح السهم لتعيين معرف الأنبوب على 1.85 مم. بعد ذلك ، انتقل إلى علامة التبويب الثانية لتعيين معدل التروية. معدل الإدخال كطريقة التسليم وضبطه على 2 مل / دقيقة. تأكد من صحة اتجاه التدفق كما هو معروض على الشاشة. قم بتحميل أنبوب المضخة ثلاثي التوقفات بالمضخة التمعجية باستخدام علبة متوافقة.
  7. كرر الإجراء الخاص بالمضخة التمعجية للتدفق الخارجي المشابه لما ورد أعلاه. اضبط إعداد مضخة التدفق الخارجي على معدل 4 مل / دقيقة. قم بتوصيل أنبوب التدفق الخارجي بأنبوب مضخة أصفر ثلاثي التوقفات بمحبس التدفق الخارجي لغرفة الأنسجة. قم بتحميل أنبوب المضخة ثلاثي التوقفات بالمضخة التمعجية باستخدام علبة متوافقة. ابدأ التدفق لكلتا المضختين بالضغط على زر الطاقة .
    ملاحظة: يعد المعدل الأعلى لمضخة التدفق الخارجي إجراء أمان حاسما لمنع التدفق الزائد لغرفة الأنسجة ، مما يضمن أن تدفق الغرفة يتجاوز دائما التدفق أثناء عملية إزالة الخلايا. تم تصوير إعداد إزالة الخلايا المجمع بالكامل في الشكل 3.

figure-protocol-14274
الشكل 3: نظام إزالة خلايا التروية المجمع . (أ) رسم تخطيطي لنظام إزالة الخلايا بالتروية. يحمل أنبوب التدفق مادة perfusate من خزان المنظف إلى حجرة الأنسجة بطريقة أحادية المسار مع مراقبة مستشعر الضغط. يزيل أنبوب التدفق الخارجي البيرفوسات بنشاط من حجرة الأنسجة إلى حاوية النفايات. تشير الأسهم السوداء إلى اتجاه تدفق التروية. يتم استخدام مضخة تمعجية مع المضخة اليسرى للتحكم في التدفق. تتم إزالة التدفق الخارجي بنشاط باستخدام مضخة تمعجية ثانية من خلال الأنبوب المعني. الشكل الذي تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com. (ب) صورة لنظام إزالة الخلايا بالتروية المجمعة على سطح الطاولة مع مضخة التدفق التمعجية (i) متصلة بغرف الأنسجة (ii) ثم المضخة التمعجية ذات التدفق الخارجي (iii). تتم مراقبة ضغط تدفق perfusate باستخدام مستشعر الضغط في الخط (iv) قبل دخول غرفة الأنسجة. هنا ، يتم إزالة ثلاث لوحات بالتوازي. كل من المنظفات وخزانات النفايات موجودة أسفل سطح الطاولة ولم يتم تصويرها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. إزالة الخلايا من اللوحات الخنازير

  1. نفذ جميع الخطوات التالية لإزالة الخلايا من التروية في درجة حرارة الغرفة. للحصول على ملخص لمعدلات الإرواء ومدده ، انظر الجدول 1. ابدأ تروية محلول ملحي بالهيبارين بمعدل 2 مل / دقيقة باستخدام مضخة تمعجية وقم بتخلل اللوحات بمحلول ملحي هيبارين في حجرة الأنسجة لمدة 15 دقيقة لإزالة أي جلطات دموية محتجزة.
  2. عند الانتهاء من نضح محلول ملحي هيبارين ، قم بشفط محلول ملحي متبقي في غرفة الأنسجة. املأ حجرة الأنسجة بحوالي 500 مل من محلول إزالة الخلايا SDS لغمر السديلة بشكل كاف.
  3. انقل أنبوب التدفق إلى محلول إزالة الخلايا SDS وقم بتخلل الأنسجة بمعدل 2 مل / دقيقة. تختلف مدة التروية حسب السديلة. perfuse SDS لمدة 2 أيام للثرب ، 3 أيام للفافة الموتر ، و 5 أيام لرفرف اللفافة الجلدية الساعد الكعبري.
  4. عند الانتهاء من إزالة الخلايا SDS ، استنشاق SDS perfusate الموجودة داخل غرفة الأنسجة. انقل أنبوب التدفق إلى محلول 1x PBS وقم بتدوير اللوحات لمدة يوم واحد بمعدل 2 مل / دقيقة.
  5. قم بإزالة حل PBS السابق ونقل أنبوب التدفق إلى محلول عمل DNase. بيرفيوز لمدة 2 ساعة بمعدل 2 مل / دقيقة. قم بإزالة محلول DNase من غرفة الأنسجة وضع أنبوب التدفق في محلول 1x PBS. اغمر الأنسجة بمحلول 1x PBS في الغرفة وقم بإذابة محلول 1x PBS لمدة يوم واحد بمعدل 2 مل / دقيقة.
  6. تعقيم اللوحات بمحلول PAA / EtOH. انقل أنبوب التدفق إلى PAA / EtOH في محلول dH2O واغمر الأنسجة في نفس المحلول. أداء PAA / EtOH عند 2 مل / دقيقة لمدة 3 ساعات. بمجرد اكتمال تعقيم PAA / EtOH ، افصل الأنبوب عن المحبس ثلاثي الاتجاهات.
  7. قم بإزالة اللوحات باستخدام تقنية معقمة ووضع الأدوات المعقمة في PBS التي تحتوي على 1٪ من المضادات الحيوية / مضادات الميكروبات (A / A). اغمر اللوحات مع PBS + 1٪ A / A لمدة 15 دقيقة في غسلتين منفصلتين لتحييد الحمض المتبقي تماما. احتفظ باللوحات في PBS + 1٪ A / A عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة لإعادة الخلوية.
  8. تحقق من عقم السقالات عن طريق إجراء ثقافة مسحة على ألواح أجار وفحص نمو الميكروبات. تلقيح لوحات أجار مع مسحات مأخوذة من كل سطح رفرف. استزرع ألواح الآجار عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. يتجلى العقم من خلال عدم وجود نمو مستعمرة ميكروبية.

الجدول 1: ملخص معلمات بروتوكول التروية - إزالة الخلايا. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

6. تقييم إزالة الخلايا

  1. باستخدام خزعة مثقوبة ، قم بشراء عينات بسمك 3 مم إلى 10 مم من اللوحات.
  2. بالنسبة للأنسجة ، قم بإصلاح الخزعات في أشرطة نسيجية في الفورمالين العادي لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. اغسل أشرطة الخزعة في الماء أو PBS لمدة 15 دقيقة ثم ضعها في 70٪ من الإيثانول حتى تصبح جاهزة لمعالجة الأنسجة. معالجة الكاسيت في معالج الأنسجة وفقا للبروتوكولات القياسية.
  4. قم بتضمين الخزعات في البارافين ، مما يسمح للشمع بالتصلب لمدة 10-15 دقيقة على طبق بارد. قسم كتل البارافين على ميكروتوم إلى سمك 5 ميكرومتر. قم بتلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) وفقا للبروتوكولات القياسية. صورة شرائح الأنسجة مع المجهر الضوئي.
  5. لتحديد كمية محتوى الحمض النووي ، احصل على الوزن الجاف لخزعات الأنسجة بعد تجفيف الأنسجة طوال الليل في فرن عند 60 درجة مئوية. هضم العينات في مخزن مؤقت لاستخراج غراء عند 65 درجة مئوية طوال الليل. أجهزة الطرد المركزي للعينات المهضومة بسرعة 10000 × جم ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. فحص محتوى الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يعتمد هذا البروتوكول لإزالة الخلايا من اللوحات الخنازير الوعائية على تروية منظف قائم على الأيونات ، SDS ، من خلال الأوعية الدموية السديلة في مفاعل حيوي مخصص للتروية. قبل إزالة الخلايا ، تم شراء ثلاث لوحات وعائية في نموذج خنزير وقناتها وفقا لأوعية الإمداد الرئيسية. تم مسح اللوحات على الفور ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يستخدم البروتوكول المقترح نضح SDS منخفض التركيز لإزالة الخلايا من مجموعة من اللوحات المشتقة من الخنازير. مع هذا الإجراء ، يمكن إزالة الثرب اللاخلوي ، واللفافة الموترة ، واللوحات الساعدية الكعبرية بنجاح باستخدام بروتوكول يفضل SDS منخفض التركيز. حددت تجارب التحسين الأولية أن SDS بتركيز منخفض (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

اي

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm pore Acrodisk FilterVWRCA28143-310
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)BaxterJF7123
20 L Polypropylene CarboyCole-ParmerRK-62507-20
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical TieCovidien LS639
3-way StopcockCole-ParmerUZ-30600-04
Adson ForcepsFine Science Tools11027-12
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100XWisent450-115-EL
Atropine Sulphate 15 mg/30mlRafter 8 Products238481
BD Angiocath 20-GaugeVWRBD381134
BD Angiocath 22-GaugeVWRBD381123
BD Angiocath 24-GaugeVWRBD381112
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901DNAse Co-factor
DNase I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)InvitrogenP7589
DPBS, 10XWisent311-415-CL without Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools13008-12
Heparin, 1000 I.U./mLLeo Pharma A/S453811
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 mlBimeda-MTC Animal Health Inc.612316
Ismatec Pump Tygon 3-Stop TubingCole-ParmerRK-96450-40Internal Diameter:  1.85 mm
Ismatec REGLO 4-Channel PumpCole-Parmer78001-78
Ismatec Tubing CassettesCole-ParmerRK-78016-98
Isoflurane 99.9%, 250 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.2231929
LB Agar LennoxBioshop CanadaLBL406.500Sterility testing agar plates
Magnesium SulfateSigma-AldrichM7506DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 TubingCole-ParmerRK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.2242905
Monopolar Cautery PencilValleylabE2100
Normal Buffered Formalin, 10%Sigma-AldrichHT501128
N°11 scalpel bladeSwann Morton303
Papain from papaya latexSigma-AldrichP3125
Peracetic AcidSigma-Aldrich269336
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube IDMcMaster-Carr5117K61
Plastic Barbed Tube 90° Elbow ConnectorsMcMaster-Carr5117K76
Plastic Quick-Turn Tube PlugsMcMaster-Carr51525K143Male Luer
Plastic Quick-Turn Tube SocketsMcMaster-Carr51525K293Female Luer
Punch Biopsy ToolIntegra Miltex3332
Potassium Chloride 40 mEq/20 mlHospira Healthcare Corporation37869
Povidone-Iodine, 10%Rougier833133
Serological Pipet, 2mLFisher Science13-678-27D
Snap Lid Airtight ContainersSnapLock142-3941-4
Sodium Dodecyl Sulfate PowderSigma-AldrichL4509
Surgical Metal Ligation Clips, SmallTeleflex001200
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straightB. BraunBC004R
TruWave Pressure Monitoring SetEdwards LifesciencesPX260

References

  1. Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
  2. Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
  3. Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651(2018).
  4. Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
  5. Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
  6. Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
  7. Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823(2016).
  8. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  9. Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
  10. Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
  11. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  12. Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
  13. Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
  14. Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
  15. Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
  16. Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
  17. Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
  18. Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
  19. Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
  20. Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
  21. Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
  22. Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
  23. Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
  24. Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447(2020).
  25. Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
  26. Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
  27. Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677(2022).
  28. Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
  29. Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557(2022).
  30. Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394(2011).
  31. Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271(2015).
  32. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  33. Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
  34. Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved