تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

Summary

تقنية التقشير هي طريقة تحضير شبكة cryo-EM التي تسمح بفصل العينات البيولوجية متعددة الطبقات والمركزة إلى طبقات مفردة لتقليل السماكة وزيادة تركيز العينة وتسهيل معالجة الصور.

Abstract

تقنية تحضير شبكة التقشير والبقع cryo-EM هي طريقة حقن عكسي معدلة بشكل كبير بهدف تحقيق تقليل في طبقات العينات متعددة الطبقات. يمكن أن تساعد إزالة الطبقات قبل التجميد بالغطس في تقليل سمك العينة إلى مستوى مناسب لجمع بيانات cryo-EM ، وتحسين تسطيح العينة ، وتسهيل معالجة الصور. تسمح تقنية التقشير بفصل الأغشية متعددة الصفائح إلى طبقات مفردة ، وبلورات 2D ذات الطبقات إلى بلورات فردية ، وهياكل مكدسة تشبه الصفيحة من البروتينات القابلة للذوبان ليتم فصلها بالمثل إلى طبقات مفردة. غالبا ما يطرح سمك العينة العالي لهذه الأنواع من العينات مشاكل لا يمكن التغلب عليها لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة صور cryo-EM ، خاصة عندما يجب إمالة مرحلة المجهر لجمع البيانات. علاوة على ذلك ، يمكن إعداد شبكات ذات تركيزات عالية من أي من هذه العينات لجمع البيانات بكفاءة حيث يمكن زيادة تركيز العينة قبل إعداد الشبكة وتعديل تقنية التقشير لطخة لتؤدي إلى توزيع كثيف للعينة أحادية الطبقة.

Introduction

تم تطوير تقنية التقشير من أجل فصل البلورات ثنائية الأبعاد المكدسة من البروتينات الغشائية إلى طبقات مفردة للحصول على عينات رقيقة مناسبة لجمع البيانات cryo-EM 2D و 3D وتسهيل معالجة الصور¹. البروتوكول مناسب بالمثل لأنواع أخرى من العينات متعددة الصفائح وكذلك لتحقيق تركيزات عالية للعينات من أي نوع عينة على الشبكة دون زيادة السماكة في Z.

يتم تقليل طبقات العينة إلى طبقة واحدة من خلال تطبيق مزيج من الضغط الشعري وقوى القص في بروتوكول يمتد بشكل كبير ويعدل طريقة الحقن الخلفي². تؤدي خطوة النشاف الأولى إلى شطيرة ضيقة والالتزام بفيلم الكربون وشريط شبكي على جانبي العينة متعددة الطبقات أثناء النشاف على الميكرون الفرعي بدلا من حجم مسام ورق الترشيح 20-25 ميكرومتر في طريقة الحقن الخلفي. يحدث فصل أو تقشير طبقة فردية عند فرض فصل الطبقات المحصورة بمجرد ضغط الشبكة عموديا على قطرة تريهالوز ، مما يجبر فيلم الكربون بعيدا عن شريط الشبكة (الشكل 1). يحدث تغيير موضع فيلم الكربون بعيدا عن نقطة الاتصال الأصلية مع شريط الشبكة في الخطوة التالية ، عندما يتم مسح الشبكة مرة أخرى على ورق ترشيح submicron. يمكن تحسين عدد التكرارات لهذه الخطوات لعينات محددة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام البروتوكول لزيادة تركيزات العينات مع تجنب التجميع في Z. نظرا للاعتماد على الالتزام بشريط الشبكة وفيلم الكربون بالإضافة إلى الفصل القسري ، قد لا يكون هذا النهج مناسبا للجزيئات شديدة الهشاشة مثل بعض البروتينات الحساسة و / أو غير المستقرة ومجمعات البروتين.

لا تتطلب تقنية التقشير معدات متخصصة ولا إمدادات باهظة الثمن. غير أن قابلية التطبيق على عينات محددة ستتطلب اعتبارات متأنية للبارامترات البيولوجية. القرار أسهل بالنسبة لبلورات 2D حيث أن فيلم الكربون مطلوب لضمان التسطيح ، ومع ذلك فإن التلاعب عبر تقنية التقشير قد يؤثر على السلامة البيولوجية للعينة أو الترتيب البلوري. تقتصر ملاءمة تقنية التقشير واللطخة للجسيمات المفردة على تلك التي تتطلب طبقة كربونية ومستقرة للتلاعب. قد لا تكون العينات ذات التفاعلات البيولوجية الحرجة بين الطبقات مناسبة للتوصيف بمساعدة تقنية التقشير بسبب تعطيل مثل هذه التفاعلات.

يتم تحسين تقنية التقشير ("التقشير اللطخ") بسرعة أكبر عن طريق الاختبار والفحص باستخدام البقع السلبية أو العينات غير الملوثة بواسطة TEM في درجة حرارة الغرفة. بمجرد تحديد العدد الأمثل لتكرارات التقشير ، يمكن تحديد وقت التحكم في السماكة قبل التزجيج.

Protocol

1. خطوات التحضير لتقنية التقشير

ملاحظة: يتطلب التحضير وضع العناصر التالية بجوار بعضها البعض.

1. قم بتكديس قطعتين من ورق الترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
2. ضع فيلم بارافين بطول ~ 8 سم × 10 سم بجوار ورق الترشيح بحيث يكون الورق متجها لأعلى.
3. ضع قطعة من ورق الترشيح submicron فوق قطعتين إضافيتين من ورق الترشيح # 4 (الشكل 1-1).
4. ضع الملقط المضاد للشعيرات الدموية بحيث تكون الساق المثنية متجهة لأعلى والساق المستقيمة متجهة لأسفل. بعد ذلك ، حدد شبكة 600 شبكة مع الجانب الأملس / اللامع لأعلى. ضع الملقط على طبق بتري أو أي سطح مرتفع آخر لتجنب ملامسة الشبكة النظيفة مع العناصر الأخرى.
5. قم بإزالة الورق من فيلم البارافين واسحب الجوانب (~ 5 مم) لإنشاء حافة صغيرة. ماصة قطرتان 150 ميكرولتر من محلول تريهالوز 4٪ ~ 1-2 سم من جانب قصير من فيلم البارافين و ~ 1 سم على فيلم البارافين.
6. على مقعد منفصل أو على الأرض ، صب النيتروجين السائل في وعاء صغير من رغوة البوليسترين (انظر جدول المواد).
   تنبيه: تلقي التدريب على التعامل السليم باستخدام القفازات ودرع الوجه من أجل تجنب لدغة الصقيع.
7. ضع حاوية شبكة cryo-EM صغيرة في النيتروجين السائل وقم بتغطية حاوية رغوة البوليسترين بمناديل خالية من النسالة.

2. وضع فيلم الكربون على الشبكة

1. استخدم ملقط Dumont # 5 (انظر جدول المواد) لتعويم فيلم الكربون من الميكا عن طريق لمس جانب واحد من الميكا بزاوية طفيفة لأسفل (~ 20 درجة -40 درجة) على إحدى قطرات محلول تريهالوز واترك توتر الماء يرفع ببطء فيلم الكربون عن طريق تحريك الميكا لأسفل. حرر الميكا بمجرد أن يطفو فيلم الكربون على سطح القطرة.
2. افحص بصريا فيلم الكربون لتجنب استخدام الكربون مع تلف في شكل كسور.
3. أدخل الشبكة التي يحملها الملقط المضاد للشعيرات الدموية بزاوية (~ 20 درجة -30 درجة) في قطرة تريهالوز في موضع مجاور ، ثم تركزت تحت فيلم الكربون. التقط فيلم الكربون (الشكل 1-2).
4. حافظ على الشبكة في نفس الاتجاه وقم بخفضها ببطء على سطح القطرة الثانية من trehalose دون كسر التوتر السطحي للقطرة لإزالة فيلم الكربون غير الضروري الذي قد يكون ملفوفا حول حافة الشبكة إلى الجانب الخشن.

3. فصل بلورات 2D متعددة الطبقات إلى طبقات واحدة

1. قم بتدوير الملقط المضاد للشعيرات الدموية (انظر جدول المواد) وضعه على طبق بتري بحيث يكون الجانب الكربوني للشبكة متجها لأسفل (الشكل 1-3).
2. ماصة 1.3 ميكرولتر من العينة في الغضروف المفصلي trehalose طفيف على قمة الشبكة. ماصة الحل ~ 8-10 مرات لخلط وتوزيع trehalose والعينة على جانبي الشبكة.
3. أثناء احتضان المحلول لمدة دقيقة واحدة ، ماصة واحدة أو أكثر من قطرات 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز على فيلم البارافين.
4. قم بتدوير الشبكة مرة أخرى إلى موضعها الأصلي مع توجيه فيلم الكربون لأعلى.
5. استخدم الملقط المضاد للشعيرات الدموية للضغط على الشبكة على ورقة الترشيح تحت الميكرون (الشكل 1-4). بمجرد امتصاص المحلول بواسطة ورقة الترشيح ويكون فيلم الكربون مسطحا ، انتظر لمدة 3 ثوان قبل رفع الشبكة وتحريكها عموديا على قطرة 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز (الشكل 1-5).
   ملاحظة: كرر هذه الخطوة عدة مرات للعينات المكدسة للغاية، أو يتم إعداد الشبكة للتزجيج في الخطوات التالية.
6. امسح الشبكة على قطعتي ورق الترشيح ، ثم ارفع الشبكة من ورق الترشيح (الشكل 1-6). بعد حوالي 13 ثانية ، اعتمادا على الرطوبة والمخزن المؤقت للعينة ، قم بغمر الشبكة في النيتروجين السائل في حاوية الستايروفوم الصغيرة ووضع الشبكة في حاوية شبكة cryo-EM أو نقلها مباشرة لفحص cryo-EM أو جمع البيانات.
   ملاحظة: من أجل تحسين البروتوكول بسرعة ، قم بتلطيخ الشبكة المقشرة بشكل سلبي في هذه الخطوة بدلا من إغراقها في النيتروجين السائل. قم بتلطيخ العينة سلبا عن طريق تطبيق 3 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل بنسبة 1٪ على الشبكة ، واحتضان الشبكة لمدة 30 ثانية ، وصمة عار بقطعة ممزقة من ورق ترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر. يتم غمر شبكات بلورات ثنائية الأبعاد المزججة في التريهالوز أو التانين أو الجلوكوز يدويا بشكل روتيني للتزجيج حيث يمنع التريهالوز والتانين والجلوكوز تكوين الجليد البلوري بمعدلات تستخدم للغطس اليدوي².

النتائج

ستؤدي تجربة التقشير الناجحة إلى طبقات مفردة من العينات بتركيزات عالية في كثير من الأحيان. من المتوقع أن تظل بعض المناطق في معظم مربعات الشبكة تحتوي على طبقات متعددة ، خاصة عند عدد أقل من التكرارات لخطوات التقشير. ومع ذلك ، فإن غالبية مربعات الشبكة ستحتوي على مناطق واسعة من الطبقات المفردة ...

Discussion

تعد لطخة التقشير طريقة قوية للتغلب على تكديس وسمك بلورات 2D متعددة الطبقات وعينات مماثلة لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة الصور. سيعتمد قرار استخدام لطخة التقشير على المعلمات البيولوجية للعينة وسيتطلب أيضا تقييما بمجرد توفر نموذج 3D cryo-EM. وستكون الأهمية البيولوجية للمخالطين والمرونة المحتملة لمن?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.