نموذج تجريبي لاحتشاء عضلة القلب لدراسة إصلاح القلب وإعادة تشكيله في الفئران بالضربة القاضية

Summary

هنا ، نصف نموذجا تجريبيا لاحتشاء عضلة القلب ، وإجراء تخطيط صدى القلب لدراسة إعادة تشكيل القلب ووظيفته ، وإجراءات تحديد التليف والتضخم في أقسام picrosirius الملطخة باللون الأحمر والملطخة بالرودامين ، بالإضافة إلى حجم الاحتشاء ومؤشر التمدد في الشرائح الملطخة بثلاثية الألوان من Masson.

Abstract

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الأكثر انتشارا للوفاة في الدول الغربية ، حيث يكون احتشاء عضلة القلب الحاد (MI) هو الشكل الأكثر انتشارا. تصف هذه الورقة بروتوكولا لدراسة دور الجالكتين 3 (Gal-3) في التطور الزمني للشفاء القلبي وإعادة تشكيله في نموذج حيواني تجريبي ل MI.

تشمل الإجراءات الموصوفة نموذجا تجريبيا ل MI مع رباط تاجي دائم في ذكور C57BL / 6J (تحكم) و Gal-3 بالضربة القاضية (KO) ، وإجراء تخطيط صدى القلب لدراسة إعادة تشكيل القلب والوظيفة الانقباضية في الجسم الحي ، وتقييم نسيجي لتليف عضلة القلب الخلالي مع أقسام ملطخة بالليكتين الملطخة باللون الأحمر والرودامين لدراسة تضخم الخلايا العضلية بواسطة منطقة المقطع العرضي (MCSA) ، والقياس الكمي لحجم الاحتشاء وإعادة تشكيل القلب (ترقق الندبة ، وسمك الحاجز ، ومؤشر التمدد) عن طريق قياس المسطح في شرائح ملطخة بكلوريد ثلاثي الألوان ثلاثي الألوان وثلاثي فينيل تيترازوليوم من Masson. غال-3 أظهرت الفئران KO المصابة ب MI تعطل في إعادة تشكيل القلب وزيادة في نسبة ترقق الندبات ومؤشر التمدد. في بداية MI ، تأثرت وظيفة عضلة القلب وإعادة تشكيل القلب بشدة. في 4 أسابيع بعد MI ، تأثر أيضا التطور الطبيعي للتليف في فئران Gal-3 KO المصابة بالاحتشاء.

باختصار ، يعد النموذج التجريبي ل MI نموذجا مناسبا لدراسة التطور الزمني لإصلاح القلب وإعادة تشكيله في الفئران مع الحذف الجيني ل Gal-3 والنماذج الحيوانية الأخرى. يؤثر نقص Gal-3 على ديناميكيات إصلاح القلب ويعطل تطور إعادة تشكيل القلب ووظيفته بعد MI.

Introduction

احتشاء عضلة القلب (MI) هو الشكل الأكثر انتشارا لأمراض القلب والأوعية الدموية. بعد MI ، يخضع عضلة القلب لتغييرات مورفولوجية ووظيفية متسلسلة ، بما في ذلك التئام منطقة احتشاء MI ، وإعادة تشكيل البطين (VR) ، وضعف عضلة القلب¹. شفاء MI هو عملية ديناميكية ومنسقة جيدا مرتبطة بتسلل التهابي عميق ينتهي بتكوين ندبة ليفية^2،3. يستخدم النموذج التجريبي ل MI في الفئران حاليا لدراسة إعادة تشكيل القلب في ظل الظروف المرضية^4،5 ، والوعي بالبروتوكول الجراحي الدقيق ضروري لتطوير إجراء قابل للتكرار وفعال لتحفيز رباط الشريان التاجي الدائم. هذه الطريقة ضرورية لدراسة شفاء MI وأهميته في التطور الزمني لإعادة تشكيل البطين الأيسر (LVR) والخلل الوظيفي القلبي المرتبط ب MI.

الجالكتين عبارة عن مجموعة من الليكتين التي تتعرف على كربوهيدرات معينة في الروابط داخل الخلايا ومستقبلات الغشاء والبروتينات السكرية خارج الخلية. Galectin 3 (Gal-3) هو عضو في هذه العائلة يعمل من خلال التعرف على N- و O-glycans والربط المتبادل في الجليكوكونجوجات على سطح الخلية ، ويتم التعبير عنه على نطاق واسع في الجهاز المناعي⁶. بحثت الدراسات السابقة في دور Gal-3 كمنظم للالتهاب والتليف في أمراض القلب والأوعية الدموية^{7،8،9،10،11،12}. نظرا لأن استهداف العوامل التنظيمية للالتهاب أثناء الشفاء مهم للغاية لأن الالتهاب يمكن أن يؤثر بشكل ملحوظ على تطور إعادة التشكيل ، فقد هدفنا إلى وصف بروتوكول لدراسة التطور الزمني لإعادة تشكيل البطين بعد MI وخطوات وطرق تحديد كيفية تعديل الطفرة الجينية ل Gal-3 التطور الزمني للشفاء في MI وتؤثر على إعادة تشكيل القلب ووظيفته في الفئران.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية وأبحاث بجامعة بوينس آيرس (CICUAL) ، بما يتماشى مع لجنة المجلس الوطني للبحوث (الولايات المتحدة) لتحديث دليل رعاية واستخدام المختبر¹³. بالنسبة للتجارب ، استخدم الفئران الذكور المتطابقة مع العمر C57BL / 6J و Gal-3 KO (8-10 أسابيع) التي تزن 30-35 جراما ، مما يسمح بمعالجة أفضل للجراحة. اسمح للحيوانات بالوصول إلى الماء والغذاء بشكل خاص. تم تربية الفئران Gal-3 KO على خلفية C57BL / 6J في نفس مرافق الموارد الحيوية مثل فئران التحكم C57BL / 6J.

1. المنطقة والأدوات الجراحية

1. قبل بدء الجراحة ، تحقق من توصيل جهاز التنفس الصناعي بمصدر طاقة ويعمل بشكل صحيح. تأكد من وجود محلول مخدر كاف. تحضير المحلول في يوم الجراحة عن طريق حساب عدد المراد استخدامها.
2. تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية ، بما في ذلك المقص غير القابل للصدأ ، والمقص الدقيق ، وحاملات الإبر للإبر الكبيرة والصغيرة ، والمباعدات ، والملقط الحاد الإضافي والمنحني ، والملقط المسنن ، والملقط الأنسجة. نظف منطقة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. تأكد من توافر كرات قطنية صغيرة ، وزوفا ، وشاش للكي الفوري لأي نزيف محتمل.
4. حافظ على خيوط الحرير المضفرة المغلفة بالسيليكون من 10-0 إلى 7-0 جاهزة لرباط الشريان التاجي الهابط الأيسر (LDA) ، وخياطة من النايلون لإغلاق الصدر ، وخيط الكتان لإغلاق الجلد.

2. التخدير والتنبيب

1. قم بوزن الفئران لتحديد جرعة التخدير.
2. قم بتسخين وسادة التدفئة المحاطة بقاعدة من الستايروفوم إلى 40 درجة مئوية.
3. تخدير الفئران بإعطاء 0.1 مل / 10 جم من وزن الجسم في العضل لمحلول يحتوي على الكيتامين (65 مجم / كجم) ، زيلازين (13 مجم / كغ) ، وأسيبرومازين (1.5 مجم / كجم).
4. بمجرد تخدير الفأر وقبل البدء في العملية الجراحية ، تحقق من عمق التخدير عن طريق إحداث محفز مؤلم قليلا ، مثل الضغط على القدمين بالأصابع. إذا استجاب للمحفز ، فاضبط عمق التخدير.
5. ضع الماوس في الاستلقاء الظهري ، وقم بلصق ساقيه على قاعدة العمل فوق وسادة التسخين ، ووضعه تحت مجهر استريو مجهر. قم بتمديد الرقبة بخيط يحمل أسنان الفك العلوي المتصلة بقاعدة العمل.
6. بعد ذلك ، بالنسبة لجزء التنبيب ، قم بكشف حلقات القصبة الهوائية من خلال شق بسيط في الرقبة ، وقم بالتوجيه من خلالها باستخدام قسطرة وريدية 20 جم متصلة بجهاز التنفس الصناعي للقوارض (حجم المد والجزر: 250 مل / سكتة دماغية) بتردد تنفسي يتراوح من 34-38 دورة / دقيقة ، كما هو موضح سابقا¹⁴.
7. ضع في الاستلقاء الجانبي لإجراء بضع الصدر الجانبي الأيسر في الفضاء الوربي الرابع أو الخامس. قم بعمل شق في جلد. راقب العضلات أدناه ، وانشرها بعناية لفصلها عن الجدار الصدري لرؤية المساحة الوربية بوضوح. في هذه المرحلة ، تأكد من توصيل بشكل صحيح بجهاز التنفس الصناعي ؛ بعد ذلك ، افتح المساحة الوربية عن طريق عمل ثقب بالملقط الحاد الإضافي.
   ملاحظة: يجب التعرف على LDA على طول جدار البطين الأيسر الحر (LV) في المساحات الوربية المذكورة أعلاه.
8. إجراء استئصال التامور ، وتحديد LDA عن طريق تباين الشرايين التاجية مع الأوردة التاجية وتشعب LDA أسفل الأذن الأيسر. ثم قم بإجراء ربط LDA باستخدام 8-0 خيط الحرير ~ 2 مم من حافة الأذن. أخيرا ، أغلق الصدر بطبقات باستخدام خيط الحرير 6-0 - أغلق الأضلاع ، مع التأكد من عدم وجود استرواح الصدر بالداخل (افعل ذلك بعناية عن طريق إجبار الرئتين على التمدد باستخدام جهاز التنفس الصناعي) ، واقترب من العضلات أو خياطتها قبل إغلاق الجلد.
9. بمجرد إغلاق الجلد ، افصل الفأر ببطء عن جهاز التنفس الصناعي في الاستلقاء البطني ، وقم بإزالة الأنبوب الرغامي عندما يتعافى تردد الجهاز التنفسي. دع يتعافى من التخدير في بيئة هادئة ، ويفضل أن تكون درجة حرارة الغرفة ثابتة عند 27 درجة مئوية.
10. انتظر حتى تتعافى من التخدير ، وتبدأ في تحريك أطرافها ، واستعادة ترددها التنفسي الطبيعي. ثم قم بإيوائهم في أقفاص فردية حتى نهاية البروتوكول.
11. قم بتنفيذ نفس الإجراء على الشاهدة أو التي يتم تشغيلها بشكل زائف ولكن بدون ربط LDA.

3. تصميم الدراسة

1. لاختبار التطور الزمني للشفاء وإعادة تشكيل البطين بعد MI ، قم بتقسيم الفئران عشوائيا إلى المجموعات التالية:
   1. لدراسة المرحلة المبكرة من إعادة تشكيل البطين بعد أسبوع واحد من تطور MI ، قم بتعيين الفئران للمجموعات التالية: 1) C57 Sham (أسبوع واحد) ؛ 2) Gal-3 KO Sham (أسبوع واحد) ؛ 3) C57 MI (أسبوع واحد) ؛ 4) Gal-3 KO MI (1 أسبوع).
   2. لدراسة المرحلة المتأخرة من إعادة تشكيل البطين في 4 أسابيع من MI ، قم بتعيين الفئران للمجموعات التالية: 5) C57 Sham (4 أسابيع) ؛ 6) Gal-3 KO Sham (4 أسابيع) ؛ 7) C57 MI (4 أسابيع) ؛ 8) Gal-3 KO MI (4 أسابيع).

4. تخطيط صدى القلب

ملاحظة: بالنسبة لمخططات صدى القلب للماوس ، يجب استخدام محولات الطاقة الخطية التي تزيد عن 10 ميجاهرتز للتصور الصحيح لأقطار الجدار وأحجام التجاويف. يمكن إجراء هذا الإجراء تحت التخدير باستخدام أفرتين داخل الصفاق (IP) عند 1.15 مل / كجم أو في الواعية. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا الأخير إلى نتائج مربكة في الفئران المصابة ب MI بسبب التوتر والقلق الناجم عن التلاعب.

1. لتخدير الفأر ، التقطه ، وامسكه بظهره نحو راحة اليد ، ثم اقلبه للوصول إلى سطح البطن. في هذا الوضع ، قم بحقن تخدير IP بزاوية 45 درجة بين والإبرة تحت الجلد.
2. بمجرد تخدير الفأر ، حلق صدره ، وضع الماوس فوق وسادة تسخين مسخنة مسبقا في وضع الاستلقاء الظهري. للحصول على مناظر ذات محور طويل وقصير المحور ، حرك محول الطاقة 90 درجة. بمجرد الحصول على عرض المحور الصحيح ، ضع المؤشر على مستوى العضلات الحليمية ، واضغط على مفتاح الوضع 2-D M لالتقاط الصور ، واستخدم برنامج تحليل الصور لقياس المعلمات التالية:
   1. قم بقياس أبعاد الجهد المنخفض ، بما في ذلك سمك الجدار (LVWT) ، ومناطق الجهد المنخفض في كل من الانقباض (S) والانبساط (D) ، والمنطقة الانبساطي البطين الأيسر (LVDA) والمنطقة الانقباضية للبطين الأيسر (LVSA) في ثلاث نبضات على الأقل.
   2. بالإضافة إلى ذلك ، احسب الوظيفة البطينية بالكسر القذفي (EF ، ٪) ، الكسر القصير (SF ، ٪) ، وكتلة القلب (افترض مكعبا غير مصحح) باستخدام المعادلة (1) والمعادلة (2) والمعادلة (3) ، كما هو موضح^{سابقا 15}.
      SF (٪) = ([LVEDD - LVESD] / LVEDD) × 100 (1)
      EF (٪) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      كتلة الجهد المنخفض = 1.055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³) (3)
      حيث LVEDD هو القطر الانبساطي في البطين الأيسر ، LVESD هو القطر الانقباضي في نهاية البطين الأيسر ، IVST هو السماكة داخل البطين ، و PWT هو سمك الجدار الخلفي.

5. تقييم الأنسجة

1. أثناء التشريح ، استخرج القلب من عن طريق فتح الصدر من جانب إلى آخر وقطع جميع الهياكل المحيطة به. نظف الجلطة الدموية الموجودة داخل التجاويف عن طريق الضغط برفق باستخدام المناديل الورقية.
2. احصد القلب ووزنه على مقياس دقيق معملي. اغمره في 10٪ فورمالديهايد لمدة 72 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. قم بقص القلب يدويا من القمة إلى القاعدة إلى شرائح عرضية بسمك 1 مم باستخدام شفرة ، وقم بمعالجة الشرائح عن طريق دمجها في البارافين. قم بعمل قطع تسلسلية على الأقسام المضمنة في البارافين بسمك 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
3. ضع كل قسم بين الشرائح ، وقم بلطخها بالهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) ، أو مقاطع ماسون ثلاثية الألوان ، أو المقاطع الملطخة بالليكتين المترافق بالرودامين ، أو أحمر Picrosirius^15،16.
   1. باستخدام مجهر ضوئي مناسب ، التقط صورا رقمية بمعدل 400 مرة لقياس التشكل والتليف والقياس الكمي MCSA. تحقق من أن المجهر متصل بكاميرا رقمية ومتصل بجهاز كمبيوتر مزود ببرنامج تحليل الصور. لكل تحليل مورفومتري ، تأكد من أن الصور في نفس المناطق ، مع ما لا يقل عن 10 مجالات عالية الطاقة بمعدل 400 ضعف لكل قسم (الحاجز والمنطقة الاحتشاء والمنطقة البعيدة) ودون تداخل الحقول.
      1. لقياس MCSA ، كن على دراية بمواضع الخلايا العضلية القلبية ، واحسب فقط تلك الخلايا العضلية المقطعة بشكل عرضي وتحيط بها ثلاثة شعيرات دموية قريبة على الأقل.
      2. في شرائح Picrosirius الملطخة باللون الأحمر ، حدد مناطق الندبة والحاجز ، وقم بتصوير الكولاجين الخلالي في كلتا المنطقتين. قم بتحميل الصور على برنامج التحليل ، وافتح علامة التبويب العتبة لتمييز جميع مناطق الكولاجين الإيجابية والسالبة للحصول على البيانات ، اضغط على علامة التبويب قياس ، واحفظ النتائج. لحساب النسبة المئوية للكولاجين لكل منطقة ، استخدم المعادلة (4) ، وأضف المناطق الإيجابية للكولاجين واقسمها على الأنسجة الكلية ، بما في ذلك المناطق الإيجابية للكولاجين ، كما هو موضح في مكان آخر^15،16.
         الكولاجين (٪) = منطقة Picrosirius الحمراء / إجمالي مساحة الأنسجة (4)
      3. حدد كمية MCSA من الصور الرقمية التي تم الحصول عليها من الأقسام الملطخة بالليكتين المترافق بالرودامين من العينات المضمنة في البارافين. للحصول على الصورة الصحيحة ، استخدم برنامج تحليل الصور لتتبع الخطوط العريضة الحمراء للخلايا العضلية المحيطة بأغشية الخلايا. حدد علامة تبويب المنطقة ، وتتبع المخططات التفصيلية ، واضغط على وظيفة علامة تبويب القياس . أخيرا ، احفظ النتائج من مناطق الخلية¹⁶.

6. التحديد الكمي لحجم الاحتشاء وقياس الخطة لتقييم إعادة تشكيل القلب

1. قم بقياس حجم احتشاء عضلة القلب وسمك الجدار وطول محيط الشغاف والنخابي باستخدام قياس المسطح من الصور النسيجية لأقسام ماسون الملطخة ثلاثية الألوان التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر ضوئي (4x) والبرنامج المناسب.
   1. لتحديد حجم الاحتشاء ، حدد منطقة الاحتشاء (الأزرق) والمنطقة البعيدة (الحمراء). تتبع وقياس الطول الكلي لمنطقة الاحتشاء والمنطقة البعيدة على جانبي الشغاف والنخابي. احسب متوسط تتبع الشغاف والنخابي كنسبة مئوية من إجمالي محيط الجهد^{المنخفض 17}.
   2. وبالمثل ، قم بقياس سمك الندبة (متوسط خمسة قياسات متساوية البعد) وسمك الحاجز (متوسط ثلاثة قياسات متساوية البعد) في الجزء الأوسط من القلب ، واستخدم هذه القياسات لتحديد نسبة سمك الندبة (المعادلة [5]) ومؤشر التمدد (المعادلة [6] ¹⁸).
      ملاحظة: يمكن تسجيل جميع القيم في جدول بيانات.
      نسبة سمك الندبة = سمك الندبة / سمك الحاجز (5)
      مؤشر التمدد = (مساحة تجويف الجهد المنخفض / إجمالي مساحة الجهد المنخفض) × (سمك الحاجز / سمك الندبة) (6)
      ملاحظة: نظرا لأن إعادة التصميم قد تعدل التمدد ، مما يؤدي إلى التقليل من حجم الاحتشاء أو المبالغة فيه ، فقد تكون هناك حاجة إلى بعض الوقت لإجراء تجربة تجريبية لقياس حجم الاحتشاء في 24 ساعة ، متبوعا بالقتل الرحيم. في هذه الحالة ، قم بتخدير بنفس محلول التخدير IP المستخدم في إجراء MI.
2. ضع في الاستلقاء الظهري ، وقم بتنبيبه كما هو موضح سابقا. بمجرد تخدير ، قم بعمل شق قطري عميق يصل إلى الجلد والعضلات والعظام الساحلية من التأليب الخنجري إلى التجويف الإبطي.
3. اعزل قوس الأبهر ، وقم بعمل ثقب صغير في الشريان الأورطي الصاعد ، وأدخل قسطرة لاختراق القلب باللون الأزرق لإيفان. ثم قم بإزالة القلب الملطخ يدويا من ، واقطعه من القمة إلى القاعدة بشفرة حادة. ضع شرائح القلب في 1٪ ثلاثي فينيل تيترازوليوم كلوريد (TTC) في مخزن الفوسفات متساوي التوتر (الرقم الهيدروجيني 7.4) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ⁴ للتأكد من أن قابلة للمقارنة من حيث حجم الاحتشاء.

النتائج

البقاء على قيد الحياة والتشريح بعد MI
على مدى 4 أسابيع من المتابعة ، تم العثور على 17٪ (4/23) من فئران C57 مقابل 40٪ (8/20) من فئران Gal-3 KO ميتة. تم إجراء التشريح. أظهرت الفئران الميتة Gal-3 KO قلوبا أكبر من الفئران C57 (الشكل 1) ، و 38٪ من الفئران C57 مقارنة ?...

Discussion

يستخدم النموذج التجريبي ل MI بواسطة رباط الشريان التاجي الدائم لدراسة مجموعة متنوعة من الآليات الفيزيولوجية المرضية لإصلاح القلب وإعادة^{تشكيله 5،14،17}. تلخص هذه المقالة الطرق المختلفة المستخدمة حاليا في هذا المختبر لدرا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-0 silk suture	Ethicon
C57BL/6J mice	Department of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respirator	Hardvard company
Heating pad			maintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		Image Analysis Software
Ketamine	Holiday
Masson Trichrome	BIOPUR
Picrosirius red	BIOPUR
Retractors
Rodent Ventilator Model 683	Harvard Apparatus		Mechanical ventilator
Scissors
Stereoscopic magnifying glass	Arcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)	General Electric		Any tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, Burlingame	Vector Laboratories
Xylazine	Pro-Ser