تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة التثقيب الكهربائي في Ovo

Summary

باستخدام التثقيب الكهربائي للبويضات ، ابتكرنا طريقة لنقل الأذن الداخلية السمعية ونواة القوقعة بشكل انتقائي في أجنة الدجاج لتحقيق ضربة قاضية خاصة بمجموعة الخلايا لبروتين التخلف العقلي X الهش خلال فترات منفصلة من تجميع الدائرة.

Abstract

بروتين التخلف العقلي X الهش (FMRP) هو بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبوزي المرسال ينظم ترجمة البروتين المحلي. يؤدي فقدان FMRP أو اختلاله الوظيفي إلى أنشطة عصبية ومشبكية شاذة في متلازمة X الهشة (FXS) ، والتي تتميز بالإعاقة الذهنية والتشوهات الحسية ومشاكل التواصل الاجتماعي. أجريت دراسات على وظيفة FMRP والتسبب في FXS في المقام الأول مع Fmr1 (الجين المشفر FMRP) بالضربة القاضية في الحيوانات المعدلة وراثيا. هنا نبلغ عن طريقة في الجسم الحي لتحديد وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP خلال فترة تجميع الدائرة والتكوين المشبكي باستخدام أجنة الدجاج. تستخدم هذه الطريقة التثقيب الكهربائي الخاص بالمرحلة والموقع والاتجاه لنظام ناقل محفز للدواء يحتوي على الحمض النووي الريبي الصغير Fmr1 (shRNA) ومراسل EGFP. باستخدام هذه الطريقة ، حققنا ضربة قاضية انتقائية FMRP في العقدة السمعية (AG) وفي أحد أهداف جذع الدماغ ، النواة المغنطيسية (NM) ، وبالتالي توفير معالجة خاصة بالمكونات داخل دائرة AG-NM. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح نمط الفسيفساء للنقل بضوابط داخل الحيوان ومقارنات الخلايا العصبية / الألياف المجاورة لتعزيز الموثوقية والحساسية في تحليل البيانات. يوفر نظام الناقل المحرض تحكما زمنيا في بداية تحرير الجينات لتقليل التأثيرات التنموية المتراكمة. يوفر الجمع بين هذه الاستراتيجيات أداة مبتكرة لتشريح وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP في تطوير المشبكي والدوائر.

Introduction

متلازمة X الهشة (FXS) هي اضطراب في النمو العصبي يتميز بالإعاقة الذهنية والتشوهات الحسية وسلوكيات التوحد. في معظم الحالات ، يحدث FXS بسبب فقدان عالمي لبروتين التخلف العقلي X الهش (FMRP ؛ مشفر بواسطة جين Fmr1) بدءا من المراحل الجنينية المبكرة¹. FMRP هو بروتين ملزم للحمض النووي الريبي يتم التعبير عنه عادة في معظم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ ، وكذلك في الأعضاء الحسية²،^3،4. في أدمغة الثدييات ، من المحتمل أن يرتبط FMRP بمئات من mRNAs التي تشفر البروتينات المهمة لمختلف الأنشطة العصبية⁵. أظهرت الدراسات التي أجريت على الضربة القاضية Fmr1 التقليدية أن تعبير FMRP مهم بشكل خاص لتجميع ومرونة النقل العصبي المشبكي⁶. أظهرت العديد من نماذج الضربة القاضية الشرطية والفسيفسائية كذلك أن إجراءات وإشارات FMRP تختلف عبر مناطق الدماغ وأنواع الخلايا والمواقع المشبكية خلال العديد من الأحداث التنموية بما في ذلك الإسقاط المحوري ، والزخرفة الشجيرية ، واللدونة المشبكية⁷،⁸،⁹،^10،11،¹²،^13،14 . تمت دراسة الوظيفة الحادة ل FMRP في تنظيم الانتقال المشبكي عن طريق التوصيل داخل الخلايا للأجسام المضادة FMRP المثبطة أو FMRP نفسها في شرائح الدماغ أو الخلايا العصبية المستزرعة¹⁵،¹⁶،^17،18. ومع ذلك ، لا توفر هذه الأساليب القدرة على تتبع العواقب الناجمة عن سوء التعبير عن FMRP أثناء التطوير. وبالتالي ، فإن تطوير طرق في الجسم الحي للتحقيق في وظائف الخلايا المستقلة ل FMRP في حاجة ماسة ، ومن المتوقع أن يساعد في تحديد ما إذا كانت الحالات الشاذة المبلغ عنها في مرضى FXS هي عواقب مباشرة لفقدان FMRP في الخلايا العصبية والدوائر المرتبطة ، أو عواقب ثانوية مشتقة من التغييرات على مستوى الشبكة أثناء التطوير¹⁹.

يقدم جذع الدماغ السمعي لأجنة الدجاج نموذجا مفيدا بشكل فريد للتحليلات الوظيفية المتعمقة لتنظيم FMRP في تطور الدائرة والمشبك. ساهمت سهولة الوصول إلى أدمغة الدجاج الجنينية وتقنية التثقيب الكهربائي للبيض الراسخة للتلاعب الجيني بشكل كبير في فهمنا لنمو الدماغ في المراحل الجنينية المبكرة. في دراسة نشرت مؤخرا ، تم دمج هذه التقنية مع الأدوات الجزيئية المتقدمة التي تسمح بالتحكم الزمني في التعبير الخاطئ^{FMRP 20,21}. هنا ، يتم تطوير المنهجية للحث على التلاعب الانتقائي للخلايا العصبية قبل المشبكية وما بعد المشبكية بشكل منفصل. تم تطوير هذه الطريقة في دائرة جذع الدماغ السمعي. يتم الكشف عن الإشارة الصوتية بواسطة خلايا الشعر في الأذن الداخلية السمعية ثم يتم نقلها إلى العقدة السمعية (AG ؛ وتسمى أيضا العقدة الحلزونية في الثدييات). تقوم الخلايا العصبية ثنائية القطب في AG بتعصيب خلايا الشعر بعملياتها المحيطية وترسل بدورها إسقاطا مركزيا (العصب السمعي) إلى جذع الدماغ حيث تنتهي في نواتين قوقعيتين أساسيتين ، النواة المغنطيسية (NM) والنواة الزاوية (NA). يمكن مقارنة الخلايا العصبية في NM هيكليا ووظيفيا بالخلايا الكثيفة الكروية لنواة القوقعة الأمامية البطنية للثدييات. داخل NM ، تتشابك الألياف العصبية السمعية (ANFs) على سوماتا الخلايا العصبية NM عبر المصباح النهائي الكبير للمحطات الطرفية²². أثناء التطور ، تنشأ الخلايا العصبية NM من المعينات 5 و 6 (r5 / 6) في الدماغ الخلفي²³ ، بينما يتم اشتقاق الخلايا العصبية AG من الخلايا العصبية المقيمة في كيس الأذن²⁴. هنا ، نصف الإجراء الخاص بضرب تعبير FMRP بشكل انتقائي في الخلايا العصبية AG قبل المشبكية وفي الخلايا العصبية NM بعد المشبكي بشكل منفصل.

Protocol

تم التعامل مع البيض وأجنة الدجاج بعناية واحترام وفقا لبروتوكولات الحيوانات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة جينان.

1. إعداد البيض والبلازميد

1. تحضير البيض
   1. احصل على بيض الدجاج الطازج المخصب (جالوس غالوس) من جامعة جنوب الصين الزراعية وخزنه في درجة حرارة 16 درجة مئوية قبل الحضانة. للحصول على الجدوى المثلى ، ضع كل البيض للحضانة في غضون أسبوع من الوصول.
   2. ضع البيض أفقيا واحتضانه عند 38 درجة مئوية لمدة 46-48 ساعة حتى مرحلة هامبرغر وهاملتون (HH) 12²⁵ لنقل الأنبوب العصبي ، أو لمدة 54-56 ساعة حتى HH13 لنقل الكيسة الأذنية. نظرا لأن القطب الحيواني للبيضة أخف من القطب النباتي ، فإن الوضع الأفقي يضع الجنين في الجزء العلوي من البويضة لسهولة التلاعب به. توخ الحذر للحفاظ على البيضة أفقية في هذه الخطوة وجميع الخطوات التالية.
   3. يظهر موقع الجنين كمنطقة مظلمة على قشر البيض عند صب الضوء من قاع البويضة باستخدام مصباح يدوي. في مراحل HH المرغوبة ، استخدم طريقة المصباح اليدوي هذه لتحديد موقع الجنين على قشر البيض بقلم رصاص.
   4. امسح البيض بشاش يحتوي على 75٪ إيثانول. حفر حفرة في نهاية مدببة من البيض باستخدام طرف المقص وإزالة 2 مل من الألبومين مع حقنة إبرة 18 غرام. تأكد من أن الفتحة كبيرة بما يكفي للسماح بإدخال الإبرة. امسح أي ألبومين متسرب بالشاش وأغلق الفتحة بشريط شفاف.
   5. لتقليل التشققات ومنع سقوط حطام القشرة أثناء النوافذ ، قم بتغطية الجزء العلوي من البيض بشريط شفاف ، مع التركيز على المنطقة المظلمة التي تحمل علامة قلم رصاص.
2. استخراج الحمض النووي البلازميد
   1. استنساخ الدجاج Fmr1 shRNA باستخدام نظام Tet-on القائم على الترانسبوزون كما هو موضح سابقا²⁰. يحتوي هذا النظام على ثلاثة بلازميدات: pCAGGS-T2TP و pT2K-CAGGS-rtTA-M2 و pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA ، مما يوفر نظام ناقل قابل للحث على الدواء يتم من خلاله إسكات تعبير Fmr1 shRNA و EGFP بعد النقل ويمكن تشغيله عن طريق تحريض الدوكسيسيكلين (Dox).
      ملاحظة: هذه البلازميدات غير متوفرة حاليا في مستودع. يوافق المؤلفون على توفير البلازميدات بناء على طلب معقول.
   2. استخرج الحمض النووي للبلازميد باستخدام مجموعة تحضير خالية من السموم الداخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وترسب بإضافة 1/15 حجم 7.5 م أسيتات الصوديوم وحجم واحد من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪.
   3. ترسيب البلازميدات عند -20 درجة مئوية طوال الليل وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإذابة الحبيبات باستخدام المخزن المؤقت Tris-EDTA المتوفر في المجموعة إلى تركيز نهائي من 4-5 ميكروغرام / ميكرولتر. يمكن تخزين البلازميدات عند -20 درجة مئوية لمدة 12 شهرا دون تقليل كفاءة النقل.
   4. في يوم التثقيب الكهربائي ، قم بخلط 2 ميكرولتر من كل بلازميد في أنبوب طرد مركزي معقم باستخدام طرف ماصة. حجم 6 ميكرولتر الناتج من خليط البلازميد يكفي لكهرباء ثلاثين بيضة. للمساعدة في تصور البلازميد أثناء التثقيب الكهربائي ، أضف 1 ميكرولتر من 0.1٪ أخضر سريع (محضر في ddH₂O معقم) لكل 6 ميكرولتر من خليط الحمض النووي²⁶ ، مما يحول خليط البلازميد إلى اللون الأزرق.

2. في التثقيب الكهربائي للبيض

1. نافذة البيض وتحديد الأجنة
   1. في يوم التثقيب الكهربائي ، أخرج البيض من الحاضنة ، عشرات البيض في وقت واحد. إن إبقاء البيض خارج حاضنته لأكثر من 1 ساعة يقدم اختلافات في النمو ويقلل من القدرة على البقاء.
   2. امسح جميع أدوات الجراحة بشاش يحتوي على 75٪ إيثانول.
   3. ضع كل بيضة في حامل رغوة حسب الطلب. امسح المنطقة المغطاة بالشريط بنسبة 75٪ من الإيثانول واقطع نافذة (1-2 سم²) حول محيط علامة القلم الرصاص باستخدام مقص صغير (الشكل 1 أ). عند القطع ، أمسك المقص بشكل مسطح لتجنب إتلاف الجنين تحته.
   4. ضع البويضة ذات النوافذ تحت مجهر مجسم بعدسة 10x وتكبير 2x وحدد الجنين. اضبط زاوية وسطوع مصدر الضوء للحصول على تصور أفضل.
      ملاحظة: يتطلب الأمر ممارسة وخبرة لتصور الجنين وتحديد الأنبوب العصبي في هذه المرحلة.
      1. للمبتدئين ، استخدم حقن الحبر الاختياري التالي لتسهيل التعرف على الجنين. تحضير محلول حبر هندي 10٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.01 متر (PBS) والأوتوكلاف مسبقا. املأ حقنة سعة 1 مل بمحلول الحبر ثم قم بتركيب إبرة 27G. ثني الإبرة بزاوية 45 درجة بالملقط.
      2. تحت المجهر ، كزة بعناية من حافة المنطقة opaca وأدخل الإبرة تحت الجنين. حقن ~ 50 ميكرولتر من الحبر ، والتي سوف تنتشر تحت المنطقة pellucida لتصور الجنين. سيشكل الحبر خلفية داكنة لتصور واضح للجنين.
         ملاحظة: طرد الهواء من المحقنة قبل إدخالها وحقنها. عندما تكون ماهرا في التصور ، تجنب خطوة حقن الحبر لأنها تقلل من معدل البقاء على قيد الحياة.
2. حقن الأنبوب العصبي والتثقيب الكهربائي
   ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء في HH12 لنقل الخلايا العصبية NM في جذع الدماغ.
   1. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية (~ 1 مم في القطر وطول 100 مم) إلى ماصات باستخدام مجتذب ماصة. تحت مجهر تشريح ، افتح بعناية طرف الإبرة الشعرية إلى قطر 10-20 ميكرومتر بالملقط. قم بتخزين الماصات (عادة 5-10 في وقت واحد) في صندوق تخزين حتى الاستخدام.
   2. املأ ماصة شعرية ب 0.5-1 ميكرولتر من خليط البلازميد عن طريق تطبيق ضغط سلبي من خلال أنبوب مطاطي في نهاية الماصة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق حقنة أو مضخة هواء.
   3. ضع البويضة تحت المجهر بحيث يكون الجنين موجها رأسيا مع الذيل بالقرب منك (أو أفقيا لحقن الماصات الشعرية باستخدام مناور ثلاثي المحاور). أمسك الماصة الشعرية بيد واحدة أو باستخدام مناور ثلاثي المحاور وقم بقيادة طرف الماصة إلى r5 / 6 في اتجاه من الذيل إلى الرأس.
      ملاحظة: منطقة الدماغ الخلفي الأمامية هي r1 وكل انتفاخ لاحق على طول الأنبوب العصبي هو معين فردي. R5 / 6 في نفس المستوى الأمامي الخلفي مثل كيس الأذن ، وهو هيكل يشبه الكوب يمكن التعرف عليه بسهولة (الشكل 1B-C).
   4. قم بوخز الطرف برفق عبر الغشاء الزجاجي إلى الأنبوب العصبي الظهري ثم اسحب الماصة قليلا بحيث يكون الطرف في تجويف الأنبوب العصبي. حقن خليط البلازميد عن طريق الضغط على الهواء حتى ينتشر البلازميد الملون بالكامل في r5 / 6 ويمتد إلى r3 و r4.
      ملاحظة: ليس من الضروري عمل فتحة على غشاء vitelline للحقن.
   5. تحقق من نجاح الحقن ، والذي يتحقق عندما ينتشر محلول البلازميد الأزرق بسرعة أسفل الأنبوب العصبي دون تسرب (الشكل 1B-C). عندما يحدث تسرب ، يتلاشى اللون الأزرق بسرعة.
   6. بعد الحقن مباشرة ، ضع قطبا كهربائيا ثنائي القطب من البلاتين على جانبي الأنبوب العصبي (الشكل 1 د). قم بتوصيل نبضتين بطول 12 فولت و 50 مللي ثانية باستخدام جهاز كهربائي. راقب فقاعات الهواء في نهايات القطب ثنائي القطب ، مع وجود المزيد على الجانب السلبي.
   7. تحقق من التثقيب الكهربائي الناجح ، والذي يتحقق عندما يدخل خليط البلازميد الملون إلى نسيج الأنبوب العصبي بالقرب من الجانب الإيجابي للقطب الكهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة القطب ثنائي القطب بعناية.
   8. قم بتغطية النافذة على قشر البيض بقطعة من الفيلم الشفاف الذي تم تقطيعه مسبقا إلى 2 في مربعات ورشه بنسبة 75٪ من الإيثانول. ضع البيضة مرة أخرى في حاضنتها.
   9. نظف القطب ثنائي القطب عن طريق توصيل 10-20 نبضة بطول 12 فولت و 50 مللي ثانية في محلول ملحي قبل الانتقال إلى البويضة التالية.
3. حقن كيس الأذن والتثقيب الكهربائي
   ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء في HH13 لنقل خلايا الشعر والخلايا العصبية AG في الأذن الداخلية.
   1. في HH13 (وهو ~ اليوم الجنيني 2.5) ، استدار الجنين بحيث يواجه الجانب الأيمن من الرأس لأعلى. تحت المجهر ، ضع البويضة بحيث يكون الجنين عموديا ، مع وجود الذيل بالقرب منك. امسك الماصة الشعرية وكز الكيسة الأذنية اليمنى برفق في اتجاه ظهري جانبي (الشكل 2 أ).
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، تظهر كيس الأذن كهيكل دائري صغير في الجزء العلوي من الجسم في نفس المستوى الأمامي الخلفي مثل r5 / 6.
   2. حقن خليط البلازميد بضغط الهواء حتى تمتلئ كيس الأذن بمحلول أزرق²⁷. تحقق من نجاح الحقن، والذي يتحقق عندما يكون خليط البلازميد الأزرق محصورا داخل الكيسة الأذنية ولا يتسرب.
   3. بعد الحقن مباشرة ، ضع القطب ثنائي القطب على كيس الأذن كما هو موضح في الشكل 2 ب. ضع الجوانب الإيجابية والسلبية الأمامية والخلفية لكيس الأذن ، على التوالي. قم بتوصيل نبضتين بطول 12 فولت و 50 مللي ثانية باستخدام جهاز التثقيب الكهربائي.
   4. تحقق من التثقيب الكهربائي الناجح ، والذي يتحقق عندما يدخل خليط البلازميد الأزرق إلى أنسجة كيس الأذن بالقرب من الجانب الإيجابي للقطب الكهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة القطب ثنائي القطب بعناية. غطي النافذة على قشر البيض بفيلم شفاف وأعد البويضة إلى الحاضنة.

3. إدارة Dox لبدء وصيانة نسخ البلازميد

1. تحضير محلول Dox
   1. قم بقياس 100 مجم من مسحوق Dox تحت غطاء كيميائي وقم بإذابته في 100 مل من PBS المعقم لعمل 1 مجم / مل من محلول العمل. قم بتصفية المحلول بفلتر 0.22 ميكرومتر وقم بتخزين 1 مل من القسمة عند -20 درجة مئوية. يحفظ بعيدا عن الضوء^20,28.
2. إدارة دوكس
   1. لتحرير الجينات كاملة القوة ، في 24 ساعة قبل العمر المطلوب ، قم بإذابة حصص Dox على الجليد. قم بإسقاط 50 ميكرولتر من Dox مباشرة على الغشاء المشيمي للبيضة باستخدام حقنة تخترق الفيلم الشفاف. أغلق فتحة الإبرة بغشاء شفاف أو شريط لاصق بعد الحقن.
   2. للحفاظ على تأثير ضربة قاضية ، قم بتطبيق Dox كل يومين حتى حصاد الأنسجة في مرحلة النمو المطلوبة.

4. تشريح الأنسجة وتقسيمها

1. جذع الدماغ
   1. بالنسبة للأجنة في المرحلة الجنينية 3 (E3) و E6 ، افتح قشر البيض وقطع الغشاء المرتبط بالمقص. أخرج الجنين بالملعقة واغمره في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول فوسفات 0.1 متر.
   2. بالنسبة لأجنة E9 ، افتح قشر البيض ، واقطع رأس الجنين بالمقص ، وانقل الرأس إلى صفيحة ذات قاع سيليكون مملوءة ب PBS. دبوس الرأس لأسفل من خلال المدارات وقطع الجزء العلوي من الجمجمة بعيدا. ضع الملقط بعناية تحت الدماغ من كلا الجانبين وارفع الدماغ بالكامل من الجمجمة بأكتاف الملقط. اغمر الدماغ في 4٪ PFA.
   3. بالنسبة للأجنة E15 و E19 ، افتح قشر البيض ، واقطع رأس الجنين بالمقص ، وضع الرأس على طبق ذو قاع سيليكون مملوء ب PBS. قطع الجلد على الجزء العلوي من الرأس لفضح الجمجمة.
   4. شق الجمجمة عموديا باستخدام ماكينة حلاقة لفصل الدماغ الأمامي والدماغ الذيلي. اغمر الكتلة الذيلية في برنامج تلفزيوني ، وأزل الجزء العلوي من الجمجمة ، ثم أخرج الدماغ من الجمجمة.
   5. ثبت الدماغ لأسفل من خلال الفص البصري وافصل المخيخ وجذع الدماغ. احرص على عدم إتلاف جذع الدماغ السمعي ، الذي يقع أسفل المخيخ مباشرة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الجافية من جذع الدماغ ثم اغمرها في 4٪ PFA.
   6. احتفظ بالأجنة وأنسجة المخ في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية طوال الليل باستثناء جذع الدماغ E19 ، والذي يجب أن يبقى تحت نفس الحالة لمدة 24 ساعة.
   7. بعد التثبيت ، قم بتجفيف الأنسجة في PBS التي تحتوي على 30٪ سكروز حتى تستقر ، والتي تستغرق عادة 1-3 أيام ، اعتمادا على العمر.
   8. قسم جذع الدماغ (E15 و E19) عند 30 ميكرومتر في المستوى الإكليلي باستخدام ميكروتوم منزلق. اجمع الأقسام في برنامج تلفزيوني واحفظها في 4 درجات مئوية قبل تلطيخ المناعة.
   9. بالنسبة للأجنة E3 و E6 وجذع الدماغ E9 ، القسم عند 50 ميكرومتر بشكل مستعرض. اجمع الأقسام في PBS وقم بتخزينها في 4 درجات مئوية. قم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر المغلفة بالجيلاتين قبل التلطيخ المناعي. جمع أقسام أكثر سمكا لهذه الأعمار يسهل التعامل مع الأنسجة.
2. القناة السمعية
   1. بعد إزالة الدماغ من أجنة E9 و E15 و E19 ، يمكن التعرف بسهولة على القناة السمعية ، المضمنة في العظم الصدغي ، تحت الجمجمة ، ويمكن فصل العظم الصدغي بسهولة عن الجمجمة المحيطة. بالنسبة لأجنة E9 ، ثبت العظم الصدغي بالكامل في 4٪ PFA. بالنسبة للأجنة الأكبر سنا ، قم بإزالة البنية العظمية للعظم الصدغي لعزل القناة السمعية وإصلاح القناة السمعية في 4٪ PFA.
   2. احتفظ بجميع العظام الصدغية والقنوات السمعية في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية طوال الليل قبل تضمين الأنسجة.
   3. أداء تضمين الأنسجة كما هو موضح. تحضير حل التضمين على النحو التالي: نقع الجيلاتين 10 ٪ (من الجلد البقري) في الماء البارد حتى تنتفخ حبيبات الجيلاتين وتستقر (حوالي 30 دقيقة). سخني الخليط إلى ~ 50 درجة مئوية لإذابة الجيلاتين وإضافة 20٪ سكروز إلى محلول الجيلاتين وحركه حتى يذوب. قم بتخزين محلول الجيلاتين والسكروز في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر.
   4. للاستخدام، قم بتسخين محلول الجيلاتين والسكروز عند 37 درجة مئوية. انقع العظام الصدغية / القنوات السمعية في محلول الجيلاتين والسكروز الدافئ على طبق من 96 بئرا عند 37 درجة مئوية حتى تستقر ، عادة 30-60 دقيقة.
   5. قم بتبطين قاع آبار صفيحة مكونة من 12 بئرا بشريط من الفيلم الشفاف. أضف طبقة من محلول الجيلاتين والسكروز الدافئ وانتظر حتى تصلب. انقل العظم الصدغي / القناة السمعية إلى كل بئر.
   6. زرع الأنسجة مع طبقة ثانية من محلول الجيلاتين والسكروز الدافئ. اضبط موضع الأنسجة بحيث تكون في وسط الجل وتكون القناة السمعية موجهة أفقيا. انقل الطبق بحذر إلى ثلاجة 4 درجات مئوية وانتظر حتى يصبح الجل متماسكا.
   7. اسحب شريط الفيلم الشفاف لتحريك كتلة الأنسجة الهلامية خارج البئر. تقليم هلام إضافي في كتلة مربعة وقطع زاوية من كتلة لتحديد الاتجاه. لف كتلة الجيلاتين بقطعة من ورق القصدير ، وقم بتجميدها على الثلج الجاف ، ثم خزنها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم تقسيمها.
   8. قسم الكتلة عند 20 ميكرومتر على طول خط طول القناة السمعية باستخدام cryostat. قم بتركيب الأقسام مباشرة على شرائح المجهر المغلفة بالجيلاتين. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة -80 درجة مئوية قبل تلطيخ المناعة.
   9. قبل التلوين المناعي ، اغمر الشرائح في PBS الدافئ مسبقا (45 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق لإذابة الجيلاتين ، ثم اغسل الشرائح 3x مع PBS بدرجة حرارة الغرفة لإزالة الجيلاتين المتبقي.

5. التلوين المناعي والتصوير المجهري

ملاحظة: يتم إجراء نوعين من التلوين المناعي اعتمادا على ما إذا كانت الأقسام مثبتة على شرائح أو تطفو بحرية في برنامج تلفزيوني.

1. تلطيخ المناعة على الشرائح
   1. اغسل الشرائح 3x لمدة 10 دقائق لكل منها باستخدام PBS. ضع دائرة حول المنطقة التي تحتوي على الأقسام بقلم زيت لمنع تسرب السائل أثناء التلطيخ. قم بتغطية الأقسام بمحلول مانع يحتوي على 5٪ مصل ماعز طبيعي في PBS واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. تمييع الأجسام المضادة الأولية (للتركيز النهائي المستخدم الرجوع إلى جدول المواد) في PBS التي تحتوي على 0.3٪ TritonX-100 و 5٪ مصل الماعز الطبيعي. أزل محلول الحجب ثم قم بتغطية الأقسام بمحلول الجسم المضاد الأساسي. احتضان الشرائح عند 4 درجات مئوية طوال الليل في صندوق يحتوي على طبقة من الماء المقطر في الأسفل.
   3. شطف الشرائح 3x لمدة 10 دقائق مع PBS. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المخففة في 1: 500 في PBS التي تحتوي على 0.3 ٪ TritonX-100 على الشرائح. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات ، محمية من الضوء.
   4. اغسل الشرائح 3x باستخدام PBS. قم بإسقاط قطرتين من وسيط التثبيت برفق على الشرائح وقم بتغطية الأقسام بأغطية أغطية. احرص على عدم توليد فقاعات هواء بين الغطاء والشريحة.
2. التلوين المناعي للأجنة الكاملة والأقسام العائمة الحرة
   1. اغسل الأجنة / الأقسام باستخدام PBS 3x لمدة 10 دقائق لكل منها في طبق جيد. تمييع الأجسام المضادة الأولية في PBS التي تحتوي على 0.3٪ TritonX-100 و 5٪ مصل الماعز الطبيعي في أنابيب الطرد المركزي. انقل كل جنين / قسم إلى أنبوب بخطاف زجاجي واحتضانه على شاكر عند 60 دورة في الدقيقة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   2. اغسل الأجنة / الأقسام 3x باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل منها في طبق جيد. انقل كل جنين / قسم إلى أنبوب طرد مركزي مظلم مملوء بمحلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات على شاكر.
   3. اغسل الأجنة / الأقسام 3x باستخدام PBS في طبق جيد. استخدم فرشاة لتركيب الأقسام على شرائح مجهر مغلفة بالجيلاتين في طبق 15 سم يحتوي على PBS. بعد تجفيف الشرائح قليلا (~ 5 دقائق) ، ضع قطرتين من وسط التثبيت وضع غطاء غطاء. احرص على عدم توليد فقاعات هواء بين الغطاء والشريحة. الحفاظ على الأنسجة جبل كامل في PBS للتصوير.
3. التصوير
   1. تخيل أنسجة التركيب بأكملها في PBS في طبق به قاع سيليكون يحتوي على مسحوق الكربون ، والذي يوفر خلفية سوداء. التقاط الصور ومعالجتها باستخدام حزمة برامج أوليمبوس لمعالجة الصور التجارية، كما هو موضح سابقا²⁹.
   2. قم بتصوير الأقسام الموجودة على الشرائح باستخدام مجهر متحد البؤر كما هو موضح سابقا²⁰. تخيل الأقسام على مستوى بؤري واحد بأهداف 10x و 20x و 63x. التقط جميع الصور من نفس الحيوان باستخدام نفس المعلمات. احرص على ضبط مستوى الليزر وإعدادات اكتساب التصوير لتجنب تشبع الإشارة.
   3. قم بإجراء معالجة الصور باستخدام برنامج فيجي. للتوضيح ، اضبط سطوع الصورة والتباين وجاما باستخدام برنامج تحرير صور احترافي.

النتائج

من خلال إجراء التثقيب الكهربائي للبيض في مواقع مختلفة وفي مراحل نمو مختلفة ، حققنا ضربة قاضية انتقائية FMRP إما في المحيط السمعي أو في جذع الدماغ السمعي.

ضربة قاضية FMRP في NM
تم تصميم الحمض النووي الريبي الصغير (shRNA) ضد الدجاج Fmr1 واستنساخه في نظام ناقل Tet-On كما...

Discussion

لتحديد وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP ، من الضروري معالجة تعبيرها في مجموعات الخلايا الفردية أو أنواع الخلايا. نظرا لأن إحدى الوظائف الرئيسية ل FMRP هي تنظيم التكوين المشبكي واللدونة ، فإن المعالجة الانتقائية لكل مكون متشابك لدائرة معينة هي شرط أساسي لفهم كامل لآلية FMRP في الا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package