JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يظهر هنا بروتوكول لإعداد ومعايرة المخزن المؤقت لمستخلصات الخلايا من سلالات الضربة القاضية exonuclease V من الإشريكية القولونية BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD و ΔrecB). هذا نهج سريع وسهل ومباشر للتعبير في أنظمة تخليق البروتين الخالية من الخلايا باستخدام قوالب الحمض النووي الخطية.

Abstract

أصبح تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) مؤخرا شائعا جدا في مجال البيولوجيا التركيبية بسبب مزاياه العديدة. إن استخدام قوالب الحمض النووي الخطي ل CFPS سيمكن التكنولوجيا من الوصول إلى إمكاناتها الكاملة ، مما يقلل من الوقت التجريبي من خلال القضاء على خطوات الاستنساخ والتحويل واستخراج البلازميد. يمكن تضخيم الحمض النووي الخطي بسرعة وسهولة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للحصول على تركيزات عالية من القالب ، وتجنب سمية التعبير المحتملة في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن قوالب الحمض النووي الخطية تتحلل بسرعة بواسطة exonucleases الموجودة بشكل طبيعي في مستخلصات الخلايا. هناك العديد من الاستراتيجيات التي تم اقتراحها لمعالجة هذه المشكلة ، مثل إضافة مثبطات النوكليز أو التعديل الكيميائي لنهايات الحمض النووي الخطي للحماية. كل هذه الاستراتيجيات تكلف وقتا وموارد إضافية ولم تحصل بعد على مستويات قريبة من البلازميد من التعبير عن البروتين. يتم تقديم بروتوكول مفصل لاستراتيجية بديلة هنا لاستخدام قوالب الحمض النووي الخطي ل CFPS. باستخدام مستخلصات الخلايا من الخلايا القاضية التي تعاني من نقص exonuclease ، تظل قوالب الحمض النووي الخطية سليمة دون الحاجة إلى أي تعديلات نهائية. نقدم خطوات تحضير تحلل الخلايا من سلالة الإشريكية القولونية BL21 Rosetta2 ΔrecBCD عن طريق تحلل الصوتنة ومعايرة المخزن المؤقت ل Mg-glutamate (Mg-glu) و K-glutamate (K-glu) خصيصا للحمض النووي الخطي. هذه الطريقة قادرة على تحقيق مستويات تعبير البروتين مماثلة لتلك الموجودة في الحمض النووي البلازميد في E. coli CFPS.

Introduction

يتم استخدام أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) بشكل متزايد كطريقة سريعة وبسيطة وفعالة لهندسة الاستشعار الحيوي والتصنيع اللامركزي والنماذج الأولية للدوائر الوراثية1. نظرا لإمكاناتها الكبيرة ، يتم استخدام أنظمة CFPS بانتظام في مجال البيولوجيا التركيبية. ومع ذلك ، تعتمد أنظمة CFPS حتى الآن على البلازميدات الدائرية التي يمكن أن تحد من وصول التكنولوجيا إلى إمكاناتها الكاملة. يعتمد إعداد الحمض النووي البلازميد على العديد من الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا أثناء الاستنساخ وكميات كبيرة من عزل الحمض النووي. من ناحية أخرى ، يمكن استخدام تضخيم PCR من البلازميد ، أو قالب الحمض النووي المركب ، ببساطة لإعداد قوالب CFPS في غضون ساعات قليلة 2,3. لذلك ، يوفر تطبيق الحمض النووي الخطي حلا واعدا ل CFPS. ومع ذلك ، يتحلل الحمض النووي الخطي بسرعة بواسطة exonucleases الموجودة بشكل طبيعي في المستخلصات الخلوية4. هناك حلول تعالج هذه المشكلة ، مثل استخدام بروتين GamS5 أو الحمض النووي الذي يحتوي على مواقع Chi6 كعوامل واقية ، أو حماية الحمض النووي الخطي مباشرة عن طريق التعديل الكيميائي لنهاياته 2,7,8,9. كل هذه الطرق تتطلب مكملات لمستخلص الخلية ، وهي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. من المعروف منذ فترة طويلة أن مجمع exonuclease V (RecBCD) يحلل الحمض النووي الخطي في محللات الخلايا4. في الآونة الأخيرة ، أظهرنا أن الحمض النووي الخطي يمكن حمايته بشكل أفضل بكثير في lysates من الخلايا التي تم إخراجها لجينات exonuclease (recBCD)10.

في هذا البروتوكول ، يتم وصف خطوات تحضير التحلل الخالي من الخلايا من سلالة E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD بواسطة تحلل الصوتنة بالتفصيل. تحليل الصوتنة هو تقنية شائعة وبأسعار معقولة تستخدمها العديد من المختبرات11,12. لا تحتاج المستخلصات الناتجة عن هذه السلالة إلى إضافة أي مكون إضافي أو تعديل قالب الحمض النووي لدعم التعبير من قوالب الحمض النووي الخطية. تعتمد هذه الطريقة على الخطوة الأساسية المتمثلة في تحسين المخزن المؤقت لمستخلصات الخلايا خصيصا لتعبير الحمض النووي الخطي من مروجي E. coli الأصليين. وقد تبين أن هذا التحسين العازل المحدد للتعبير الخطي عن الحمض النووي هو المفتاح لمروجي σ70 الأصليين لإنتاج نسبة عالية من البروتين دون بروتين GamS أو مكملات Chi DNA ، حتى تجنب تنقية منتجات PCR10. تم العثور على التركيز الأمثل ل Mg-glu للتعبير الخطي عن الحمض النووي ليكون مشابها للحمض النووي البلازميد. ومع ذلك ، أظهر التركيز الأمثل ل K-glu فرقا كبيرا بين الحمض النووي الخطي والبلازميد ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى آلية متعلقة بالنسخ10. تم إثبات وظائف البروتينات المعبر عنها باستخدام هذه الطريقة للعديد من التطبيقات ، مثل الفحص السريع لمفاتيح تثبيت القدم وتقييم نشاط متغيرات الإنزيم10.

يوفر هذا البروتوكول حلا بسيطا وفعالا وفعالا من حيث التكلفة لاستخدام قوالب الحمض النووي الخطي في الأنظمة الخالية من خلايا E. coli ببساطة باستخدام مستخلصات خلايا ΔrecBCD المتحولة والمعايرة المحددة للحمض النووي الخطي كقالب.

Protocol

1. إعداد الوسائط والمخزن المؤقت

  1. تحضير 2xYT + P متوسطة (صلبة وسائلة)
    1. تحضير الوسائط السائلة والصلبة كما هو موضح في الجدول 1 ، ثم تعقيمها عن طريق التعقيم.
      ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول صفيحة أجار واحدة 2xYT + P تحتوي على الكلورامفينيكول (10 ميكروغرام / مل). يتناسب حجم الوسائط السائلة مع حجم الليزات المطلوبة. هنا ، يتم استخدام حجم بدء 5 لتر من الوسائط السائلة 2xYT + P. ومع ذلك ، يمكن ضبط الحجم حسب الحاجة ، مع العلم أن 1 لتر من مزرعة الخلايا ينتج عنه 2 إلى 3 مل من محللات الخلية النهائية.
  2. تحضير الكلورامفينيكول (34 ملغم/مل)
    1. يزن 0.34 غرام من الكلورامفينيكول ، ويضاف الإيثانول إلى 10 مل ، ويذوب عن طريق الخلط. Aliquot 1 مل لكل منها في عدة أنابيب ، وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
  3. إعداد المخزن المؤقت S30A
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت S30A وفقا للجدول 2 ، بهدف الحصول على 2 لتر من هذا المخزن المؤقت.
      ملاحظة: مرة أخرى، يتناسب حجم هذا المخزن المؤقت مع حجم المحلل المطلوب.
    2. قبل التعقيم ، اضبط الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت إلى 7.7 باستخدام حمض الخليك الجليدي.
    3. تعقيم المخزن المؤقت.
    4. احتفظ بهذا المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية بعد التعقيم.
    5. قبل الاستخدام، أضف DTT (الذي تمت تصفيته بواسطة مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر) إلى المخزن المؤقت S30A للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2 مللي متر (2 مل من المخزون 1 مليون DTT إلى 1 لتر من المخزن المؤقت S30A).
      ملاحظة: مرة أخرى، يتناسب حجم هذا المخزن المؤقت مع حجم المحلل المطلوب.
  4. إعداد حل الطاقة
    ملاحظة: يستند محلول الطاقة هذا إلى ورقة Sun et al. 13 (تركيز مخزون 14x). ويلخص الجدول 3 المكونات اللازمة لإعداد مخزون محاليل الطاقة، مع أرقام كتالوج لجميع المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول.
    1. تحضير محاليل المخزون وفقا للجدول 3 والاحتفاظ بها على الجليد.
    2. قم بمعايرة الرقم الهيدروجيني كما هو مطلوب للمكونات المشار إليها ، إما باستخدام Tris buffer 2 M (60.57 g من قاعدة Tris في حجم 250 مل من الماء المعقم) أو KOH 15٪ (15 جم من KOH في حجم 100 مل من الماء المعقم) كما هو موضح في الجدول 3.
    3. في أنبوب سعة 15 مل، أضف حجم كل مكون بالترتيب المبين في الجدول 3.
    4. Aliquot محلول الطاقة ، 150 ميكرولتر لكل أنبوب.
    5. قم بتجميد الأليكوتات على الثلج الجاف وتخزينها على درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  5. تحضير محلول الأحماض الأمينية (AA)
    ملاحظة: يتم تحضير محلول الأحماض الأمينية بواسطة مجموعة عينات الأحماض الأمينية RTS. يتم توفير كل من الأحماض الأمينية ال 20 في هذه المجموعة بحجم 1.5 مل عند 168 ملليمتر ، باستثناء الليوسين الذي يبلغ 140 ملليمتر. هنا ، يتركز حل المخزون المعد 4x ، بدلا من حل العمل المطلوب. التركيز النهائي لمحلول الأحماض الأمينية هو 6 mM لجميع الأحماض الأمينية ، باستثناء الليوسين الذي يبلغ 5 mM.
    1. قم بإذابة أنابيب الأحماض الأمينية ال 20 عن طريق الدوامة واحتضانها عند 37 درجة مئوية حتى تذوب تماما.
      ملاحظة: قد لا تذوب Cys بالكامل.
    2. في أنبوب 50 مل ، أضف 12 مل من الماء المعقم و 1.5 مل لكل من الأحماض الأمينية بالترتيب المبين في الجدول 4.
    3. دوامة حتى يكون الحل واضحا إلى حد ما ، يحضن عند 37 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: قد لا تذوب Cys بالكامل.
    4. Aliquot 500 ميكرولتر من محلول الأحماض الأمينية لكل أنبوب على الجليد.
    5. قم بتجميد الأليكوتات على الثلج الجاف وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  6. إعداد حلول لمعايرة المخزن المؤقت
    1. تحضير محلول المخزون ل Mg-glu (100 mM) و K-glu (3 M) كما هو موضح في الجدول 5. قم بإجراء تخفيف تسلسلي (بحجم 1 مل) من هذه المخزونات ل Mg-glu (0 إلى 20 mM) و K-glu (20 إلى 300 mM) كما هو موضح في الملف التكميلي 1 لخطوات المعايرة.
      ملاحظة: تركيزات المخزون هذه مخصصة لخطوة المعايرة وقد تحتاج إلى تغيير عند إعداد التجربة النهائية. وأعلى تركيزات المخزونات التي تم اختبارها لهذا البروتوكول هي 1 م و 4.5 م ل Mg-glu و K-glu ، على التوالي.
  7. إعداد مخزون محلول PEG8000
    1. تحضير 50 مل من محلول PEG8000 بنسبة 40٪ (20 جم من PEG8000 في حجم 50 مل من الماء المعقم).

2. زراعة الخلايا وإعداد الليزات (تجربة لمدة 4 أيام)

  1. اليوم 1
    1. سلالة الخط BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (الجدول 6) من -80 درجة مئوية مخزون الجلسرين إلى لوحة أجار 2xYT + P التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام BL21 Rosetta2 ΔrecB (الجدول 6)10.
    2. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. اليوم 2
    1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من صفيحة الأجار المذكورة أعلاه إلى 10 مل من 2xYT + P مكملة ب 10 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول.
    2. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة.
  3. اليوم 3
    1. قم بعمل ثقافة فرعية عن طريق تخفيف الثقافة بين عشية وضحاها 100 مرة إلى 4 لتر من وسائط 2xYT + P الطازجة التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول.
      ملاحظة: على سبيل المثال، تتم إضافة 40 مل من الثقافة الليلية إلى 3960 مل من الوسائط الطازجة. بعد التخفيف ، تنقسم الوسائط سعة 4 لتر إلى 4 قوارير (حجم 5 لتر) بحيث تحتوي كل قارورة على 1 لتر.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة لحوالي 3 إلى 4 ساعات من النمو للوصول إلى OD600 من 1.5-2.0. تمييع الثقافة بمقدار 4x إذا كان قياس OD600 > 0.8.
      ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة الدقيق وفقا للسلالة والتلقيح الأولي وأدوات المختبر والأدوات المستخدمة. سلالات ΔrecB / ΔrecBCD بالضربة القاضية لها معدلات نمو مماثلة ل BL21 Rosetta2 الأبوية (الشكل التكميلي 1).
    3. ضع الثقافة على الجليد.
    4. قم بتدوير الخلايا عند 5000 × g لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من supernatant عن طريق الصب.
    5. أعد تعليق كريات الخلايا في 800 مل من S30A + DTT المبردة.
      ملاحظة: حجم S30A + DTT أقل بمقدار 5 أضعاف من حجم زراعة الخلايا الأصلي. على سبيل المثال، بالنسبة لحجم بدء 1 لتر من مزرعة الخلايا، أعد تعليق كريات الخلايا في 200 مل من S30A + DTT. يوصى أيضا بتنفيذ هذه الخطوة في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية ، وكذلك الحفاظ على جميع المواد على الجليد.
    6. قم بتدوير الخلايا عند 5000 × g لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من supernatant عن طريق الصب.
    7. كرر الخطوتين 2.3.5 و2.3.6.
    8. أعد تعليق كريات الخلايا في 160 مل من S30A + DTT المبردة.
      ملاحظة: هذه المرة حجم S30A + DTT أقل 25 مرة من حجم زراعة الخلايا الأصلي. على سبيل المثال، بالنسبة لحجم بدء 1 لتر من مزرعة الخلايا، أعد تعليق كريات الخلايا في 40 مل من S30A + DTT. مرة أخرى ، يوصى بتنفيذ هذه الخطوة في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية ، وكذلك للحفاظ على المواد على الجليد.
    9. انقل الخلايا إلى أنابيب 50 مل مبردة وموزنة مسبقا.
    10. قم بتدوير الخلايا عند 2000 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من supernatant عن طريق الصب.
    11. قم بتدوير الخلايا عند 2000 × g لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بإزالة supernatant المتبقي بعناية باستخدام ماصة.
    12. أعد قياس وزن الأنبوب لحساب وزن حبيبة الخلية.
    13. حافظ على كريات الخلايا عند -80 درجة مئوية.
  4. اليوم 4
    1. خذ كريات الخلية من -80 درجة مئوية وقم بإذابتها على الجليد لمدة 1-2 ساعة.
    2. أعد تعليق الكريات الخلوية في 0.9 مل من المخزن المؤقت S30A + DTT لكل غرام من وزن الكريات. ماصة ببطء لإعادة تعليق الخلايا ، وتجنب الزبد العلوي قدر الإمكان ، إن وجد.
    3. ضع 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها في أنابيب دقيقة 1.5 مل ، واحتفظ بها على الجليد أو كتلة باردة مبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية (يفضل استخدام كتل معدنية).
      ملاحظة: إذا كان الأليكوت الأخير أقل بكثير من 1 مل ، فمن الأفضل التخلص منه بدلا من صوتنة حجم دون المستوى الأمثل. تم تحديد الحجم الأمثل (1 مل) للصوتنة لهذا الإعداد (أنبوب ، سونيكتور ، ومسبار) ، وقد يختلف لآخر مختلف.
    4. سونيك كل أنبوب في سونيكتور (مسبار 3 مم ، تردد 20 كيلو هرتز) ، مع إعداد سعة 20٪ لثلاث دورات (30 ثانية صوتنة ، توقف مؤقت لمدة 1 دقيقة).
      ملاحظة: كان إجمالي الطاقة المقدمة خلال الدورات الثلاث ~ 266 جول (~ 80-110 جول لكل دورة). خلال هذه الخطوة ، احتفظ بالأنابيب على الكتلة الباردة المحاطة بالجليد. قم بالتناوب بين كتلتين باردتين لتجنب ارتفاع درجة حرارة المسبار (يتم الاحتفاظ بالكتلة الباردة الاحتياطية أيضا باردة على الجليد). تم تبريد كل من الكتل الباردة مسبقا في الثلاجة في اليوم السابق للصوتنة.
    5. قم بتدوير الليزات عند 12000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. جمع supernatant (خلية محللة) مع ماصة ونقلها إلى أنبوب 50 مل.
    7. احتضن الخلية المحللة عند 37 درجة مئوية عند إثارة 200 دورة في الدقيقة لمدة 80 دقيقة.
    8. قم بتدوير الليزات عند 12000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. اجمع السوبرناتانت وأليكوت 30 ميكرولتر لكل منهما في أنابيب دقيقة مبردة مسبقا 1.5 مل ، مع الحفاظ على جميع الأنابيب على الجليد.
    10. قم بتجميد أليكوتس الليزات على الثلج الجاف وخزنه على درجة حرارة -80 درجة مئوية.

3. معايرة المخزن المؤقت الخالي من الخلايا للحمض النووي الخطي

ملاحظة: تمت معايرة المخزن المؤقت الخالي من الخلايا للحصول على تركيزات Mg-glu و K-glu المثلى كما هو موضح في Sun et al.13. هناك حاجة إلى ملف تكميلي 1 لخطوات المعايرة. تم تعيين التفاعلات على حجم نهائي قدره 10.5 ميكرولتر لكل منهما. تمت معايرة المستخلصات باستخدام 1 نانومتر من الخط الخطي (انظر القسم 4 أدناه) أو الحمض النووي البلازميد. يمكن إجراء التجارب في نفس اليوم الذي يتم فيه إعداد المخازن المؤقتة ، أو يمكن تجميد المخازن المؤقتة المعدة عند -80 درجة مئوية لإجراء التجربة في يوم آخر. بالنسبة لجميع خطوات المعايرة ، تم إذابة كل مكون على الجليد قبل الخلط والسحب في صفيحة 384 بئرا.

  1. قم بإعداد مزيج رئيسي ، وفقا لعلامة التبويب "إعداد المخزن المؤقت" في ملف Excel الملف التكميلي 1 ، الذي يحتوي على: (أ) مستخلص الخلية (33٪ من إجمالي حجم التفاعل) ، (ب) الحمض النووي للمراسل (كحمض نووي خطي و / أو بلازميد) إلى تركيز نهائي قدره 1 نانومتر ، (ج) مخزن مؤقت خال من الخلايا (PEG8000 ، محلول AA ، ومحلول طاقة) ، و (د) K-glu إلى تركيز نهائي قدره 80 mM.
  2. للحصول على حجم تفاعل يبلغ 10.5 ميكرولتر، خذ 1.05 ميكرولتر (تفاعل إجمالي بنسبة 10٪) من تركيزات مختلفة من المخزونات المركزة Mg-glu 10x (نطاقات التركيز النهائية: 0 و 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 و 10 و 15 و 20 mM) وأضف 9.45 ميكرولتر (90٪ من التفاعل الكلي) من المزيج الرئيسي. اخلطي بلطف.
    ملاحظة: استخدم أنابيب PCR ذات ثمانية شرائح لإعداد التخفيفات وتخلط مع ماصة متعددة القنوات. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام مجموعة مختلفة من تركيزات Mg-glu.
  3. ماصة 10 ميكرولتر من التفاعلات المذكورة أعلاه في صفيحة صغيرة مربعة القاع 384 بئرا ، وتغطيتها باستخدام ختم لوحة لاصقة ، وقياس التعبير الجيني كناتج تألق. تسجيل بيانات التألق باستخدام قارئ لوحات (على سبيل المثال: 485 نانومتر; Em: 528 نانومتر) على فترات منتظمة (على سبيل المثال ، 5 دقائق) لمدة 8 ساعات من الحضانة عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري مستمر عند 307 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بتدوير الصفيحة الدقيقة 384 بئرا (<2500 × جم، 1 دقيقة، درجة حرارة الغرفة) قبل البدء في الحصول على البيانات. تم استخدام قياسات نقطة النهاية لمقارنة تعبير GFP في التراكيب العازلة المختلفة. يمكن تحويل قيم التألق إلى وحدات موحدة للرسم (انظر أدناه).
  4. تحديد تركيز Mg-glu الذي ينتج عنه أعلى قيمة فلورية عند نقطة النهاية.
    ملاحظة: إذا لم تكن متأكدا من تركيز Mg-glu الأمثل الذي تم الحصول عليه ، فكرر الخطوة 3.2 مع نطاقات تركيز أكثر تنوعا.
  5. باستخدام تركيز Mg-glu الأمثل ، انتقل إلى معايرة K-glu لمجموعة من التركيزات (20 و 40 و 60 و 80 و 100 و 120 و 140 و 160 و 180 و 200 و 220 و 240 mM) ، باستخدام نفس الأحجام المشار إليها في الخطوة 3.2. قم بإجراء التجربة وتحديد أعلى قيمة فلورية من بين تركيزات K-glu التي تم اختبارها. هذا يشير إلى التركيب العازل الأمثل ل Mg-glu و K-glu لهذا المحللات.
    ملاحظة: إذا لم تكن متأكدا من تركيز K-glu الأمثل الذي تم الحصول عليه ، فكرر الخطوة مع نطاقات تركيز أكثر تنوعا.
  6. بمجرد إنشاء قيم Mg-glu و K-glu ، قم بإعداد أنابيب المخزون لتكوين المخزن المؤقت الأمثل وفقا لحجم الدفعة التي تم الحصول عليها. استخدم علامة التبويب "إعداد المخزن المؤقت" في الملف التكميلي 1 لحساب عدد الأنابيب العازلة اللازمة ، و aliquot 38 ميكرولتر لكل أنبوب ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

4. إعداد الحمض النووي الخطي

ملاحظة: لمعايرة الليزات، يتم استخدام البلازميد P70a-deGFP. تم الحفاظ على هذا البلازميد في E. coli KL740 cl857 + (الجدول 6) للتحضير المصغر باستخدام مجموعة Plasmid Miniprep ، أو maxiprep باستخدام مجموعة Plasmid Maxiprep. تم تضخيم شظايا الحمض النووي الخطية المستخدمة كقوالب تعبير في التفاعلات الخالية من الخلايا باستخدام الاشعال والقوالب المدرجة في الجدول 7 والجدول 8.

  1. تضخم PCR من البلازميد P70a-deGFP باستخدام بوليميراز الحمض النووي مع الاشعال oligo المدرجة في الجدول 7. قم بإعداد تفاعلات PCR في حجم 50 ميكرولتر ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، باستخدام برنامج التدوير الحراري: [98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ 40 دورة × (98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية → 66 درجة مئوية لمدة 30 ثانية → 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية) ؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 4 درجات مئوية ∞].
  2. هضم الحمض النووي القالب في تفاعلات PCR عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من إنزيم تقييد DpnI لكل تفاعل PCR 50 ميكرولتر وحضانته عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، قم بتنقية تفاعل PCR باستخدام مجموعة تنظيف PCR و DNA و elute في الماء الخالي من النوكلياز.
  3. تحقق من منتجات PCR على جل أغاروز 1٪ (1x TAE) قبل الاستخدام.
  4. حدد كميا منتجات PCR النقية (أو تحضيرات البلازميد) باستخدام Nanodrop (ND-1000).
    ملاحظة: في حالة استخدام بوليميراز الحمض النووي / المخزن المؤقت المتوافق مباشرة مع التفاعل الخالي من الخلايا في المصب ، يمكن تخطي خطوة التنقية (الخطوة 2) بالكامل وقياس تركيز الحمض النووي غير النقي بواسطة فحص فلورومتري مع صبغة ملزمة للحمض النووي بدلا من ذلك (انظر Batista et al.10).

5. التنفيذ التجريبي

ملاحظة: بالإضافة إلى استخدام الملف التكميلي 1 لمعايرة مخزون المخزن المؤقت لكل دفعة من الليزات المعدة (أعلاه)، يوصى باستخدام علامة التبويب "إعداد التفاعل" في الملف لإعداد التفاعلات اللاحقة الخالية من الخلايا. وكما كان الحال من قبل، تم تعيين حجم التفاعلات عند 10.5 ميكرولتر لكل تفاعل، منها 10 ميكرولتر فقط يتم سحبها أخيرا إلى لوحة 384 بئرا للحصول على البيانات. هنا ، يتم استخدام 5 نانومتر من كل قالب للتعبير الخالي من الخلايا. من المهم أن تكون متسقا عند سحب التفاعلات - استخدم نفس الماصة ونوع النصائح. استغني بعناية لتجنب أي فقاعات في البئر أو أي سائل يلتصق بجدران البئر. إذا لزم الأمر، قم بتدوير اللوحة لأسفل (<2500 × جم، 1 دقيقة، درجة حرارة الغرفة).

  1. احسب وحدات التخزين المراد ماصتها عن طريق إدخال أوصاف العينة والنسخ المتماثلة اللازمة لكل عينة في علامة التبويب "إعداد التفاعل" في الملف التكميلي 1.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى حجم تفاعل آخر غير 10.5 ميكرولتر، يمكن أيضا إدخاله في الملف التكميلي 1. سيقوم الملف بحساب عدد أنابيب المخزونات العازلة المحسنة مسبقا وأنابيب استخراج الخلايا التي سيتم إذابتها على الجليد.
  2. قم بتسمية أنبوب دقيق سعة 1.5 مل لإعداد Optimal Master Mix (بشكل منفصل للحمض النووي الخطي والبلازميد) ، وأضف الأحجام الصحيحة من Buffer و Lysate ، واخلطه بلطف.
    ملاحظة: نظرا للاختلافات في تركيزات K-glu المثلى في المخازن المؤقتة الخاصة بها ، يجب عمل نسخ من علامة التبويب "إعداد التفاعل" لاستخدامها بشكل منفصل للحمض النووي الخطي والبلازميدي.
  3. ماصة عينات الحمض النووي أولا ، تليها المياه الخالية من النوكليز ، وأخيرا المزيج الرئيسي الأمثل (MM) من الخطوة 5.2. امزج التفاعل الخالي من الخلايا بلطف مع الماصة قبل إضافتها إلى قارئ الألواح مباشرة وتجنب أي فقاعات.
    ملاحظة: استخدم أنبوب PCR ثماني شرائح لخلط حجم التفاعل للحصول على نسخة متماثلة إضافية. على سبيل المثال ، إذا كان المقصود ثلاثة أضعاف التقنية ، فقم بإعداد مزيج لأربعة تفاعلات واترك حجما ميتا في الأنبوب من أجل تقليل أخطاء السحب أثناء إضافة العينات إلى اللوحة.
  4. إعداد التفاعلات في قارئ اللوحة (Ex 485 nm; م 528 نانومتر). سجلت عمليات التشغيل الحركية بيانات التألق على فترات منتظمة (على سبيل المثال ، 5 دقائق) لمدة 8 ساعات من الحضانة عند 30 درجة مئوية ، مع اهتزاز مداري مستمر عند 307 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: تم الإبلاغ عن قياسات نقطة النهاية كنقطة زمنية مدتها 8 ساعات. قيم التألق التي تم جمعها هي في وحدات تعسفية (a.u.) ، ولكن يمكن تحويلها إلى وحدات موحدة للرسم (انظر أدناه).

6. FITC و GFP القياس الكمي النسبي

ملاحظة: يتم تصدير تعبير GFP بواسطة قارئ اللوحات بوحدات التألق التعسفية (a.u). ومع ذلك ، يوصى باستخدام وحدات قياس موحدة من أجل مقارنة قيم التألق بين الإعدادات المختلفة (الدفعات والمعدات والمستخدمين والمختبرات). فيما يلي خطوات مفصلة لتحويل قيم التألق (a.u) إلى قيم مكافئة ل FITC و eGFP (μM) ، باستخدام منحنيات قياسية ل NIST-FITC و eGFP المؤتلف. قم بتخزين محلول مخزون NIST-FITC عند 4 درجات مئوية وقم بتخزين eGFP المؤتلف عند -20 درجة مئوية. تأكد من حماية محلول المخزون والتخفيفات التسلسلية من الضوء. عند التسليم ، يوصى باقتباس eGFP المؤتلف إلى أحجام أصغر لتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة.

  1. تحضير محلول من بورات الصوديوم 100 mM ، درجة الحموضة 9.5 ، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية.
  2. قم بإعداد 12 تخفيفا (70 ميكرولتر لكل منهما) للمنحنى القياسي ، 2x لكل خطوة (50 و 25 و 12.5 و 6.25 و 3.125 و 1.562 و 0.781 و 0.390 و 0.195 و 0.097 و 0.048 و 0 μM) من معيار FITC القابل للتتبع NIST من مخزون 50 ميكرومتر باستخدام محلول بورات الصوديوم. إعداد سلسلة التخفيف في ثلاثة أضعاف.
  3. على غرار الخطوة 6.2 ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية (70 ميكرولتر لكل منهما) من eGFP المؤتلف باستخدام محلول بورات الصوديوم (1.2 و 0.3 و 0.075 و 0.0188 و 0.0047 و 0.0012 و 0.0003 و 0.00007 و 0 ميكرومتر). لحساب المولاريتي ، ضع في اعتبارك الحجم الكامل للبروتين (28 كيلو دالتون) وتركيز eGFP النقي (1 جم / لتر). إعداد سلسلة التخفيف في ثلاثة أضعاف.
  4. أضف 20 ميكرولتر من كل تخفيف (تسعة آبار لكل منها = ثلاث سلاسل تخفيفات × ثلاث نسخ متماثلة تقنية) إلى صفيحة صغيرة مربعة القاع مكونة من 384 بئرا ، مغطاة بختم لوحة لاصقة ، واحتضنها في قارئ صفائح للقياس.
    ملاحظة: هنا ، كانت الإعدادات المستخدمة هي الإثارة: 485/20 ، الانبعاثات: 528/20 ، مع كسب 50. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام مجموعات إضافية من الطول الموجي / الكسب لمعايرة جزيئات الفلورسنت الأخرى و / أو إعدادات الكسب. لحساب عامل التحويل ، يلزم نفس إعدادات الطول الموجي والكسب للحصول على بيانات التألق GFP من التجارب الخالية من الخلايا وبيانات المنحنى القياسية.
  5. استخدم نطاق الإشارة الخطية (هنا، على سبيل المثال، [FITC] ≤ 0.781 ميكرومتر) لتناسب الميل [y = ax وR2] لكل شرط.
    ملاحظة: قد يختلف النطاق باختلاف الآلات والحلول القياسية المستخدمة.
  6. احفظ البيانات الخاصة بمعايرة FITC وeGFP لحساب القياسات النسبية للمختبر باتباع المثال الوارد في الجدول 9. قسمة القيم التي تم الحصول عليها في وحدات التألق التعسفية (a.u) على ميل المنحنى "a" القيمة (y = ax) لتقدير إنتاج GFP من حيث FITC أو eGFP.

النتائج

تظهر النتائج التمثيلية هنا بعد معايرة الليزات للحصول على مستويات Mg-glutamate و K-glutamate المثلى بشكل منفصل للحمض النووي الخطي والبلازميد (الشكل 1). يتشابه التركيز الأمثل ل Mg-glutamate عبر مستخلصات Δ recB و ΔrecBCD عند 8 mM (الشكل 1B). ومع ذلك ، فإن التركيز الأمثل للغلوت?...

Discussion

هنا ، نظهر أن محللات الخلايا المحضرة من E. coli BL21 Rosetta2 مع ضربة قاضية جينومية إما ل recB أو recBCD operon تدعم التعبير عالي البروتين من قوالب الحمض النووي الخطية. يضع هذا البروتوكول إجراء معايرة محللة خطوة بخطوة خاص بقوالب الحمض النووي الخطية (الشكل 2) ، وهي خطوة حاسمة تؤ?...

Disclosures

اي

Acknowledgements

تعترف ACB و JLF بدعم التمويل المقدم من منحة ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). تعترف JLF و JB بدعم التمويل المقدم من منحة ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). تعترف MSA و JLF بدعم التمويل من منحة ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). تعترف JB بالدعم المقدم من ERC بدءا من "COMPUCELL" (رقم المنحة 657579). يعترف مركز الكيمياء الحيوية الهيكلية بالدعم المقدم من البنية التحتية الفرنسية للبيولوجيا الهيكلية المتكاملة (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). تعترف MK بدعم التمويل المقدم من قسم MICA التابع ل INRAe ، وجامعة باريس ساكلاي ، و DIM-RFSI في منطقة Ile-de-France (IdF) ، و ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). تم دعم هذا العمل من خلال التمويل من خلال جائزة المجلس الأوروبي للبحوث الموحدة (865973 إلى CLB).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-YT BrothInvitrogen22712020
1.5 mL Safe-Lock tubesEppendorf301200861.5 mL microtube
384-well square-bottom microplateThermo Scientific Nunc142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)Sigma-AldrichP8877
adhesive plate sealThermo Scientific Nunc232701
AgarInvitrogen30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate)Sigma-AldrichA8937
BL21 Rosetta2Merck Millipore71402
BL21 Rosetta2 ΔrecBAddgene176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCDAddgene176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate)Sigma-Aldrich A9501
Chloramphenicol Sigma-AldrichC0378
CoA (Coenzyme A hydrate)Sigma-AldrichC4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, SterileCorning43079015 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, SterileCorning43082850 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate)Alfa Aesar J62238
DpnINEBR0176S
DTT (DL-Dithiothreitol)Sigma-AldrichD0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt)Sigma-AldrichF7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt)Sigma-Aldrich371701
HEPESSigma-Aldrich H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4)Carl Roth231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P)Sigma-AldrichP5655
K-glutamateAlfa AesarA17232
Mg-glutamate Sigma-Aldrich49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfoneMerck MilliporeSLGP033RBmembrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup KitNEBT1030SPCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep KitNEBT1010SPlasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) Sigma-Aldrich N6522
NIST-traceable FITC standardInvitrogenF36915NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kitMacherey-Nagel740414.1Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
plate readerBiotek Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP ProteinChromotekegfp-250recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master MixNEBM0492SDNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0492LDNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay KitThermoQ32850fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid SamplerbiotechrabbitBR1401801
SpermidineSigma-Aldrich85558
Sterile waterPurified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris baseLife Science products Cytiva17-1321-01 
tRNARoche10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505SONICSVC505sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate)Acros Organics 226310010
Water, nuclease-freeThermoR0581nuclease-free water

References

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
  3. Schinn, S. -. M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
  4. Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
  5. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  6. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
  7. Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
  8. Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
  9. Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
  10. Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
  11. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
  12. Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  13. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  14. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  15. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved