JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لإجراء وتحليل ربط وتنقل وتجميع جزيئات مفردة على أغشية دهنية مزدحمة اصطناعية باستخدام مجهر التألق الداخلي الكلي للانعكاس الداخلي (smTIRF) أحادي الجزيء.

Abstract

الأغشية الخلوية هي بيئات مزدحمة للغاية للتفاعلات الجزيئية الحيوية والإشارات. ومع ذلك ، فإن معظم التجارب في المختبر التي تسبر تفاعل البروتين مع الدهون تستخدم أغشية عارية ثنائية الطبقة. تفتقر هذه الأنظمة إلى تعقيدات الازدحام بالبروتينات والجليكان المدمجة في الغشاء وتستبعد تأثيرات الحجم المرتبطة بها التي تواجهها على أسطح الأغشية الخلوية. أيضا ، فإن السطح الزجاجي المشحون سلبا الذي تتشكل عليه الطبقات الثنائية للدهون يمنع الانتشار الحر للجزيئات الحيوية عبر الغشاء. هنا ، نقدم غشاء بوليمر دهني مميز جيدا كمحاكاة للأغشية الدهنية المزدحمة. يستخدم هذا البروتوكول الدهون المترافقة مع البولي إيثيلين جلايكول (PEG) كنهج عام لدمج الحشود في الطبقة الثنائية الدهنية المدعومة (SLB). أولا ، يتم تقديم إجراء تنظيف للشرائح المجهرية وأغطية الأغطية لإجراء تجارب جزيء واحد. بعد ذلك ، تتم مناقشة طرق توصيف PEG-SLBs وإجراء تجارب جزيء واحد لربط ونشر وتجميع الجزيئات الحيوية باستخدام تتبع جزيء واحد والتبييض الضوئي. وأخيرا، يوضح هذا البروتوكول كيفية مراقبة تجميع المسام النانوية للسم البكتيري المكون للمسام Cytolysin A (ClyA) على الأغشية الدهنية المزدحمة مع تحليل التبييض الضوئي أحادي الجزيء. يتم أيضا تضمين رموز MATLAB مع مجموعات بيانات المثال لإجراء بعض التحليلات الشائعة مثل تتبع الجسيمات واستخراج السلوك المنتشر وعد الوحدات الفرعية.

Introduction

الأغشية الخلوية هي أنظمة مزدحمة للغاية ومعقدة1. يمكن أن يكون للازدحام الجزيئي تأثير كبير على انتشار الكيانات المرتبطة بالغشاء مثل البروتين والدهون2،3،4. وبالمثل ، تتأثر التفاعلات ثنائية الجزيئات على الأغشية الدهنية مثل dimerization المستقبلات أو oligomerization من مجمعات الأغشية بالازدحام5،6،7. يمكن أن تحكم طبيعة وتكوين وتركيز الحشود ربط الغشاء والانتشار والتفاعل بين البروتين والبروتين بعدة طرق 8,9. نظرا لأن التحكم في ازدحام الأغشية على الأغشية الخلوية وتفسير تأثيرها على الجزيئات الحيوية المدمجة يمثل تحديا ، فقد حاول الباحثون إنشاء أنظمة بديلة في المختبر 10.

هناك نهج شائع للأغشية الاصطناعية المزدحمة وهو تخدير الأغشية ثنائية الطبقة بالبوليمر (مثل البولي إيثيلين جلايكول ، PEG) - الدهون المطعمة11,12. أثناء تصور ديناميكيات البروتين والدهون على الطبقات الثنائية للدهون المدعومة (SLBs) ، تحمي هذه البوليمرات بالإضافة إلى ذلك المكونات المضمنة في الغشاء من الركيزة سالبة الشحنة الأساسية (مثل الزجاج) عن طريق رفع الطبقة الثنائية بشكل فعال بعيدا عن الدعم الأساسي. من خلال تغيير حجم وتركيز البوليمر ، يمكن للمرء التحكم في مدى الازدحام الجزيئي ، وكذلك فصله عن الدعم الصلب الأساسي13,14. من الواضح أن هذه ميزة على الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة على ركائز صلبة بدون وسائد بوليمر15,16 ، حيث يمكن أن تفقد الجزيئات الحيوية عبر الغشاء نشاطها17,18,19. الأهم من ذلك ، أنه يسمح لنا بتلخيص البيئة المزدحمة لغشاء الخلية في المختبر ، وهو أمر بالغ الأهمية للعديد من عمليات الغشاء.

تخضع البوليمرات المطعمة على السطح على الأغشية أيضا لتغييرات في تكوينها اعتمادا على كثافة التطعيم12. في تركيزات منخفضة ، تبقى في تكوين ملفوف بشكل انتروبي ، يعرف باسم الفطر ، فوق سطح الغشاء. مع زيادة التركيز ، فإنها تبدأ في التفاعل وتميل إلى فك لفائف وتمتد ، مما يؤدي في النهاية إلى تكوين كثيف يشبه الفرشاة على الغشاء21. نظرا لأن الانتقال من الفطر إلى نظام الفرشاة غير متجانس للغاية ويتجلى في ظروف سيئة التمييز للبوليمر ، فمن المهم استخدام ظروف مميزة جيدا للازدحام على الأغشية المطعمة بالبوليمر. بالمقارنة مع دراسة حديثة20 ، فإننا نحدد ونبلغ عن تركيبات الأغشية المزدحمة التي تحافظ على النقل والنشاط المنتشرين للجزيئات الحيوية عبر الغشاء.

في هذا البروتوكول ، نناقش كيفية توليد أغشية دهنية PEGylated ونقدم توصيات لكثافات PEG التي تحاكي الازدحام في نظامين مختلفين من تكوين البوليمر (وهما الفطر والفرشاة). يصف البروتوكول أيضا ربط جزيء واحد ، وتتبع الجسيمات ، والحصول على بيانات التبييض الضوئي وتحليلها للجزيئات المضمنة في هذه الأغشية المزدحمة. أولا ، نصف خطوات التنظيف الشاملة ، وتجميع غرفة التصوير ، وتوليد PEG-SLBs. ثانيا ، نقدم تفاصيل عن ربط جزيء واحد ، وتتبع الجسيمات ، وتجارب التبييض الضوئي. ثالثا ، نناقش i) استخراج تقاربات الارتباط النسبية ، ii) توصيف الانتشار الجزيئي ، و iii) عد الوحدات الفرعية في تجميع البروتين من أفلام جزيئات واحدة على الغشاء.

في حين أننا ميزنا هذا النظام بالتصوير بجزيء واحد ، فإن البروتوكول مفيد لجميع علماء الفيزياء الحيوية في الأغشية المهتمين بفهم تأثير الازدحام على التفاعلات الجزيئية الحيوية على الأغشية الدهنية. بشكل عام ، نقدم خط أنابيب قوي لصنع طبقات ثنائية دهنية مزدحمة ومدعومة ، إلى جانب العديد من اختبارات الجزيء الواحد التي أجريت عليها وإجراءات التحليل المقابلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تنظيف الشريحة والغطاء للتجارب أحادية الجزيء

  1. قبل تجميع غرفة التصوير ، قم بتنظيف وإعداد كل من الأغطية والشرائح. قم بحفر أزواج متعددة من الثقوب على الشرائح الزجاجية باستخدام آلة حفر مزودة بتات حفر مغلفة بالماس (قطرها 0.5-1 مم). إذا تم استخدام صفائح الأكريليك ، فاستخدم قاطع ليزر لعمل ثقوب دقيقة (0.5 مم) ، كما هو موضح في الشكل 1.
    ملاحظة: سيكون كل زوج من الثقوب بمثابة مدخل ومخرج لتبادل التدفق لغرفة الموائع الدقيقة الفردية. يتوفر ملف CAD تمثيلي للثقوب في شريحة أكريليك في ملف الترميز التكميلي 1. عادة ما ينتهي الأمر بالثقوب المحفورة على الشرائح الزجاجية إلى أن تكون أكبر بمقدار 1.5 × 2 مرة من حجم مثقاب الحفر.
  2. نظف الشرائح والأغطية بالمنظفات. شطفها جيدا بالماء منزوع الأيونات. ضع الشرائح وأغطية الشرائح في جرة منفصلة ملطخة بالشرائح (كوبلين) بالماء وسونيكات في سونيكتور الحمام لمدة 30 دقيقة. بالنسبة لجميع خطوات الصوتنة، استخدم إعداد طاقة بقدرة 70 واط.
  3. قم بإزالة الماء واملأ جرة كوبلن التي تحتوي على الشرائح الزجاجية والأغطية بالأسيتون حتى الحافة (50-100 مل حسب حجم الجرة). في حالة صفائح الأكريليك ، استخدم نفس الحجم من محلول الأسيتون الممزوج مسبقا بنسبة 50٪ (v / v) وإلا ستصبح الشرائح فاترة. رج جرة كوبلن لضمان غمر جميع الشرائح والأغطية بالكامل في المحلول وسونيكات في سونيكتور الحمام لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بإزالة الأسيتون والتخلص منه في حاوية نفايات ، صب الميثانول في جرار كوبلن (50٪ ، v / v لشرائح الأكريليك) ، وسونيكات لمدة 30 دقيقة. يستخدم كل من الأسيتون والميثانول لإزالة الجسيمات العضوية على الشرائح.
  5. شطف الشرائح وأغطية مع كميات وفيرة من الماء من النوع 1 ووضعها في جرة كوبلن زجاجية. صب محلول 1 M KOH في الجرة والسونيكات لمدة 1 ساعة. بالنسبة لشرائح الأكريليك ، استخدم 0.5 متر من KOH.
  6. تخلص من KOH في حاوية نفايات غير عضوية. شطف الجرة مع الكثير من الماء ووضع الجرار كوبلن في غطاء الدخان لعلاج أسماك البيرانا. لا تقم بإجراء علاج البيرانا لشرائح الأكريليك. انتقل مباشرة إلى الخطوة 1.9.
    تحذير: يجب أن يتم علاج أسماك البيرانا في غطاء الدخان مع قفازات مناسبة ونظارات أمان ومئزر للتعامل مع الأحماض. محلول البيرانا هو عامل مؤكسد قوي ، ويزيل أي جزيئات عضوية متبقية من الشرائح والأغطية.
  7. لإعداد محلول البيرانا ، صب بلطف 2/3 حجم من حمض الكبريتيك (98 ٪ ، v / v) في كوب زجاجي واملأ الباقي ببيروكسيد الهيدروجين (30 ٪ ، v / v). امزج المحلول بعناية بقضيب زجاجي ، واسكبه في جرة كوبلن ، واترك جرة كوبلن في غطاء الدخان لمدة 1 ساعة على الأقل.
  8. قم بصب محلول البيرانا من جرة كوبلن في حاوية مهملة للنفايات الحمضية المحفوظة داخل غطاء الدخان. شطف جرة كوبلن مع كمية وفيرة من الماء من النوع 1.
  9. جفف الشرائح والأغطية في تيار لطيف من غاز النيتروجين وضعها في جرة كوبلن نظيفة. الشرائح المجففة والأغطية جاهزة الآن للمعالجة بالبلازما. خذ زوجا من الشرائح وأغطية الغطاء وضعها في آلة البلازما.
  10. خلق فراغ في الغرفة. أدر المقبض إلى تردد الراديو MHz 8-12 لتوليد البلازما في الغرفة. سيشير التوهج الأرجواني داخل الغرفة إلى تكوين بلازما في الغرفة.
  11. إجراء العلاج بالبلازما لمدة 8-10 دقائق. حرر الفراغ بلطف بعد إيقاف تشغيل البلازما وانتقل إلى الخطوة 2 لتجميع غرفة التصوير الموائع الدقيقة.

2. تجميع غرفة الموائع الدقيقة

ملاحظة: يتم إنشاء غرفة التصوير عن طريق وضع شريط على الوجهين بين غطاء تم تنظيفه مسبقا وانزلاق من الخطوة السابقة كما هو موضح أدناه.

  1. قم بتجميع الشرائح والغطاء بعد معالجة البلازما كما هو موضح في الشكل 1. ضع الشريحة الزجاجية على ورق مناديل نظيفة. قم بقص الشريط على الوجهين إلى شرائح بعرض ~ 2-3 مم وضعها على كل جانب من زوج من الثقوب على الشريحة الزجاجية. استخدم طرف ماصة لتسطيح الشريط أو سيؤدي إلى تسرب من قناة إلى أخرى.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، قم بقص الشريط الخاص بالشريحة بأكملها باستخدام قاطع ليزر أو راسمة آلي (الشكل 1).
  2. ضع الغطاء المعالج بالبلازما على الشريحة المسجلة لإغلاق الغرفة. استخدم طرف ماصة للضغط برفق على الغطاء على المناطق المسجلة لجعل القناة مانعة للماء.
  3. إذا كنت تستخدم شرائح زجاجية ، فقم بإغلاق الحواف باستخدام راتنجات الإيبوكسي. وأخيرا، فإن كل غرفة تصوير مصنوعة من شريحة وغطاء لها بعد 10 مم × 2 مم × 0.1 مم (الطول × العرض × العمق). قم بتخزين غرف التصوير الموائع الدقيقة المعدة لمدة 1-2 أسابيع في ظروف مجففة (يفضل أن تكون بين 10-25 درجة مئوية).
    ملاحظة: بالنسبة للأشرطة المقطوعة بالليزر المستخدمة مع شرائح الأكريليك ، ليس من الضروري استخدام الإيبوكسي لأن حواف الشريط تشكل ختما مقاوما للتسرب.

3. جعل الطبقات المزدوجة المدعومة على الركيزة الزجاجية عن طريق الانصهار الحويصلة

ملاحظة: يتم إنشاء طبقات ثنائية الدهون المدعومة المزدحمة على جدران غرفة التصوير عن طريق دمج الحويصلات الدهنية المحضرة بدهون PEG المنشطة.

  1. خذ قارورة زجاجية نظيفة ، ويفضل تنظيفها مسبقا باستخدام محلول البيرانا. أضف محلول الكلوروفورم من 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين (POPC) و 1,2-ديولويل-sn-glycero-3-فوسفويثانولامين-N-[أمينو (بولي إيثيلين جليكول)-2000] (DOPE-PEG2000) عند جزء الخلد المطلوب من دهون PEG2000 بحيث يكون التركيز النهائي بعد إضافة المخزن المؤقت 3 mM من الدهون في الخطوة 3.4. إعداد تركيبات غشاء أخرى من الدهون بالمثل.
  2. جفف الكلوروفورم من القارورة باستخدام تيار لطيف من النيتروجين مع دوامة صغيرة بحيث يتم طلاء الدهون المجففة بشكل موحد على سطح القارورة. ضع القارورة في مجفف فراغ لمدة 1 ساعة. سيؤدي ذلك إلى إزالة أي كلوروفورم متبقي في القارورة الزجاجية. أضف 1 مل من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد حويصلات أحادية الصفيحة الصغيرة (SUVs) كما هو موضح أدناه.
    1. دوامة بلطف لمدة 1-2 دقيقة بعد الحضانة بين عشية وضحاها حتى يتحول المحلول عكر وحليبي.
    2. خذ 100 ميكرولتر من هذا المحلول في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 500 ميكرولتر وسونيكات لمدة 1 ساعة تقريبا في سونيكتور الحمام (مضبوط على إعداد طاقة 70 واط). وسيصبح الحل واضحا. إذا لم يكن الأمر كذلك ، ثم سونيك لمدة 30 دقيقة إضافية. ستولد هذه الخطوة سيارات الدفع الرباعي التي يتراوح قطرها بين 50 و 100 نانومتر.
      ملاحظة: في حالة التحضير لأول مرة، قم بتوصيف سيارات الدفع الرباعي باستخدام تشتت الضوء الديناميكي22,23 (DLS) أو طريقة مكافئة.
  4. أضف كلوريد الكالسيوم (مخزون CaCl2 ، 3 M) إلى الحويصلات الصوتية بحيث يكون تركيزه النهائي 30 mM في محلول الدهون.
  5. قم بقص طرف ماصة دقيقة لحقن محلول العينة بحيث يتناسب بإحكام مع الحفرة. امزج محلول الدهون وحقنه من خلال أحد الثقوب الموجودة في غرفة التصوير المصنوعة في الخطوة 2. امسح المحلول الزائد الذي يخرج من الغرفة من المخرج بمنديل نظيف لمنع تلوث القنوات المجاورة.
  6. اترك هذه الجمعية في غرفة رطبة لمدة 90 دقيقة. قم بإعداد غرفة ترطيب عن طريق وضع نسيج مبلل في نهاية أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. ضع الشريحة جانبيا داخل الأنبوب مع إغلاق أغطية الأنبوب. سوف تندمج الحويصلات وتولد طبقة ثنائية موحدة على السطح الزجاجي.
  7. اغسل الغرفة جيدا بكمية وفيرة من المخزن المؤقت PBS (حوالي 5 أضعاف حجم غرفة التصوير). منع دخول فقاعات الهواء إلى الغرفة أثناء الغسيل لأن هذا يمكن أن يولد عيوبا في الغشاء.

4. إعداد المجهر وقياسات التصوير بجسيم واحد

ملاحظة: يتم إجراء تجارب الجزيء الواحد على إعداد مجهر الانعكاس الداخلي الكلي القائم على الهدف 24،25،26 (TIRF) (الشكل 2). يوفر التصوير TIRF نسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل للتصوير بجزيء واحد ، على الرغم من أنه يمكن أيضا استخدام المجاهر فوق الفلورية في ظل ظروف معينة (خاصة عندما يمكن إزالة الجزيئات الحيوية الفلورية من المحلول السائب عن طريق الغسيل). يمكن استخدام TIRF من نوع المنشور ولكن النوع الموضوعي هو الأفضل لسهولة إعداد الموائع الدقيقة27. بالنسبة ل TIRF من النوع الموضوعي، يوصى باستخدام هدف فتحة عددية عالية (تكبير 100x، وعادة ما يكون متاحا تجاريا كهدف TIRF).

  1. قبل إجراء أي تجربة على التنقل والتجميع ، قم بمحاذاة مجهر TIRF لضمان نسبة إشارة إلى ضوضاء مثالية بسبب الإضاءة بواسطة حقل الانحراف. أثناء المحاذاة ، حافظ على طاقة الليزر منخفضة ، بين 100 ميكروواط و 1 ميجاوات.
    تنبيه: يجب استخدام نظارات السلامة بالليزر أثناء محاذاة شعاع الليزر.
    1. لمحاذاة المجهر ، قم بإعداد عينة من حبة الفلورسنت عن طريق إضافتها إلى قناة الموائع الدقيقة بتركيزات منخفضة (عند ~ 100 PM) بحيث لا تتداخل بقع الفلورسنت من الخرز الفردي في الصور.
    2. أولا ، تصور الخرز في وضع epifluorescence. أثناء وجود الإضاءة في وضع التألق ، حرك مرحلة ترجمة مرآة M5 (المرآة التي تعكس الليزر إلى الديكرويك) بحيث ينحني الشعاع الخارج من الهدف حتى يصبح في النهاية في تكوين انعكاس داخلي كامل.
    3. تحقق مما إذا كانت إضاءة النقل البري الدولي (التير) قد تحققت. عندما يضيء حقل TIR المتفادي عينة الخرز، تحقق من أن الخرز الموجود على السطح فقط مرئي ولا يتم ملاحظة الخرز العائم الحر بعيدا عن السطح.
  2. في بداية التجربة ، اضبط طاقة الليزر على المستوى البؤري الخلفي الموضوعي على 5-10 ميجاوات لمنع التدمير الضوئي (التبييض الضوئي) للفلوروفورات.
  3. حافظ على الشريحة على مرحلة المجهر وركز على الغشاء العاري (بدون أي فلوروفورات) أولا. عادة ما تكون الآثار الصغيرة للشوائب في الأغشية الدهنية كافية للقيام بذلك. اختياري: قم بدمج عدد صغير من حبات الفلورسنت أو النقاط الكمومية (نطاق البيكومولار الفرعي) خلال الخطوة 3.1 ، بحيث لا يوجد سوى جزيئين إلى خمسة جسيمات فلورية في مجال الرؤية لتسهيل تحديد التركيز الصحيح.
  4. حقن العينة (بروتينات الغشاء ، وما إلى ذلك) باستخدام ماصة دقيقة في غرفة التصوير المطلية ب PEG-SLB المصنوعة في الخطوة 3.7.
  5. لقياس حركيات ربط الجزيء الواحد ، استخدم مضخة حقنة لتدفق الجزيئات الحيوية المصنفة من خلال ثقوب المدخل إلى غرفة الموائع الدقيقة (الشكل 3). استخدم معدل تدفق 50-500 ميكرولتر / دقيقة.
    1. ابدأ في الحصول على الفيلم قبل إضافة الحل إلى غرفة التصوير. احصل على >5000 إطار بمعدل إطارات يتراوح بين 25 و 50 إطارا / ثانية تحت التدفق المستمر حتى لا تكون هناك زيادة أخرى في ظهور بقع جديدة على سطح الغشاء (فيديو 1). لتحليل حركيات الربط ، اتبع الخطوات من 6.1.
  6. لتتبع الجسيمات المفردة، أضف الجزيئات الحيوية المسماة بتركيزات منخفضة (مقارنة بثابت الربط) إلى القناة باستخدام ماصة دقيقة. قم بتحسين التركيز إلى كثافة <0.1 جسيمات/ميكرومتر 2 بحيث نادرا ما تتقاطع الجسيمات الفردية مع المسارات (فيديو 2). وهذا يضمن الدقة العالية للمسارات المستردة من مجموعات البيانات. احتضان إذا لزم الأمر (في حالة ضعف ربط الغشاء بواسطة الجزيئات الحيوية ، ~ 10 دقائق) في بيئة رطبة وغسل الغرفة مع العازل.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى الغسيل في حالة ضعف الارتباط على الغشاء وتبقى معظم جزيئات الفلورسنت في المحلول. خلاف ذلك ، قد يتداخل هذا مع التصوير ويؤدي إلى ضعف نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  7. لتحليل مسار الجسيمات المفردة، احصل على 200-500 إطار عند 10-100 إطار/ثانية. حافظ على العدسة الموضوعية التي تركز على المستوى ثنائي الطبقة مع الحد الأدنى من انحراف المرحلة خلال فترة الاستحواذ.

5. الحصول على صورة لحساب الوحدات الفرعية في تجميع البروتين

ملاحظة: يتطلب الحصول على الصور لتقدير قياس الفلور التبييض المستمر للفلوروفورات والكشف عن عدد الخطوات حتى لا تنبعث المزيد من الفلوروفورات من التألق.

  1. لقياس الوحدات الفرعية، يضاف التركيز ذي الصلة للجزيئات الحيوية المصنفة (على سبيل المثال: انظر النتائج؛ تمت إضافة ClyA بتركيز 25 نانومتر) إلى غرفة التصوير الموائع الدقيقة واحتضانها (غسلها إذا لزم الأمر). احتضان الشريحة في غرفة ترطيب عند درجة الحرارة المطلوبة للفترة الزمنية المطلوبة (على سبيل المثال: 37 درجة مئوية و 60 دقيقة لتجميع ClyA).
  2. قم بإجراء الحصول على الصور للتبييض الضوئي أحادي الجزيء كما هو موضح أدناه.
    1. اغسل غرفة التصوير بمخزن مؤقت قبل التصوير (إذا لزم الأمر). ضع الشريحة على المجهر واضبط التركيز البؤري لتصور الجزيئات الموسومة.
    2. اضبط طاقة الليزر على مستوى يحدث فيه تبييض الفلوروفور تدريجيا (~ 1-5 دقائق). من الناحية المثالية ، لكل جزيء حيوي تم تجميعه ، حافظ على معدل خطوة التبييض الضوئي >10-20 إطارا للتصوير. احصل على الصور حتى يتم تبييض جميع الجزيئات بالكامل (فيديو 3).
      ملاحظة: لتحديد المدة الإجمالية لمسار التبييض الضوئي المطلوب، ارسم متوسط كثافة البقع الفردية بعدد إطارات التصوير وحدد ثابت الوقت عن طريق تركيب دالة الاضمحلال الأسي. يمكن ضبط المدة الإجمالية للاستحواذ على 5-10 أضعاف ثابت الوقت.
  3. قم بإجراء قياس تجميع يعتمد على الوقت من خلال بدء الحصول على الفيلم بمجرد إدخال العينة إلى الغرفة والحصول على أفلام تبييض ضوئي جديدة على فترات زمنية ثابتة بعد ربط الغشاء من أجزاء مختلفة من PEG-SLB.

6. تحليل الصور والبيانات

  1. قم بإجراء ربط وتتبع جسيم واحد كما هو موضح أدناه.
    1. استخراج مسارات الجسيمات المفردة من الأفلام التي تم الحصول عليها أعلاه، كما هو موضح في الشكل 4. للكشف عن الجسيمات الفردية وتتبعها ، استخدم حزمة MATLAB ، u-track28 ، أو Trackmate29 ، وهو مكون إضافي في ImageJ ، والذي يوفر أيضا خوارزمية قوية لتتبع الجسيمات المفردة. اتبع الخطوات لإعداد تحليل u-track كما هو موضح في الملف التكميلي 1.
      ملاحظة: المعلمات الحرجة لتتبع الجسيمات المفردة هي الانحراف المعياري لحجم الجسيمات (بالبكسل) وطول سد الفجوة. استخدم 1 و 0 ، على التوالي ، لهذه المعلمات كأكثر المعايير صرامة للتتبع.
    2. لحساب ثوابت معدل الربط، قم أولا بتقدير عدد الجسيمات المرتبطة بسطح الغشاء بمرور الوقت. استخدم ملف MATLAB binding_SPT (ملف الترميز التكميلي 2) مع مجلد الإخراج u-track لتحديد ورسم عدد الجسيمات التي تظهر على الغشاء الذي تم الحصول عليه من الخطوة 6.1. ملاءمة الحركيات المرصودة للنماذج الحركية المناسبة (على سبيل المثال: الملاءمة الأسية المفردة لتحديد ثابت الزمن، والتي يمكن تعيين عكسها إلى ثابت المعدل الظاهر)30 لاستخراج ثوابت المعدل (انظر النتائج، الشكل 5).
    3. تشير الإزاحة المتوسطة المربعة (MSD) للجسيمات المنتشرة (مثل مقتفي الحمض النووي في PEG-SLBs ، الشكل 6) إلى طبيعة الانتشار. استخدم حزمة MATLAB MSD_ISD (ملف الترميز التكميلي 2) مع مجلد الإخراج u-track للحصول على مخطط MSD كدالة لوقت التأخير (الشكل 6B).
    4. لتحديد الأنواع المنتشرة غير المتجانسة، احسب توزيعات الإزاحة التربيعية الفورية (ISD) كما هو موضح في الشكل 6C. ISD2 ، الذي يعرف بأنه (X t + τ - X t)2 + (Y t+ τ− Y t)2 ، حيث يفضل وقت التأخر ، τ = 2 ، لأنه يقلل من الضوضاء. قم بتصفية المسارات القصيرة بأقل من ثلاثة إطارات لتقليل الضوضاء.
    5. استخدم ISD_analyzer (ملف الترميز التكميلي 2) في MATLAB مع مخرجات المسار U لرسم ISDs للجسيمات المتعقبة (الشكل 6C).
  2. قم بإجراء تحليل التبييض الضوئي أحادي الجزيء كما هو موضح أدناه.
    1. لتقدير قياس ستويشيومتري لمجمعات الأغشية ، قم بإجراء تحليل التبييض الضوئي على الكثافة المعتمدة على الوقت لمجمعات الفلورسنت (فيديو 3). لهذا ، قم بتطبيق خوارزمية تصحيح الانجراف (drift_correct_images ، ملف الترميز التكميلي 2) استنادا إلى الارتباط التلقائي لإطارات الأفلام لاستخراج انحراف الترجمة. هذا يفترض أن الهياكل المجمعة غير متحركة إلى حد كبير أثناء الحصول على الصورة. قم بتشغيل حزمة MATLAB Extract_traces_1C (ملف الترميز التكميلي 2) للكشف عن آثار وقت كثافة الجسيمات من الأفلام.
    2. استخدم التعليمات البرمجية MATLAB Stepcount_immobile (ملف الترميز التكميلي 2) لإجراء الكشف عن الخطوة لتتبع وقت الكثافة. في حال لم تكن الجسيمات غير متحركة ، استخدم حزمة u-track لاستخراج موقع الجسيمات المتحركة. يمكن تعيين هذه المجموعة من إحداثيات xy إلى الأفلام الخام لاستخراج قيم كثافة الجسيم المتحرك أثناء انتشاره أفقيا على الغشاء. استخدم حزمة MATLAB utrack_Int (ملف الترميز التكميلي 2) مع الإخراج من تحليل المسار u-track لهذا الخيار.
    3. قم بإجراء تصحيح لوضع العلامات غير المكتملة على الجزيئات الحيوية باستخدام علامات الفلوروفور لتقدير قياس ستويشيومتري مركب البروتين الصحيح. تحديد كفاءة وضع العلامات باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية UV-VIS عن طريق قياس امتصاص الصبغة والبروتين لتقدير التركيز. احسب كفاءة وضع العلامات كنسبة مولية للصبغة إلى البروتين.
      ملاحظة: تمتص بعض الأصباغ أيضا بأطوال موجية قريبة من 280 نانومتر، وبالتالي، ينبغي حساب مساهمة الامتصاص هذه من قبل الصبغة أثناء حساب التركيز.
    4. قم بإجراء تصحيح ذو حدين لحساب كفاءة وضع العلامات غير المكتملة للفلوروفور بالطريقة التالية باستخدام رمز MATLAB Step_correction (ملف الترميز التكميلي 2) مع البيانات التي تم الحصول عليها من عد الخطوات في الخطوة 6.2.2. على سبيل المثال ، بالنسبة للسم المكون للمسام مثل Cytolysin A ، والذي يشكل بنية تشبه حلقة دوديكاميريك ، قم بتطبيق تصحيح ذو حدين باستخدام الصيغة التالية:
      نكfigure-protocol-16399
      حيث figure-protocol-16495 = كفاءة وضع العلامات ، n = عدد خطوات التبييض الضوئي ، و s = الأعداد الفعلية. استخدم Stepcount_immobile الروتينية MATLAB لاستعادة الأنواع قليلة القلة المصححة. تحويل تواتر الأوليغومرات (si) إلى كسور الكتلة (الشكل 7C; ملف الترميز التكميلي 2).
      ملاحظة: يتم تضمين مجموعة من الملفات التي تم تحليلها في ملف الترميز التكميلي 3. يمكن تشغيل رموز MATLAB في ملف الترميز التكميلي 2 باستخدام مجموعات البيانات هذه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

مراقبة ارتباط بروتين ClyA على أغشية PEGylated
بعد الخطوة 4.5 ، يتم تقدير حركية الربط عن طريق رسم عدد الجسيمات المرتبطة بسطح الغشاء بمرور الوقت (فيديو 1). عندما يرتبط بروتين ClyA بغشاء يحتوي على 5٪ من دهون PEG2000 مول ، تزداد كثافة الجسيمات وتصل إلى التشبع (الشكل 5). يعطي ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا ، نعرض تجارب جزيء واحد على الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) التي تظهر بيئة مزدحمة للجزيئات الحيوية المضمنة في الغشاء. تولد البيئة المزدحمة تأثير حجم مستبعد ، مما يؤدي إلى تعزيز التفاعلات الجزيئية الحيوية1،2،39،40

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يعترف المؤلفون بالبروفيسور بنيامين شولر لمشاركة تعبير البلازميد لبروتين ClyA. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج علوم الحدود البشرية (RGP0047-2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5 ml SyringesHMD HealthcareDispo Van, 2.5 ml TuberculinPlastic syringe
AcetoneFinar Chemicals10020LL025
Acrylic Sheet2 mm thick
Acrylic SheetBigiMall2 mm, Clear
Bath SonicatorBransonCPX-1800
Calcium Chloride
ChloroformSigma528730 HPLC grade
CholesterolAvanti700100
Coplin JarDuran Wheaton KimbleS60168 Slide Jar with Glass Cover
CoverslipsVWR631-157424 mm X 50 mm
Cy3-DNA StrandIDTGCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3)Cytiva Life SciencesPA23001
DiIInvitrogenD3911Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1Sigma AldrichGCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2Sigma AldrichCGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol StrandBiomersToco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000Avanti8801301,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape3MLF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated)0.5 - 1 mm
Drilling MachineDremel220Workstation
EMCCDAndorDU-897U-CS0-#BV
Fluorescence BeadsInvitrogenF10720
Glass SlidesBlue StarMicro Slides, PIC-1
Glass VialsSigma854190
Hydrogen PeroxideLobachemie0018230% Solution, AR Grade
LaboleneThermo-Fischer Scientific Detergent
Laser 532 nmCoherentSapphire
Laser CutterUniversal Laser SystemsILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPEAvanti8101501,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
MethanolFinar Chemicals30932LL025
MicroscopeOlympusIX81
Phosphate Buffer Saline (PBS)1X
Plasma CleanerHarrick Plasma IncPDC-002
POPCAvanti8504571-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe PumpNew Era Pump SystemsNE1010High Pressure Syringe Pump
PTFE CapsSigma27141
PTFE TubingCole-ParmerWW-06417-21Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric AcidSD Fine Chemicals98%, AR Grade
TIRF ObjectiveOlympusUPLAPO100XOHR
Vacuum DesiccatorTarsons
Vortex MixerTarsons

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006(2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908(2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708(2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264(2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722(2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031(2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047(2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475(2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved