JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يتم تقديم طريقة سهلة المتابعة لزراعة الخلايا الظهارية الصبغية الصبغية الأولية في المختبر في المختبر .

Abstract

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية المصطبغة المستقطبة ، وتقع بين المشيمية والشبكية العصبية في شبكية العين. يتم إجراء وظائف متعددة ، بما في ذلك البلعمة ، ونقل المغذيات / الأيض ، واستقلاب فيتامين أ ، وما إلى ذلك ، بواسطة RPE على أساس يومي. خلايا RPE هي خلايا ظهارية متمايزة نهائيا ذات قدرة تجدد قليلة أو معدومة. يؤدي فقدان خلايا RPE إلى أمراض عيون متعددة تؤدي إلى ضعف البصر ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر. لذلك ، فإن إنشاء نموذج زراعة في المختبر لخلايا RPE الأولية ، والتي تشبه إلى حد كبير RPE في الجسم الحي أكثر من خطوط الخلايا ، أمر بالغ الأهمية للدراسات المميزة والميكانيكية لخلايا RPE. بالنظر إلى حقيقة أن مصدر مقل العيون البشرية محدود ، فإننا ننشئ بروتوكولا لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن فصل خلايا RPE بسهولة عن مقل عيون الخنازير البالغة. بعد ذلك ، تلتصق هذه الخلايا المنفصلة بأطباق / إدخالات الثقافة ، وتتكاثر لتشكل طبقة أحادية متقاربة ، وتعيد بسرعة إنشاء السمات الرئيسية للأنسجة الظهارية في الجسم الحي في غضون 2 أسبوع. بواسطة qRT-PCR ، ثبت أن خلايا RPE الخنازير الأولية تعبر عن جينات توقيع متعددة بمستويات مماثلة مع أنسجة RPE الأصلية ، في حين أن تعبيرات معظم هذه الجينات تضيع / تنخفض بشكل كبير في الخلايا البشرية الشبيهة ب RPE ، ARPE-19. علاوة على ذلك ، يظهر تلطيخ التألق المناعي توزيع الوصلة الضيقة ، وقطبية الأنسجة ، وبروتينات الهيكل الخلوي ، بالإضافة إلى وجود RPE65 ، وهو إيزوميراز مهم لعملية التمثيل الغذائي لفيتامين أ ، في الخلايا الأولية المستزرعة. إجمالا ، قمنا بتطوير نهج سهل المتابعة لزراعة خلايا RPE الخنازير الأولية ذات النقاء العالي وميزات RPE الأصلية ، والتي يمكن أن تكون بمثابة نموذج جيد لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة سمية الخلايا ، وتسهيل فحوصات الأدوية.

Introduction

تقع ظهارة صبغة الشبكية (RPE) بين المستقبلات الضوئية والمشيمية الشعرية في الطبقة الخارجية من الشبكية1 مع وظائف متعددة ، بما في ذلك تشكيل حاجز الدم والشبكية ، ونقل وتبادل العناصر الغذائية ومستقلبات الشبكية ، وإعادة تدوير فيتامين أ للحفاظ على دورة بصرية طبيعية ، والبلعمة وإزالة الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية (POSs)2,3 . نظرا لأن نقاط البيع تتطلب تجديدا ذاتيا مستمرا لتوليد الرؤية ، فإن خلايا RPE تحتاج إلى ابتلاع نقاط البيع المنفصلة باستمرار للحفاظ على توازن الشبكية4. لذلك ، يؤدي الخلل الوظيفي في RPE إلى العديد من أمراض العيون المسببة للعمى ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)4 ، التهاب الشبكية الصباغي (RP)5 ، داء ليبر الخلقي6 ، اعتلال الشبكية السكري7 ، إلخ. حتى الآن ، لا يزال التسبب الدقيق لمعظم هذه الأمراض بعيد المنال. نتيجة لذلك ، تم إنشاء ثقافة خلايا RPE لدراسة بيولوجيا خلية RPE ، والتغيرات المرضية ، والآليات الأساسية.

كأبسط نموذج لدراسة بيولوجيا الخلية ، بدأت ثقافة خلايا RPE في وقت مبكر من 1920s8. على الرغم من أن ARPE-19 يستخدم على نطاق واسع كخلايا RPE ، إلا أن فقدان التصبغ ، ومورفولوجيا الحصى ، وخاصة وظائف الحاجز في خط الخلية هذا تثير الكثير من المخاوف9. وبالمقارنة ، فإن ثقافة خلايا RPE البشرية الأولية تقدم سيناريو أكثر واقعية للدراسات الفسيولوجية والمرضية9. ومع ذلك ، فإن التوافر المحدود نسبيا يقيد استخدامها والقضايا الأخلاقية موجودة دائما. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت عدة مجموعات نماذج الماوس لزراعة خلايا RPE. ومع ذلك ، فإن حجم عين الفأر صغير ، وعادة ما تتطلب ثقافة واحدة العديد من الفئران ، وهو أمر غير مناسب9. في الآونة الأخيرة ، طور العلماء طرقا جديدة لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لاشتقاق خلايا RPE. على الرغم من أن هذه التقنية لها إمكانات خاصة لعلاج اضطرابات RPE الموروثة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا وعادة ما تتطلب عدة أشهر لتوليد خلايا RPE الناضجة10. للتغلب على هذه المشاكل ، نقدم هنا بروتوكولا سهل المتابعة لعزل وزراعة خلايا RPE عالية النقاء في المختبر بشكل روتيني. في ظل ظروف الثقافة المناسبة ، يمكن لهذه الخلايا عرض وظائف RPE النموذجية وإظهار أشكال RPE النموذجية. لذلك ، يمكن أن توفر طريقة الاستزراع هذه نموذجا جيدا لفهم فسيولوجيا RPE ، ودراسة السمية الخلوية ، والتحقيق في الآليات المرضية لأمراض العين ذات الصلة ، وإجراء فحوصات الأدوية.

Protocol

امتثل استخدام التجارب للوائح جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات إدارة التجارب بجامعة شيامن.

1. تحضير الأجهزة الجراحية التجريبية ، وإنزيم هضم الأنسجة ، ومخزن زراعة الخلايا

  1. قم بإعداد الأجهزة الجراحية التجريبية ، عن طريق تنظيف وتعقيم زوجين من المقصات والملقط الجراحي للعيون في اليوم السابق لتشريح مقلة العين ، وبعد ذلك تجفيف الصندوق بالأجهزة الجراحية في فرن بروتوكول عام عند 65 درجة مئوية طوال الليل.
  2. الإعداد الإعلامي الثقافي.
    1. تحضير DMEM / الوسائط الأساسية المكملة ب 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني ، 2 مليمتر L-جلوتامين ، و 1٪ (v / v) بنسلين (100 وحدة / مل) وستربتومايسين (100 وحدة / مل).
    2. تحضير وسائط DMEM / F12 المكملة ب 1٪ (v / v) FBS ، و 1٪ (v / v) البنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (100 وحدة / مل).
    3. تحضير MEM-Nic 11 ، عن طريق تكملة MEM alpha ب 2 mM L-glutamine ، 1٪ FBS ، 1٪ (v / v) البنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (100 وحدة / مل) ، 0.1 mM NEAA ، 1٪ (v / v) N1 الملحق ، توراين (0.25 ملغ / مل) ، هيدروكورتيزون (20 نانوغرام / مل) ، ثلاثي يودو ثيرونين (0.013 نانوغرام / مل) ، و10 مللي متر نيكوتيناميد.
      ملاحظة: لتحسين صلاحية الخلية وتكاثرها ، يمكن زيادة النسبة المئوية ل FBS إلى 20٪ لتحييد إنزيمات الهضم وزرع الخلايا المنفصلة. بالنسبة لزراعة الخلايا على المدى الطويل ، يمكن تقليل النسبة المئوية ل FBS إلى 1٪ 12.
  3. قم بإذابة حصة إنزيم هضم الأنسجة (0.25٪ (وزن / حجم) محلول تربسين / EDTA مكمل ب 0.91 mM EDTA ، يشار إليه فيما يلي باسم محلول Trypsin / EDTA) أثناء التجربة.
    ملاحظة: يجب استخدام محلول Fresh Trypsin / EDTA في كل مرة للحصول على أفضل النتائج. احصل على 10 مل من محلول Trypsin / EDTA الطازج في كل أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل وقم بتجميد القسمة في ثلاجة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. حل التشريح.
    1. تعقيم 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (درجة الحموضة 7.2) مكمل ب 2٪ (v / v) البنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (100 وحدة / مل) عن طريق تصفية المحلول من خلال وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر.
  5. معطف لوحات الثقافة وإدراج transwell.
    1. اغسل الآبار وإدراج transwell مع 1x PBS. قم بإزالة PBS من الآبار و transwells باستخدام ماصة ، ثم أضف 1 مل من 1x PBS الطازج إلى الغرفة السفلية و 600 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل من محلول الصفيحة إلى الغرفة العلوية.
    2. احتضان الألواح / إدخالات transwell في حاضنة زراعة الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. قم بإزالة محلول اللامينين من الغرفة العلوية واغسله ب 1 مل من 1x PBS البارد مرتين قبل بذر الخلايا.

2. تشريح خلايا RPE مقلة العين الخنازير

  1. إعداد الصكوك.
    1. نظف غطاء التدفق الصفحي بنسبة 75٪ من الإيثانول وضوء الأشعة فوق البنفسجية. قم بإعداد ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل تحتوي على ~ 25 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ ، وثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل تحتوي على ~ 25 مل من 1x PBS ، وثلاثة أطباق زراعة خلايا معقمة مقاس 10 سم تحتوي على ~ 15 مل من 1x PBS.
      ملاحظة: عادة ما تستخدم هذه الإعدادات لتشريح أربعة مقل عيون خنازير. يرجى توسيع نطاقها عند استخدام المزيد من مقل العيون. لتحسين صلاحية الخلية ، قم بتبريد 1x PBS على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل. كل من 75٪ من الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية ضروريان لضمان عدم تلوث الأدوات والخلايا التجريبية. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية مسبقا لتعقيم طاولة التشغيل بالكامل لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  2. تنظيف مقل العيون الخنازير.
    1. الحصول على مقل العيون الطازجة من المسلخ والاحتفاظ بها على الجليد حتى تشريح. انقع أربعة مقل عيون خنزير في ~ 15 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ في طبق بتري 10 سم واستخدم مقصا وملقطا لقطع جميع الأنسجة الضامة والعضلات المتبقية.
      ملاحظة: قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة من خارج الصلبة لتقليل التلوث. لا تقطع العصب البصري في هذا الوقت لتسهيل نقل مقل العيون أثناء خطوة إزالة التلوث والغسيل. بعد هذه الخطوة ، يجب تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء تدفق رقائقي.
  3. تطهير مقل عيون الخنازير عن طريق نقع وغسل أربعة مقل عيون خنزير في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل مملوءة بنسبة 75٪ من الإيثانول بطريقة متسلسلة ؛ يتم غمس كل مقلة عين لمدة 5 دقائق على الأقل في كل أنبوب. بعد ذلك ، اغسل مقل عيون الخنازير في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل مملوءة ب 1x PBS بطريقة متسلسلة ؛ اغسل كل مقلة عين لمدة 5 دقائق على الأقل في كل أنبوب (الشكل 1 أ). اقلب الأنابيب كل دقيقة لغسل مقل العيون جيدا.
  4. تشريح مقل العيون الخنازير.
    1. انقل مقل العيون الخنازير الأربعة إلى طبق زراعة خلايا معقمة مقاس 10 سم يحتوي على 1x PBS. قم بقص السطح الخارجي لكل مقلة عين مرة أخرى لإزالة العصب البصري والحطام الصغير (الشكل 1 ب). استخدم المقص لعمل قطع صغير عند تقاطع الحافة والصلبة ، ثم قم بإزالة القرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي والشبكية العصبية (للحصول على الهياكل التفصيلية لهذه الأنسجة ، يرجى الرجوع إلى الشكل 1).
    2. انقل مركب RPE-choroid-sclera إلى طبق زراعة خلايا جديد بطول 10 سم وقم بعمل أربع قطع لتسطيح فنجان العين على شكل برسيم من أربع أوراق (الشكل 1C).
  5. قم بإجراء عملية هضم محلول التربسين / EDTA عن طريق وضع مجمعات RPE-choroid-sclera الأربعة في طبق جديد بحجم 10 سم. صب 20 مل من محلول Trypsin / EDTA الطازج لدمج مجمعات RPE-choroid-sclera ووضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 30 دقيقة.
    ملاحظة: استخدم محلول Trypsin/EDTA الجديد لفصل خلايا RPE. تحكم بعناية في وقت هضم محلول التربسين / EDTA ، حيث أن وقت الحضانة الأطول (أكثر من 30 دقيقة) قد يزيد من تلوث أنواع أخرى من الخلايا.

3. عزل وثقافة خلايا RPE مقلة العين الخنازير

  1. تفكك RPE.
    1. أخرج الطبق من الحاضنة بعد 30 دقيقة من الحضانة بمحلول Trypsin / EDTA وأضف 20 مل من وسائط الاستزراع الدافئة مسبقا (مع 10٪ FBS) إلى الطبق لتحييد محلول Trypsin / EDTA.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم استخدام وسائط DMEM/Basic فقط. عندما تصل الخلايا إلى نقطة التقاء ، يمكن استخدام ثلاثة وسائط استزراع اعتمادا على الظروف التجريبية: DMEM / الوسائط الأساسية ، وسائط DMEM / F12 ، ووسائط MEM-Nic.
    2. استخدم ماصة نقل سعة 5 مل لفصل خلايا RPE عن طريق السحب برفق عدة مرات. اجمع معلقات الخلايا في أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل. استخدم 10 مل أخرى من وسائط الاستزراع الطازجة (10٪ FBS) لغسل مجمعات RPE-choroid-sclera على الطبق عن طريق السحب برفق للحصول على أكبر عدد ممكن من خلايا RPE.
      ملاحظة: لا تسحن الخلايا بقوة كبيرة. تأكد من ملء وتفريغ الماصة بمعدل حوالي 3 مل / ثانية. تجنب فقاعات تعليق الخلية.
  2. اجمع خلايا RPE عن طريق طرد الأنابيب بالطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط المادة الطافية باستخدام ماصة وأضف 5 مل أخرى من وسائط الاستزراع (10٪ FBS) لإعادة تعليق الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق أخرى. صب المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 12 مل من وسائط الثقافة.
    ملاحظة: عند استنشاق المادة الطافية، اترك حوالي 1 مل من الوسائط لتجنب كسر كتل الخلايا.
  3. بذر خلايا RPE.
    1. البذور ~ 1-2 × 105 خلايا / بئر في 12 لوحة ثقافة بئر أو إدراج transwell. عادة ، يتم الحصول على حوالي 1.5 × 106 خلايا RPE من أربعة مقل عيون خنازير. قم بتغيير وسائط الاستزراع كل يومين وتقليل تركيز المصل إلى 1٪ عندما تغطي الخلايا سطح الآبار / الإدخالات بالكامل.
      ملاحظة: لا تحرك طبق زراعة الخلايا بشكل متكرر قبل أن تلتصق الخلايا بصحن / إدخالات الثقافة.
  4. تغيير وسائط الثقافة كل 2 أيام حتى يتم حصاد الخلايا.
    ملاحظة: يمكن تقليل تركيز FBS بعد وصول الخلايا إلى نقطة التقاء، ويمكن استزراع الخلايا لمدة تصل إلى عدة أشهر للسماح بالتمايز والنضج الكاملين.

4. توصيف خلايا RPE الخنازير الأولية

  1. استزرع الخلايا عند التقاء لمدة 1 أو 2 أسبوع ، ثم احصد الخلايا لمزيد من التحليل.
  2. خلايا الحصاد لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR).
    1. قم بإزالة وسائط الاستزراع ، واغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS البارد ، ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول استخراج الحمض النووي الريبي في كل بئر لجمع محللة الخلية من حوالي 1 × 106 خلايا.
    2. استخراج mRNA13 ؛ يتم استخراج ما يقرب من 4 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي من كل عينة. استخدم 100 نانوغرام من mRNA لإجراء النسخ العكسي14 ؛ قم بتخفيف cDNA 40 ضعفا لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. يتم سرد الاشعال في الجدول 1.
  3. خلايا الحصاد لتلطيخ المناعي.
    1. قم بإزالة وسائط المزرعة ، واغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS البارد ، ثم أضف 500 ميكرولتر من 4٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد في 1x PBS لإصلاح الخلايا (حوالي 1 × 106 خلايا / بئر) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS مرتين وقم بإجراء تلطيخ المناعي بالأجسام المضادة الأولية (1: 100 في 1x PBS مكملة ب 1٪ (وزن / صوت) ألبومين مصل البقري) عند 4 درجات مئوية طوال الليل والأجسام المضادة الثانوية (1: 200 في 1x PBS تستكمل ب 1٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقري) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة وفقا للبروتوكولات عبر الإنترنت15.
    2. يتم الحصول على صور التألق المناعي بواسطة مجهر متحد البؤر يتبع الدليل عبر الإنترنت16.
  4. خلايا الحصاد لتحليل اللطخة الغربية.
    1. قم بإزالة وسائط الاستزراع ، واغسل الخلايا ببارد 1x PBS مرتين ، ثم أضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA (مع 1x مثبط الأنزيم البروتيني) في كل بئر واستخدم كاشطات الخلايا لخدش حوالي 1 × 106 خلايا من الأطباق / الإدراجات.
    2. اجمع محللة الخلية من كل بئر / أدخلها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. غلي تحلل الخلية لمدة 10 دقائق ثم قم بقياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعات BCA ؛ تركيز البروتين لكل عينة حوالي 2 ملغ / مل. استخدم 25 ميكروغرام من البروتينات لكل عينة لتحليل اللطخة الغربية وفقا للبروتوكولات عبر الإنترنت17.
    3. بالنسبة للبقع الغربية ، قم باحتضان الأغشية في 5 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية (1: 1000 تخفيف من الأجسام المضادة الأولية في محلول 1x TBST مكمل ب 5٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل بقري) عند 4 درجات مئوية طوال الليل على شاكر دوار متعدد الأغراض.
    4. بعد ذلك ، احتضن الغشاء بحوالي 15 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوي المضاد للأرانب أو الفئران (1: 5000 تخفيف للأجسام المضادة الثانوية في محلول 1x TBST المكمل ب 5٪ (وزن / حجم) حليب خالي الدسم) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على شاكر مداري ، وفقا لمصدر الجسم المضاد الأولي المستخدم.
  5. قياس المقاومة عبر الظهارة (TER).
    1. اغسل أقطاب عود تناول الطعام بنسبة 70٪ من الإيثانول و 1x PBS المعقمة بطريقة متسلسلة. ثم ضع الطرف الأقصر للقطب في الغرفة العلوية والطرف الأطول في الغرفة السفلية لإدخالات transwell وانقر فوق الزر الموجود على مقياس الفولتميتر الظهاري للقياسات. سجل قياسات TER لكل بئر في ثلاث نسخ.

النتائج

تم استزراع خلايا RPE الخنازير الأولية (pRPE) في وسائط DMEM / Basic بنسبة 10٪ FBS ، وتم تصوير مورفولوجيا الخلية تحت المجهر الضوئي في يومين (الشكل 2A) و 6 أيام (الشكل 2B) و 10 أيام (الشكل 2C) بعد البذر. بعد 1 أسبوع ، لوحظت طبقة أحادية متقاربة من خلايا pRPE المصطبغة مع...

Discussion

هنا ، تم وصف بروتوكول مفصل ومحسن لعزل وثقافة وتوصيف خلايا RPE من مقل عيون الخنازير ، والذي يولد نموذجا جيدا للتوصيف المختبري لخلايا RPE ودراسات الاضطرابات المتعلقة ب RPE. تم وصف طرق عزل RPE عن عيون الإنسان والفأر والفئران سابقا23،24،25. ومع ذ?...

Disclosures

كشف جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يود المؤلفون إظهار امتنانهم واحترامهم لجميع الحيوانات التي تساهم بخلاياها في هذه الدراسة. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0111200 ، Yi Liao و Yuan Gao و Grant nos. 2018YFA0107301 ، Wei Li). يشكر المؤلفون Jingru Huang و Xiang You من المختبر المركزي ، كلية الطب ، جامعة شيامن على الدعم الفني في التصوير البؤري.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ARPE-19 cellsCCTCCGDC0323
Bovine serum albuminYeasen36101ES60
Confocal microscopyZeissLSM 880 with Airyscan
ChemiDoc TouchBio-Rad1708370
Cell scraperSangonF619301
10 cm culture dishNEST121621EH01
12-well culture plateNEST29821075P
DMEM F12 MediumGibcoC11330500BT
DMEM basic MediumGibcoC11995500BT
EVOM2World Precision InstrumentsEVOM2For TER measurement
Fetal bovine serumExCell BioFSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRPBio-Rad0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRPBio-Rad5196-2504
hydrocortisoneMCEHY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)ThermoFisher Scientific62249
LightCycler 96 InstrumentRoche5815916001
LiothyronineMCEHY-A0070A/CS-4141
lamininSigma-AldrichL2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX MediumGibco10566-016
MEM NEAA(100X)Gibco11140-050
Millex-GP syringe filter unitMilliporeSLGPR33RB
N1Sigma-AldrichSLCF4683
NcmECL UltraNew Cell&Molecular BiotechP10300
Non-fat Powdered MilkSolarbioD8340
NicotinamideSparkJadeSJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibodyAbcamab76020Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)EpizymePG112
primary Human RPE cells --Generous gift from Shoubi Wang lab 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific23225
PrismGraphPad by Dotmaticsversion 8.0
Protease Inhibitor CocktailsAPExBIOK1024
PRE65 antibodyProteintech17939-1-APRecognize both human and porcine proteins
PEDF antibodySanta Cruz Biotechnologysc-390172Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin Biological Industries03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)RARBIORA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master MixToyoboFSQ-201
RIPA bufferThermoFisher Scientific 89900
15 mL sterile centrifuge tubesNEST601052
50 mL sterile centrifuge tubesNEST602052
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
TaurineDamas-beta107-35-7
TrizolThermo-Fisher 15596026RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR430A
12-well transwell insertsLabselect14212
VEGF antibodyProteintech19003-1-APRecognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kitNovusbioVAL106
ZO-1 antibodyABclonalA0659Recognize both human and porcine proteins

References

  1. Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
  2. Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  4. Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
  5. Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
  6. den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
  7. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  8. Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
  9. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  10. D'Antonio-Chronowska, A., D'Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
  11. Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
  12. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  13. . Scientific, T Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document (2022)
  14. . Toyota Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022)
  15. . Abcam Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022)
  16. . Zeiss Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022)
  17. . Cell Signal Technology Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022)
  18. Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
  19. Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
  20. Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
  21. Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
  22. Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
  23. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  24. Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
  25. Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved