JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر Cladonema. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع مع علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، ويتيح وضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine تحديد الخلايا المتكاثرة. معا ، يمكن اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط.

Abstract

يظهر Cnidarians ، بما في ذلك شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية وقناديل البحر ، مورفولوجيا وأنماط حياة متنوعة تتجلى في الاورام الحميدة اللاطئة و medusae السباحة الحرة. كما يتضح من النماذج الراسخة مثل Hydra و Nematostella ، تساهم الخلايا الجذعية و / أو الخلايا التكاثرية في تطوير وتجديد الاورام الحميدة cnidarian. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية الأساسية في معظم قناديل البحر ، وخاصة في مرحلة ميدوسا ، غير واضحة إلى حد كبير ، وبالتالي ، فإن تطوير طريقة قوية لتحديد أنواع معينة من الخلايا أمر بالغ الأهمية. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum. تمتلك Cladonema medusae مخالب متفرعة تنمو باستمرار وتحافظ على قدرتها على التجدد طوال مرحلة البلوغ ، مما يوفر منصة فريدة لدراسة الآليات الخلوية التي تنظمها الخلايا المتكاثرة و / أو الشبيهة بالجذعية. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع (FISH) باستخدام علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، بينما يتيح وضع العلامات النبضية باستخدام 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، وهي علامة طور S ، تحديد الخلايا المتكاثرة. من خلال الجمع بين كل من وضع العلامات FISH و EdU ، يمكننا اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع المتكاثرة بنشاط على الحيوانات الثابتة ، ويمكن تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع على الحيوانات الأخرى ، بما في ذلك أنواع قناديل البحر غير النموذجية.

Introduction

تعتبر Cnidaria شعبة metazoan متفرعة بشكل أساسي تحتوي على ذات أعصاب وعضلات ، مما يضعها في وضع فريد لفهم تطور نمو الحيوان وعلم وظائف الأعضاء 1,2. يتم تصنيف Cnidarians إلى مجموعتين رئيسيتين: Anthozoa (على سبيل المثال ، شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية) تمتلك فقط يرقات planula ومراحل polyp sessile ، في حين أن Medusozoa (أعضاء Hydrozoa و Staurozoaو Scyphozoa و Cubozoa) عادة ما تأخذ شكل medusae السباحة الحرة ، أو قنديل البحر ، وكذلك يرقات planula والأورام الحميدة. عادة ما يظهر Cnidarians قدرة عالية على التجدد ، وقد جذبت آلياتهم الخلوية الأساسية ، وخاصة امتلاكهم للخلايا الجذعية البالغة والخلايا التكاثرية ، الكثير من الاهتمام 3,4. تم تحديد الخلايا الجذعية الهيدروزوانية في البداية في هيدرا ، وتقع في الفراغات الخلالية بين الخلايا الظهارية الأديم الظاهر ويشار إليها عادة باسم الخلايا الخلالية أو الخلايا i3.

تشترك خلايا Hydrozoan i في خصائص مشتركة تشمل تعدد القدرات ، والتعبير عن علامات الخلايا الجذعية المحفوظة على نطاق واسع (على سبيل المثال ، Nanos ، Piwi ، Vasa) ، وإمكانية الهجرة3،5،6،7،8. كخلايا جذعية وظيفية ، تشارك الخلايا i على نطاق واسع في التطور وعلم وظائف الأعضاء والاستجابات البيئية للحيوانات الهيدروزوانية ، مما يشهد على قدرتها العالية على التجدد واللدونة3. في حين أن الخلايا الجذعية ، على غرار الخلايا i ، لم يتم تحديدها خارج الهيدروزوان ، حتى في الأنواع النموذجية الراسخة Nematostella ، لا تزال الخلايا التكاثرية تشارك في صيانة وتجديد الأنسجة الجسدية ، وكذلك الخط الجرثومي9. نظرا لأن الدراسات في التطور والتجديد cnidarian قد أجريت في الغالب على من نوع polyp مثل Hydra و Hydractinia و Nematostella ، فإن الديناميات الخلوية ووظائف الخلايا الجذعية في أنواع قناديل البحر لا تزال دون معالجة إلى حد كبير.

تم استخدام قنديل البحر الهيدروزواني Clytia hemisphaerica ، وهو نوع من قناديل البحر العالمية ذات الموائل المختلفة حول العالم ، بما في ذلك البحر الأبيض المتوسط وأمريكا الشمالية ، كحيوان نموذجي تجريبي في العديد من الدراسات التنموية والتطورية10. بفضل صغر حجمها وسهولة التعامل معها وبيضها الكبير ، فإن Clytia مناسبة لصيانة المختبر ، وكذلك لإدخال الأدوات الوراثية مثل الجينات المحورة التي تم إنشاؤها مؤخرا وطرق خروج المغلوب11 ، مما يفتح الفرصة لإجراء تحليل مفصل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء بيولوجيا قنديل البحر. في مخالب Clytia medusa ، تتمركز الخلايا i في المنطقة القريبة ، والتي تسمى البصلة ، وتهاجر الأسلاف مثل الأرومات الخيطية إلى الطرف البعيد بينما تتمايز إلى أنواع خلايا متميزة ، بما في ذلك الخلايا الخيطية12.

أثناء تجديد Clytia manubrium ، العضو الفموي لقناديل البحر ، تهاجر خلايا Nanos1 + i الموجودة في الغدد التناسلية إلى المنطقة التي يفقد فيها manubrium استجابة للضرر وتشارك في تجديد manubrium7. تدعم هذه النتائج فكرة أن الخلايا i في Clytia تتصرف أيضا كخلايا جذعية وظيفية تشارك في التشكل والتجديد. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن خصائص الخلايا i تختلف بين الحيوانات التمثيلية من نوع الاورام الحميدة مثل Hydra و Hydractinia3 ، فمن الممكن أن تتنوع خصائص ووظائف الخلايا الجذعية بين أنواع قناديل البحر. علاوة على ذلك ، باستثناء Clytia ، كانت التقنيات التجريبية محدودة لقناديل البحر الأخرى ، والديناميات التفصيلية للخلايا التكاثرية والخلايا الجذعية غير معروفة13.

قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum هو كائن نموذجي ناشئ يمكن الاحتفاظ به في بيئة معملية بدون مضخة مياه أو نظام ترشيح. تحتوي Cladonema medusa على مخالب متفرعة ، وهي سمة مشتركة في عائلة Cladonematidae ، وعضو مستقبلات ضوئية يسمى ocellus على طبقة الأديم الظاهر بالقرب من المصباح14. تحدث عملية تفرع اللامسة في موقع تفرع جديد يظهر على طول الجانب المحوري من المجسة. بمرور الوقت ، تستمر المجسات في الاستطالة والتفرع ، مع دفع الفروع القديمة نحو الطرف15. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتجدد مخالب كلادونيما في غضون أيام قليلة عند البتر. اقترحت الدراسات الحديثة دور الخلايا المتكاثرة والخلايا الشبيهة بالجذع في تفرع اللامسة وتجديدها في Cladonema16,17. ومع ذلك ، في حين تم استخدام التهجين التقليدي في الموقع (ISH) لتصور التعبير الجيني في Cladonema ، نظرا لدقته المنخفضة ، فمن الصعب حاليا مراقبة ديناميكيات الخلايا الجذعية على المستوى الخلوي بالتفصيل.

تصف هذه الورقة طريقة لتصور الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية في Cladonema بواسطة FISH والتلوين المشترك مع EdU ، وهي علامة على تكاثر الخلايا18. نتصور نمط التعبير عن Nanos1 ، وهي علامة الخلايا الجذعية 5,17 ، بواسطة FISH ، والتي تسمح بتحديد توزيع الخلايا الشبيهة بالجذع على مستوى الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التلوين المشترك لتعبير Nanos1 مع وضع العلامات EdU يجعل من الممكن التمييز بين الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة كل من الخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا التكاثرية على مجموعة واسعة من مناطق التحقيق ، بما في ذلك تفرع المجسات ، وتوازن الأنسجة ، وتجديد الأعضاء في كلادونيما ، ويمكن تطبيق نهج مماثل على أنواع قناديل البحر الأخرى.

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. توليف التحقيق

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. ضع ثلاثة Cladonema medusae حية مستزرعة في مياه البحر الاصطناعية (ASW) في أنبوب سعة 1.5 مل باستخدام ماصة نقل سعة 3.1 مل مع قطع الطرف ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من ASW.
      ملاحظة: يتم تحضير ASW عن طريق إذابة خليط من الأملاح المعدنية في ماء الصنبور باستخدام معادل الكلور ؛ الثقل النوعي النهائي (S.G.) هو 1.018 أو الأجزاء لكل ألف (جزء في الألف) هو ~ 27.
    2. قم بتجميد الأنابيب سعة 1.5 مل في النيتروجين السائل لمنع نشاط RNase. أضف 30 ميكرولتر من محلول التحلل من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلية التي تمت فيها إضافة 2-mercaptoethanol (1 ميكرولتر / 100 ميكرولتر من محلول التحلل) وتجانس العينات في مخزن التحلل باستخدام الخالط.
      ملاحظة: لتجنب تجاوز المخزن المؤقت والعينة من الأنابيب ، يوصى بالتجانس بكمية صغيرة من محلول التحلل.
    3. أضف 570 ميكرولتر من محلول التحلل واستخرج إجمالي الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (الشكل 1).
    4. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)
    1. باستخدام مجموعة ، قم بتوليف cDNA باستخدام إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من medusae كقالب (الشكل 1 والجدول 1).
    2. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. تبرد بسرعة على الجليد.
    4. قم بإجراء تخليق cDNA مع الخليط من الخطوة 1.2.1 (الجدول 1). تخلط جيدا عن طريق السحب واحتضانها على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    5. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. تبرد بسرعة على الجليد.
    7. قم بقياس تركيز cDNA المركب باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه عند أو أقل من -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. توليف منتج PCR
    1. لإنشاء قالب PCR ، صمم التمهيدي المحدد باستخدام Primer-BLAST. مصدر التسلسل المرجعي من بيانات NCBI أو بيانات RNA-seq.
      ملاحظة: انظر جدول المواد لمعرفة البادئات المستخدمة في هذا البروتوكول.
    2. لتضخيم التسلسل المستهدف ، قم بإجراء استنساخ TA ، والذي لا يتطلب استخدام إنزيمات التقييد. للحصول على منتج PCR يضاف فيه الأدينين في نهاية 3 '، استخدم الإعدادات التالية: 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ 35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 55-60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. استخدم Taq DNA polymerase للتفاعلات (الجدول 1).
      ملاحظة: لتحديد شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اتبع البروتوكول المصاحب لبوليميراز الحمض النووي المراد استخدامه ، والذي يوفر بشكل عام درجة حرارة التلدين الموصى بها ووقت التمديد.
    3. قم بتشغيل منتج PCR من خلال هلام أغاروز 1٪ وقطع النطاق محل الاهتمام. استخرج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من المواد الهلامية المقطوعة باستخدام مجموعة استخراج الجل.
  4. الربط
    1. قم بتوصيل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بالناقل مع 3 بوصات من الثايمين المتدلي عن طريق خلط الكواشف (الجدول 1) والتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الشكل 1).
      ملاحظة: يجب أن تكون النسبة الجزيئية للمتجه: PCR 1: >3. يبلغ حجم متجه pTA2 حوالي 3 كيلو بايت. إذا كان منتج PCR (إدراج) هو A (kb) و B (ng / μL) ، فيمكن حساب حجم الإدراج (X في الجدول 1) المراد أخذه بواسطة ([50 ng من المتجه × A kb من الإدراج]) / (3 kb vector × [ 1/3]) = 50 · نانوغرام من الإدراج. إذا كان تركيز الإدخال هو B ng / μL ، فإن الحجم المأخوذ هو 50 · A / B ميكرولتر من الإدراج.
  5. التحول والطلاء
    1. للتحول ، قم بإذابة الخلايا المختصة على الجليد وتوزيعها في 20 ميكرولتر لكل منها. أضف 1 ميكرولتر من البلازميدات التي تحتوي على منتج PCR (أقل من 5٪ من حجم الخلية المختصة) ودوامة لمدة 1 ثانية. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق ، ثم احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ودوامة لمدة 1 ثانية.
    2. أضف 180 ميكرولتر من مرق Super Optimal مع وسط قمع Catabolite (SOC) (وسط زراعة بكتيري غني بالتغذية) إلى الخلايا المختصة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، انشر الخلايا المختصة على صفيحة أجار تحتوي على أمبيسيلين ، 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-بيتا-د-جالاكتو-بيرانوسيد (X-gal) ، وإيزوبروبيل-β-د-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة (الشكل 1).
      ملاحظة: يتم استخدام X-gal و IPTG لاختيار المستعمرات الزرقاء والبيضاء.
  6. الثقافة السائلة
    1. اختر مستعمرة بيضاء من المستعمرات البيضاء والزرقاء على اللوحة. أضفه إلى 3-5 مل من وسط LB مع الأمبيسلين واحتضانه على شاكر لمدة 12-16 ساعة عند 37 درجة مئوية (الشكل 1).
  7. ميني بريب
    1. استخرج البلازميد من وسط LB باستخدام miniprep البلازميد (الشكل 1).
    2. تحديد تركيز البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  8. اقرأ التسلسل.
    1. لقراءة تسلسل الحمض النووي للبلازميد ، أرسل البلازميد لتسلسل سانجر ثم استخدم البرنامج لمواءمته مع تسلسل الجينوم / النسخ لتأكيد ما إذا كان التسلسل المستهدف قد تم تصنيعه بشكل صحيح وتقييم الاتجاه الذي يتم فيه إدخال التسلسل المستهدف في البلازميد (5 'إلى 3' أو 3' إلى 5').
      ملاحظة: إذا تم إدخال تسلسل الهدف في البلازميد في الاتجاه 5 'إلى 3' من موقع ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي بالقرب من نهاية 3 '، يمكن إنشاء مسبار مضاد للحساسية عن طريق النسخ في المختبر . إذا تم إدخال تسلسل الهدف في الاتجاه العكسي من 3 إلى 5 ، فيمكن إنشاء مسبار حسي (تحكم سلبي). في حالة استخدام متجهات مثل pTA2 ، يمكن استخدام موقعين لربط النسخ حسب الغرض.
  9. النسخ في المختبر
    1. قم بإعداد قالب الحمض النووي من البلازميد الذي تم إنشاؤه عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات خارج موقع ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال ، مواقع ربط T7 / T3) في البلازميد (الشكل 1).
      ملاحظة: يمكن استخدام البادئات العالمية مثل التمهيدي الأمامي M13-20 والتمهيدي العكسي M13 لإعداد قالب الحمض النووي الذي يتضمن مواقع ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي.
    2. قم بتنقية القالب بعد تضخيم PCR باستخدام مجموعة استخراج هلام / PCR.
    3. امزج الكواشف الموضحة أدناه ، وقم بإجراء تفاعل النسخ عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات (الشكل 1 والجدول 1).
    4. أضف 1.5 ميكرولتر من DNase واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. أضف 10 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase وقم بتنقية المسبار من محلول تفاعل النسخ باستخدام عمود تنظيف.
    6. تحقق من حجم الحمض النووي الريبي المركب عن طريق تحميل 1 ميكرولتر على هلام أغاروز 1٪ وتحديد التركيز باستخدام مقياس الطيف.
      ملاحظة: يجب أن يكون تركيز مجسات الحمض النووي الريبي المركب 100 نانوغرام / ميكرولتر على الأقل.
    7. أضف 30 ميكرولتر من الفورماميد للتخزين عند أو أقل من -20 درجة مئوية.

2. دمج EdU وتثبيته

  1. ضع Cladonema medusae (5-10 لكل أنبوب) في أنابيب سعة 1.5 مل باستخدام ماصة نقل 3.5 مل وأضف ASW حتى حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر. أضف 7.5 ميكرولتر من محلول مخزون EdU 10 mM واحتضان العينات لمدة 1 ساعة عند 22 درجة مئوية (الشكل 2). التركيز النهائي EdU هو 150 ميكرومتر.
    ملاحظة: استخدم medusae البالغ من العمر 5-7 أيام لمراقبة تكوين الفرع الثالث (الشكل 3 أ). يتم احتساب اليوم الذي تنفصل فيه medusae عن الورم على أنه اليوم 1 ، وفي اليوم 5 ، تبدأ medusae عادة في إظهار فرع ثالث على مخالبها الرئيسية.
  2. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من ASW الذي يحتوي على EdU.
  3. لتخدير medusae ، أضف 7٪ MgCl 2 في H2 O واحتضانه لمدة 5 دقائق.
  4. قم بإزالة 7٪ MgCl 2 في H 2 O وقم بإصلاح medusae طوال الليل (O.N.) عند 4 درجات مئوية مع 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في ASW (الشكل 2).
    ملاحظة: عند إجراء FISH بدون دمج EdU ، يمكن إصلاح العينات بشكل مشابه لتلك المعالجة ب EdU بعد التخدير (الخطوات 2.3-2.4).

3. التهجين الفلوري في الموقع

  1. علاج بروتيناز وما بعد التثبيت
    1. قم بإزالة PFA واغسل العينات باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.1٪ Tween-20 (PBST) لمدة 3 × 10 دقائق. استخدم 300-500 ميكرولتر من PBST لكل غسلة.
      ملاحظة: من هذه الخطوة إلى نهاية التهجين ، يجب إجراء التجربة في بيئة خالية من RNase ، مع ارتداء القفازات والقناع. يجب أن يتم عمل 1x PBS في هذه الخطوة بمياه معالجة DEPC. بعد التهجين ، يمكن استخدام 1x PBS المصنوع من الماء دون معالجة DEPC. تقوم بعض بروتوكولات ISH و FISH بتجفيف العينات باستخدام خطوات الميثانول ، مما يجعل من الممكن حفظ العينات الثابتة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. لتجنب العمل الزائد ، يتم حذف عملية الجفاف من هذا البروتوكول ، خاصة أنه يمكن الاحتفاظ بالعينات في PBST لمدة تصل إلى بضعة أيام.
    2. بعد التثبيت ، ضع العينة في أنابيب سعة 1.5 مل على شاكر ، باستثناء خطوة حضانة الأجسام المضادة ل DIG-POD O.N. (الخطوة 3.4.2). بعد الغسيل، أضف 10 ملغ/مل من محلول مخزون بروتيناز K في PBST واحتضن الميدوساي مع بروتيناز K (التركيز النهائي: 10 ميكروغرام/مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. قم بإزالة محلول Proteinase K واغسل العينات لمدة 2 × 1 دقيقة باستخدام PBST.
    4. لإصلاح medusae ، أضف 4٪ PFA في 1x PBS واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بإزالة محلول PFA واغسل العينات لمدة 2 × 10 دقائق باستخدام PBST.
      ملاحظة: إذا تم التعبير عن الجين المستهدف بشكل كبير بإشارة خلفية منخفضة ، فيمكن تخطي الخطوات 3.1.2-3.1.5.
  2. التهجين
    1. قم بإزالة PBST وإضافة المخزن المؤقت للتهجين (HB Buffer ، الجدول 1). احتضان العينات في HB Buffer لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). استخدم 300-400 ميكرولتر من HB Buffer ، والذي يوفر حجما كافيا للتهجين الناجح.
      ملاحظة: يتم تحضير HB Buffer و Wash Buffer 1 و Wash Buffer 2 بمخزون SSC 20x. يتم تخزين HB Buffer عند أو أقل من -20 درجة مئوية ويجب إحضاره إلى RT قبل الاستخدام.
    2. قم بإزالة المخزن المؤقت HB وإضافة المخزن المؤقت HB جديد. التهجين المسبق عند 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل في حاضنة التهجين.
    3. قم بإزالة HB Buffer واحتضان مع HB Buffer الذي يحتوي على المجسات التي تم تخزينها في الخطوة 1.9.7 (تركيز المسبار النهائي: 0.5-1 نانوغرام / ميكرولتر في HB Buffer). تهجين عند 55 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة (الشكل 2) في حاضنة التهجين.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف شدة إشارة FISH ونوعيتها بسبب التعبير الجيني المستهدف ، بالإضافة إلى طول المسبار ونوعيته. لزيادة الكثافة ، يمكن تعديل معلمات مثل مدة التهجين (18-72 ساعة) ودرجة الحرارة (50-65 درجة مئوية) ، ويمكن اختبار مجسات مختلفة. لتجنب الإشارات غير المحددة ، يمكن تعديل علاج Proteinase K (التركيز والمدة)19.
  3. إزالة المسبار
    1. قم بإزالة HB Buffer الذي يحتوي على مجسات ، ثم أضف Wash Buffer 1 (الجدول 1). اغسل العينات باستخدام Wash Buffer 1 لمدة 2 × 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية. استخدم 300-400 ميكرولتر من محلول الغسيل.
      ملاحظة: يمكن استخدام HB Buffer الذي يحتوي على مجسات بشكل متكرر ، حتى حوالي عشر مرات. بدلا من التخلص منها ، قم بتخزين HB Buffer المستخدم الذي يحتوي على مجسات عند أو أقل من -20 درجة مئوية. سخن المخزن المؤقت 1 للغسيل ، ومحلول الغسيل 2 ، و 2x SSC ، و PBST عند 55 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    2. قم بإزالة Wash Buffer 1 ، ثم أضف Wash Buffer 2 (الجدول 1). اغسل العينات باستخدام Wash Buffer 2 لمدة 2 × 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
    3. قم بإزالة Wash Buffer 2 ، ثم أضف 2x SSC. اغسل العينات باستخدام 2x SSC لمدة 2 × 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
    4. قم بإزالة 2x SSC ، ثم أضف PBST المسخن مسبقا. اغسل العينات لمدة 1 × 15 دقيقة باستخدام PBST في RT.
  4. حضانة الأجسام المضادة المضادة ل DIG
    1. إزالة PBST، ومن ثم إضافة 1٪ حظر المخزن المؤقت. احتضان العينات لمدة 1 ساعة على الأقل في RT أثناء الاهتزاز ببطء على الروك.
      ملاحظة: قم بإعداد مخزن مؤقت مانع بنسبة 1٪ حديثا عن طريق تخفيف مخزون المخزن المؤقت بنسبة 5٪ (الجدول 1). تحقق من العينات قبل تفاعل الجسم المضاد التالي لأن العينة تميل إلى الالتصاق بالجزء الخلفي من الغطاء أو الجدار نتيجة الاهتزاز.
    2. بعد الحظر ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر بنسبة 1٪ ، وأضف محلول مضاد ل DIG-POD (1: 500 ، في مخزن حظر 1٪) ، واحتضان العينات O.N. عند 4 درجات مئوية (الشكل 2).
      ملاحظة: احرص على الحفاظ على وقت الحضانة في غضون 12-16 ساعة لمنع اكتشاف إشارات غير محددة.
  5. الكشف عن المسبار المسمى DIG
    1. قم بإزالة محلول مكافحة DIG-POD ، ثم أضف Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT ، الجدول 1). اغسل العينات باستخدام مادة تي إن تي لمدة 3 × 10 دقائق في RT.
      ملاحظة: يوفر استخدام تقنية تضخيم إشارة التيراميد (TSA) صورة ذات استبانة أفضل ضد الكواشف الموسومة ببيروكسيديز الفجل (على سبيل المثال ، anti-DIG-POD).
    2. تمييع محلول مخزون تيراميد الصبغة المترافقة بالفلورسنت (Cy5-tyramide) (1:50) في المخزن المؤقت لتخفيف التضخيم لصنع محلول Cy5-tyramide النشط (الشكل 2).
    3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من مادة تي إن تي ، ثم أضف محلول Cy5-tyramide النشط. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في الظلام.
    4. اغسل العينات باستخدام PBST لمدة 3 × 10 دقائق في الظلام.
  6. الكشف عن EdU
    ملاحظة: تكتشف مجموعة EdU المدمجة EdU كإشارات فلورية (الشكل 2).
    1. لتحضير كوكتيل الكشف عن EdU ، امزج المكونات كما هو موضح في الجدول 1. استخدم 100 ميكرولتر من كوكتيل الكشف عن EdU لكل عينة.
      ملاحظة: قم بإعداد مادة مضافة 1x Reaction Buffer عن طريق تخفيف مادة مضافة 10x Reaction Buffer بماء فائق النقاء.
    2. قم بإزالة PBST، ثم قم بإضافة كوكتيل الكشف عن EdU. احتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    3. يغسل مع PBST لمدة 3 × 10 دقائق في الظلام.
  7. تلطيخ الحمض النووي
    1. تمييع Hoechst 33342 (1: 500) في PBST لإعداد حل Hoechst. إزالة PBST، ثم قم بإضافة حل Hoechst. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في الظلام (الشكل 2).
    2. اغسل العينات باستخدام PBST لمدة 3-4 × 10 دقائق في الظلام.
  8. تصاعد
    1. اصنع بنكا على الشريحة الزجاجية لمنع سحق العينة. ضع شريط فينيل على الشريحة الزجاجية وقم بتجويف المركز.
    2. انقل medusae إلى البنك على زجاج الشريحة باستخدام ماصة نقل 3.1 مل مع قطع الطرف.
      ملاحظة: احرص على عدم ترك المجسات تتداخل.
    3. قم بإزالة أي PBST باستخدام ماصة P200 ، ثم أضف ببطء 70٪ من الجلسرين كوسيط تركيب (الشكل 2).
      ملاحظة: بدلا من 70٪ من الجلسرين ، يمكن استخدام وسيط التثبيت المضاد للبهتان لمنع التألق من التلاشي.
    4. ضعي غطاء برفق على medusae بالملقط ، وأغلقي جانب الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
    5. احتفظ بالشرائح عند 4 درجات مئوية في الظلام إذا لم يتم إجراء المراقبة المجهرية على الفور.
  9. التصوير
    1. استخدم مجهر المسح الضوئي متحد البؤر للحصول على الصور. للحصول على دقة خلية واحدة ، استخدم عدسة زيتية 40x أو عدسة لتكبير أعلى.
    2. بعد الحصول على الصورة ، افتح الصور باستخدام برنامج ImageJ / FIJI وعد الخلايا الموجبة ل EdU + و / أو Nanos1 + بواسطة الأداة متعددة النقاط20.

النتائج

تم استخدام مخالب Cladonema كنموذج لدراسة العمليات الخلوية للتشكل والتجديد15،16،17. يتكون هيكل اللامسة من أنبوب ظهاري حيث توجد خلايا تشبه الساق ، أو الخلايا i ، في المنطقة القريبة ، تسمى لمبة اللامسة ، وتضاف فروع جديدة بالتتابع إلى الجزء الخ...

Discussion

الخلايا المتكاثرة والخلايا الجذعية هي مصادر خلوية مهمة في عمليات مختلفة مثل التشكل والنمو والتجديد21,22. تصف هذه الورقة طريقة للتلوين المشترك لعلامة الخلايا الجذعية Nanos1 بواسطة FISH و EdU وضع العلامات في Cladonema medusae. اقترح العمل السابق باستخدام وضع العلا...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل AMED تحت رقم المنحة JP22gm6110025 (إلى Y.N.) ومن قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 22H02762 (إلى Y.N.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol Wako137-06862
3.1 mL transfer pipetteThermo Scientific233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Wako029-15043
anti-DIG-PODRoche11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dyeInvitrogen C10337EdU kit
Coroline offGEX Co. ltdN/Achlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking ReagentRoche11175041910blocking buffer 
DIG RNA labeling mix Roche11277073910
DTT PromegaP117B
ECOS competent cell DH5αNIPPON GENE316-06233competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kitFast geneFG-91302gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kitFast geneFG-90502plasmid miniprep
FormamideWako 068-00426
Heparin sodium salt from porcineSIGMA-ALDRICH H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)Wako096-05143
LB AgarInvitrogen22700-025agar plate
LB Broth BaseInvitrogen12780-052LB medium
Maleic acidWako134-00495
mini Quick spin RNA columnsRoche11814427001clean-up column
NaClWako 191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-FiThermo ScientificND-ONEC-Wspectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)Wako 166-21115
PowerMasher 2nippi 891300homogenizer
Proteinase KNacarai Tesque 29442-14
RNase InhibitorTaKaRa2313A
RNeasy Mini kitQiagen 74004total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free DnasePromegaM6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)TaKaRaT9172
SEA LIFEMarin TechN/Amixture of mineral salts
T3 RNA polymerase Roche11031163001
T7 RNA polymerase Roche10881767001
TAITEC HB-100TAITEC0040534-000Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq TaKaRaRR001ATaq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis KitTaKaRa6210AcDNA synthesis kit
Target CloneTOYOBO TAK101pTA2 Vector
tRNARoche10109541001
TSA Plus Cyanine 5AKOYA BiosciencesNEL745001KTtyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880ZEISSN/Alaser scanning confocal microscope

References

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186 FISH EdU

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved