JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الخطوة الضرورية في تطوير أبتامير مضاد للسرطان هي اختبار ارتباطه بالهدف. نعرض مقايسة قائمة على التدفق الخلوي لدراسة هذا الارتباط ، مع التأكيد على أهمية تضمين أبتامير التحكم السلبي والخلايا السرطانية الإيجابية أو السلبية لهذا البروتين المعين.

Abstract

يتمثل التحدي الرئيسي في تطوير أبتامير مضاد للسرطان في تحديد انتقائية وخصوصية الأبتامير المطور للبروتين المستهدف بكفاءة. نظرا لمزاياه العديدة على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، اكتسب تطوير aptamer شعبية هائلة بين الباحثين في مجال السرطان. التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX) هو الطريقة الأكثر شيوعا لتطوير أبتامير خاصة بالبروتينات ذات الأهمية. بعد SELEX ، يؤدي فحص الربط السريع والفعال إلى تسريع عملية تحديد الهوية ، مما يؤكد انتقائية وخصوصية aptamer.

تشرح هذه الورقة مقايسة الربط القائمة على القياس الخلوي للتدفق خطوة بخطوة ل aptamer الخاص بجزيء الالتصاق الخلوي الظهاري (EpCAM). يتم التعبير عن البروتين السكري عبر الغشاء EpCAM بشكل مفرط في معظم السرطانات ويلعب أدوارا في بدء السرطان وتقدمه وورم خبيث. لذلك ، فهو مرشح قيم لتوصيل الدواء المستهدف إلى الأورام. لتقييم انتقائية وخصوصية الأبتامير إلى EpCAM المرتبط بالغشاء ، يلزم وجود خلايا إيجابية وسالبة EpCAM. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم وجود أبتامير EpCAM غير ملزم بطول مماثل وبنية ثنائية الأبعاد (2D) ل aptamer المرتبط ب EpCAM. يتضمن فحص الربط مخازن مؤقتة مختلفة (المخزن المؤقت للحظر ، ومخزن الغسيل ، ومخزن الحضانة ، ومخزن FACS) وخطوات الحضانة.

يتم تحضين الأبتامير مع خطوط الخلية. بعد خطوات الحضانة والغسيل ، سيتم تقييم الخلايا باستخدام اختبار قياس التدفق الخلوي الحساس. يظهر تحليل النتائج ارتباط الأبتامير الخاص ب EpCAM بالخلايا الإيجابية ل EpCAM وليس الخلايا السلبية ل EpCAM. في الخلايا الإيجابية ل EpCAM ، يتم تصوير هذا على أنه تحول في النطاق في ربط EpCAM aptamer إلى اليمين مقارنة بعنصر تحكم aptamer غير الملزم. في الخلايا السالبة ل EpCAM ، تتداخل النطاقات المقابلة من aptamers المرتبطة ب EpCAM وغير الملزمة. يوضح هذا انتقائية وخصوصية أبتامر EpCAM. بينما يركز هذا البروتوكول على أبتامير EpCAM ، فإن البروتوكول ينطبق على الأبتامير المنشورة الأخرى.

Introduction

لا يزال السرطان أحد الأسباب الرئيسية للوفيات في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من التحسن الكبير في علاج السرطان في العقود الأخيرة ، لا يزال تطوير الأدوية المضادة للسرطان موضوعا مثيرا للجدل. وذلك لأن العلاج الكيميائي ، باعتباره الدعامة الأساسية لعلاج السرطان ، يصاحبه آثار جانبية خطيرة تحد من امتثال المريض للعلاج. علاوة على ذلك ، فإن مقاومة السرطان التي يسببها العلاج الكيميائي قد قيدت تطبيقه كخيار وحيد للتدخل الطبي. قدم تطبيق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) استجابة معززة لعلاجات السرطان2. كان الأساس المنطقي لاستخدام mAbs هو تحسين فعالية العلاج الكيميائي وتقليل ردود الفعل السلبية. ومع ذلك ، أصبحت إدارة mAbs أيضا تحديا. لم يكن هذا فقط بسبب التفاعلات المناعية التي يسببها mAb ولكن أيضا بسبب تكاليف الإنتاج المكلفة التي تعتمد على الحيوانات وظروف التخزين الصعبة3. أثار إدخال aptamers في 1990s4 آمالا جديدة في علاج السرطان ، حيث أن تطبيق aptamers يمكن أن يعالج التحديات المرتبطة ب mAbs.

Aptamers هي تسلسلات قصيرة من الحمض النووي يتم إنتاجها خصيصا لهدف معين. التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX) هو طريقة شائعة في إنتاج الأبتامير. في SELEX ، يتم تحضين البروتين محل الاهتمام بمكتبة من تسلسلات النوكليوتيدات العشوائية ، ومن خلال سلسلة من الدورات التكرارية ، يتم تنقية الأبتامير المحدد لهذا البروتين. لدى Aptamers انتقائية وخصوصية مستهدفة مماثلة ل mAbs ، وبالتالي فإن تطوير الأدوية في هذا المجال يظهر تطبيقات مستقبلية واعدة. يمكن تطبيق Aptamers الخاصة بالمؤشرات الحيوية للسرطان كأدوية مفردة وأدوات تشخيص السرطان5،6،7. نظرا لهيكلها بحجم النانو ، يمكن أن تعمل هذه الأبتامير أيضا كحاملات أدوية لتوصيل العوامل السامة للخلايا على وجه التحديد إلى الورم8. هذا من شأنه أن يزيد من فعالية توصيل الدواء المستهدف ويقلل من ردود الفعل السلبية المرتبطة بالعلاج الكيميائي وغير المستهدفة. علاوة على ذلك ، تتمتع هذه الأدوية النانوية باختراق كبير للأنسجة ، مما يجعلها مرشحا مرغوبا لتوصيل أدوية الأورام العميقة وعلاجها. يمكن أيضا تصميم Aptamers لاستهداف الناقلات المعبر عنها على الحاجز الدموي الدماغي (BBB) لتحسين توصيل الدواء إلى أورام المخ9. وخير مثال على مثل هذا الأبتامير هو الأبتامير ثنائي الوظيفة ، الذي يستهدف مستقبلات الترانسفيرين (TfR) 10 لتعزيز توصيل الدواء عبر BBB ، وتوصيل حمولة دواء سامة للخلايا إلى الخلايا السرطانية11.

على الرغم من كل مزايا aptamers ، فإن تطوير الأدوية في هذا المجال لم يسفر بعد عن دواء مضاد للسرطان ناجح وناجح. قد يكون أحد أسباب ذلك هو عدم وجود طرق قياسية وقابلة للتكرار يمكن اتباعها عالميا من قبل الباحثين في هذا المجال. في هذه الورقة ، يتم توضيح بروتوكول خطوة بخطوة لارتباط الأبتامير ببروتين أصلي معبر عنه على سطح الخلية. هذا البروتوكول هو خطوة أساسية في التقييم قبل السريري للأبتامير المضادة للسرطان. يتم إجراء الفحص لإظهار انتقائية وخصوصية الأبتامير المنقى الذي تم جمعه من SELEX أو تسلسل أبتامير منشور لتأكيد الانتقائية والنوعية. هذا الفحص القائم على التدفق الخلوي هو اختبار سريع وموثوق وحساس يظهر بدقة انتقائية وخصوصية الأبتامير ، حيث يتم اختبار الأبتامير ضد البروتينات الموجودة على سطح الخلية12،13،14. يتم توضيح هذه الطريقة باستخدام ربط أبتامير خاص ب EpCAM الموضح في هذه الورقة15. يلعب EpCAM ، باعتباره بروتين سكري عبر الغشاء ، أدوارا في إشارات الخلايا السرطانية ، والتقدم ، والهجرة ، وورم خبيث16,17. لإظهار انتقائية وخصوصية هذا الأبتامر ، تم استخدام الخلايا السرطانية الإيجابية والسالبة EpCAM. تم استخدام aptamer الخاص ب EpCAM الذي تم تطويره مسبقا ، TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) ، و aptamer للتحكم السلبي ، TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3) ، كأبتامير ملزمة وغير ملزمة ل EpCAM ، على التوالي10. تم تمييز الطرف 3 'لكل من TEPP و TENN بفلوروفور TYE665.

TEPP هو أبتامير ثنائي الوظيفة يستهدف EpCAM من طرف و TfR من جهة أخرى. وقد جعل هذا TEPP مرشحا مناسبا لتوصيل الدواء إلى أورام الدماغ EpCAM + . باستخدام نهايته الخاصة ب TfR ، يجتاز TEPP الحاجز الدموي الدماغي ، وباستخدام الطرف الخاص ب EpCAM ، يجد الورم ويسلم حمولته (على سبيل المثال ، الأدوية السامة للخلايا) إلى الورم. TENN له طول مماثل وهيكل 2D مثل TEPP ، ولكن ليس لديه تقارب ل EpCAM أو TfR ، وبالتالي فهو aptamer التحكم السلبي المناسب. باستخدام TEPP و TENN ، يظهر اختبار ارتباط الأبتامير بالبروتين المستهدف باستخدام قياس التدفق الخلوي في هذه الورقة. ينطبق هذا البروتوكول على تطوير aptamers الخاصة بالخلية. كما أنه ينطبق على المزيد من التحليلات التكميلية والتأكيدية لتسلسل الأبتامير المتاح في الأدبيات. يمكن أيضا استخدام البروتوكول من قبل أولئك الجدد في مجال أبتامير الذين يبحثون في استخدام أبتامير منشور مسبقا لأغراض البحث والتطوير (R&D). في هذه الورقة ، تمت دراسة تسلسلين أبتامير متاحين في الأدبيات.

Protocol

ملاحظة: قبل بدء التجربة ، ارتد معدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول المواد والكواشف والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. المخازن المؤقتة المطلوبة للفحص

  1. قم بإعداد المخازن المؤقتة المطلوبة لهذه التجربة - المخزن المؤقت SELEX المطلوب لطي الأبتامير ، ومخزن الحجب المؤقت (BB) ، ومخزن الغسيل المؤقت (WB) ، ومخزن التجليد (BiB) (الجدول 1) - طازجا في يوم التجربة واحتفظ بها على الجليد أو عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتطلب كل أبتامير حالة قابلة للطي فريدة من نوعها. يتضمن ذلك المخزن المؤقت SELEX وظروف درجة الحرارة القابلة للطي. يجب توخي الحذر لتكرار الطرق بالكامل من الورقة الأصلية التي تصف aptamer10. في هذه التجربة ، يتم تحضير جميع المخازن المؤقتة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات في Dulbecco (DPBS). يعتمد حجم المخزن المؤقت المطلوب في كل تجربة على عدد خطوط الخلايا وعدد النسخ المتماثلة وعدد تركيزات الأبتامير التي يتم اختبارها.
المكوناتالحجم المطلوب
بندتركيز
SELEX العازلةمغكل25 مللي متر50 ميكرولتر لكل عينة + 10٪ خطأ في السحب
حظر المخزن المؤقتمغكل25 مللي متر500 ميكرولتر لكل خط خلية
بسا أ1 ملغم / مل
الحمض النووي الريبي ب0.1 مجم / مل
FBS ج10٪ (V / V)
غسل العازلةمغكل25 مللي متر1 مل للغسيل الأول + 100 ميكرولتر لكل عينة اختبار + 10٪ خطأ في السحب
ملزمة عازلةمغكل25 مللي متر50 ميكرولتر لكل عينة + 10٪ خطأ في السحب
جيش صرب البوسنه2 ملغم / مل
الحمض النووي الريبي0.2 ملغ / مل
FBS20٪ (V / V)

الجدول 1: المخازن المؤقتة المطلوبة لفحص الربط. أ ألبومين مصل البقر ، بنقل الحمض النووي الريبي ، جمصل الجنين البقري.

2. إعداد أبتامير

ملاحظة: يتم تمييز الأبتامير المستخدمة في الفحص بجزيء مراسل مضان ، وبالتالي يجب توخي الحذر لحمايتها من الضوء.

  1. قبل التجربة ، قم بإعداد مخزون 100 ميكرومتر (المخزون A) من أبتامير الاختبار والتحكم باستخدام مياه فائقة النقاء خالية من البيروجين و RNase (الشكل 1).
    ملاحظة: للحفظ على المدى الطويل ، يجب حفظ المخزون A في الفريزر عند -20 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد المخزون B كتركيز عمل للأبتامير عن طريق تخفيف المخزون A باستخدام المخزن المؤقت SELEX (الجدول 1). لاتباع هذا البروتوكول ، قم بتخفيف المخزون A إلى مخزون 1,000 نانومتر لتحضير المخزون B (الشكل 1).
  3. لجعل aptamer جاهزا لتشكيل الهيكل ثلاثي الأبعاد (3D) ، في أنبوب 250 ميكرولتر ، قم بتخفيف المخزون B باستخدام المخزن المؤقت SELEX لإعداد الحجم والتركيز المطلوبين للأبتامير للطي.
    ملاحظة: سوف تتعرض الأبتامير المطوية لحجم متساو من الخلايا. لذلك ، يجب أن يكون تركيز الأبتامير الذي تم ضبطه للطي أكثر تركيزا بمقدار 2 مرة من التركيز النهائي المطلوب. استخدم المعادلة (1) لحساب الأحجام والتركيزات المطلوبة. تذكر أن تفكر في حجم إضافي بنسبة 10٪ لخطأ السحب.
    مخزون التركيز أ × مخزون الحجمأ = مخزون التركيز ب × مخزون الحجمب (1)

figure-protocol-4077
الشكل 1: شكل يوضح خطوات تحضير الأبتامير. 1 مخزون 1يتم تخزينه في -20 درجة مئوية للحفظ على المدى الطويل. 2 يتم تحضير تركيزات العمل في المخزن المؤقت SELEX ولا يتم تخزينها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. صيانة الخلايا السرطانية

ملاحظة: قبل بدء الدراسة ، تأكد من أن الخلايا في أرقام مرورها المبكرة ، وتظهر سماتها المورفولوجية النموذجية ، وأنها خالية من الميكوبلازما. لاختبار انتقائية وخصوصية الأبتامير ، فإن خطوط الخلايا التي تكون عالية ومتوسطة ومنخفضة / سلبية للبروتين محل الاهتمام مطلوبة بشكل مثالي.

  1. بذر الخلايا في دورق ثقافة T75 ، باستخدام ظروف المزرعة المناسبة. قم بزراعتها في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 ، عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (وسط كامل).
  2. عندما تصل الخلايا إلى ~ 80٪ التقاء ، قم بتمريرها إلى قارورة جديدة تحتوي على وسط كامل جديد.
    ملاحظة: اعتمادا على البروتين محل الاهتمام وخط الخلية ، يمكن أن يوفر التقاء 80٪ عددا مناسبا من الخلايا لفحص الربط. بالنسبة لخطوط الخلايا في هذه التجربة ، MDA-MB-231 و HEK 293T ، فإن التقاء 80٪ مناسب. في هذه المرحلة ، انتقل إلى القسم 4 ، الفحص الملزم. تحقق دائما من التعبير عن البروتين محل الاهتمام ، باستخدام mAbs المحدد لهذا البروتين.

4. مقايسة ملزمة

ملاحظة: يلخص الشكل 2 الخطوات المطلوبة في اختبار الربط في الخلايا الملتصقة.

  1. في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ، اجمع خلايا كل قارورة في أنابيب على النحو التالي:
    1. اجمع الوسائط وتجاهلها في القارورة ، وأضف 2 مل من PBS ، وانشرها على الخلايا ، ثم اجمع برنامج PBS وتخلص منه. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين لإزالة جميع آثار الوسائط التي قد تعطل التربسين. أضف 1 مل من 0.25٪ من التربسين / EDTA إلى كل دورق واحتضانه لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجةمئوية. تصور انفصال الخلايا تحت المجهر.
    2. أضف 1 مل من الوسط الكامل إلى الخلايا ، وقم بماصة الخلايا لأعلى ولأسفل لعمل تعليق أحادي الخلية. ماصة الخلايا في أنبوب مناسب وأجهزة طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: بالنسبة للخلايا غير الملتصقة، اجمع الخلايا في أنبوب، جهاز طرد مركزي (200 × جم، 5 دقائق)، وانتقل إلى الخطوة 4.1.3.
    3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الطازج. عد الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق ، عن طريق تخفيف حجم معين من تعليق الخلية باستخدام التريبان الأزرق. توزيع ~ 15 ميكرولتر من الخليط بين مقياس الدم وغطاء الزجاج. عد الخلايا كما هو موضح سابقا18 ، باستخدام المعادلة (2):
      figure-protocol-6916 (2)
      ملاحظة: استخدم الحد الأدنى الممكن لحجم معلق الخلية وقم بتدوين عامل التخفيف. على سبيل المثال ، خلط أحجام متساوية من تعليق الخلية و 0.04٪ تريبان الأزرق يعطي عامل تخفيف 2. ضمان قابلية عالية (الخلايا الحية / مجموع الخلايا × 100) من ~ 90٪ لمعظم خطوط الخلايا الملتصقة قبل المتابعة. الخلايا الميتة على وجه التحديد تأخذ aptamers وتغيير النتائج19. من الممكن استخدام تقنيات عد الخلايا الأخرى ، مثل استخدام عداد الخلايا.
    4. اجمع العدد المطلوب من الخلايا ، وتأكد من وجود 10 × 104 خلايا لكل عينة اختبار. ضع في اعتبارك حجما إضافيا بنسبة 10٪ لخطأ في سحب العينات.
      ملاحظة: من المهم دائما الاحتفاظ بنفس عدد الخلايا بين التجارب والنسخ المتماثلة.
    5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح بتثبيت البروتين محل الاهتمام على غشاء الخلية بعد الانفصال الأنزيمي.
      ملاحظة: قد تختلف فترة الحضانة هذه وفقا للبروتين محل الاهتمام.
  2. خلال هذه الحضانة 2 ساعة:
    1. اضبط درجة حرارة جهاز الطرد المركزي على 4 درجات مئوية. اترك الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA) ومخزون الأبتامير في درجة حرارة الغرفة أو على الجليد ليذوب. لحماية جزيء مراسل التألق ، قم بحماية أنابيب الأبتامير من الضوء.
      ملاحظة: يتمثل دور الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA) في سد مواقع ارتباط الحمض النووي.
    2. قم بإعداد المخزن المؤقت SELEX و BB و WB و BiB (انظر القسم 1) ، مع الاحتفاظ بها جميعا على الجليد أو عند 4 درجات مئوية. اضبط آلة التدوير الحراري على دورة فارغة. ضع صفيحة سوداء من 96 بئرا وأنابيب قياس التدفق الخلوي على الجليد.
      ملاحظة: يؤدي ضبط العجلة الحرارية على دورة فارغة إلى إعداد نظام التبريد والتدفئة ويساعد على توليد المزيد من النتائج القابلة للتكرار.
  3. بعد حضانة 2 ساعة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من BB. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة مع الخلط المتقطع.
  4. خلال هذه الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قم بإجراء طي أبتامير على النحو التالي:
    1. قم بتكوين تركيزات 2x من الأبتامير (انظر القسم 2) ، ثم قم بخلط واحتضان الأبتامير في آلة التدوير الحراري ، وفقا لظروف الطي المطلوبة. بالنسبة ل EpCAM aptamer ، استخدم ظروف الطي التالية البالغة 95 درجة مئوية و 5 دقائق و 22 درجة مئوية و 10 دقائق و 37 درجة مئوية و 15 دقيقة.
      ملاحظة: قم دائما بتضمين عنصر تحكم سلبي (أي مخزن SELEX المؤقت بدون أبتامرز).
  5. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للخلايا (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية) ، وإزالة المادة الطافية ، وإضافة 1 مل من WB ، وأجهزة الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى (500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية). قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من BiB.
  6. ماصة 50 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها في كل بئر من صفيحة سوداء باردة من 96 بئرا. الحفاظ على الخلايا على الجليد لمنع استيعاب البروتين محل الاهتمام.
  7. ماصة 50 ميكرولتر من الأبتامير على حجم 50 ميكرولتر من الخلايا ، تخلط ، وتحتضن في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي للوحة عند 500 × جم ، 5 دقائق ، 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية.
  8. أعد تعليق الحبيبات بعناية في WB وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. كرر خطوة الغسيل (4.7) 2x وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من WB لتحليل قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: انظر الشكل 3 للحصول على رسم تخطيطي للتفاعلات بين الأبتامير والخلايا.

figure-protocol-10390
الشكل 2: شكل يوضح خطوات إجراء اختبار ربط بروتين أبتامر. الاختصارات: SELEX = التطور المنهجي للروابط عن طريق الإثراء الأسي ؛ BB = حظر المخزن المؤقت ؛ WB = غسل المخزن المؤقت ؛ BiB = المخزن المؤقت الملزم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-10934
الشكل 3: شكل يوضح الأنواع المختلفة من الخلايا والأبتامير اللازمة لإجراء فحص ربط الأبتامير. اختصار: EpCAM = جزيء الالتصاق الخلوي الظهاري. تم إنشاء هذا الرقم باستخدام Biorender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. قياس التدفق الخلوي وتحليل البيانات

ملاحظة: قبل تشغيل مقياس التدفق الخلوي ، تأكد من عدم وجود "فقاعات" في وحدات مرشح الغشاء لمحلول الإغلاق ومحلول التنظيف وسائل الغمد (0.9٪ كلوريد الصوديوم). "تنزف" فقاعات إذا كان هناك فقاعات في الكبسولات. تأكد من أن حاوية النفايات فارغة ، وأن حاويات سائل الغمد والماء ومبيض 1٪ في ماء عالي النقاء ممتلئة.

  1. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي ثم الكمبيوتر.
    ملاحظة: تفاصيل تشغيل مقياس التدفق الخلوي الموضحة هنا خاصة بالجهاز والبرامج الموضحة في الفيديو (انظر جدول المواد). وتتطلب البرمجيات الأخرى تدريبا مناسبا لاستخدامها.
  2. افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي ، وقم بتسجيل الدخول إلى البرنامج ، وضمن علامة التبويب Cytometer ، قم بتشغيل Fluidics Start.
  3. لإنشاء تجربة جديدة، ضمن علامة التبويب تجربة ، انقر على مجلد جديد وقم بتسمية المجلد/التجربة بشكل مناسب.
  4. انقر على مجلد جديد لتمييزه، ثم ضمن علامة التبويب التجربة مرة أخرى، انقر على تجربة جديدة وقم بتسمية التجربة بشكل مناسب.
  5. لإضافة العينة/العينة الأولى، ضمن علامة التبويب تجربة ، انقر فوق عينة جديدة وقم بتسمية هذه العينة بشكل مناسب (اسم خط الخلية/عينة التحكم/عينة التجربة).
  6. لإضافة عينة أنبوب، قم بتمييز العينة (المجموعة) وضمن علامة التبويب التجربة ، انقر فوق أنبوب جديد. أضف العدد المناسب من الأنابيب والاسم.
  7. لإعداد الرسوم البيانية المطلوبة، ضمن علامة التبويب ورقة العمل ، افتح ورقة عمل جديدة. بمجرد ظهور نافذة ورقة العمل الجديدة ، افتح ما يلي باستخدام شاشة ورقة العمل (مرر الماوس عبر الشعار / الصور للعثور على الأسماء):
    1. قم بإعداد رسم بياني للبقع النقطية للتشتت الأمامي (FSC) مقابل التشتت الجانبي (SCC) لتحديد السكان محل الاهتمام. حدد البوابة الأولى عن طريق تحديد واختيار السكان محل الاهتمام (P1) في مخطط كثافة التشتت الأمامي والجانبي. استبعاد الحطام ، الذي يشكل السكان مع أدنى إشارة تشتت إلى الأمام.
      ملاحظة: المعلمة FSC بالكشف عن الخلايا أو الأحداث استنادا إلى حجمها وSCC بتمييزها استنادا إلى التفاصيل20.
    2. قم بإعداد رسم بياني لطخة نقطية لمنطقة FSC (FSC-A) مقابل ارتفاع FSC (FSC-H) لتحديد مجتمع الخلية الواحدة. حدد البوابة الثانية عن طريق استبعاد مجموعات الخلايا المزدوجة ، حيث تؤثر الخلايا المزدوجة بشكل كبير على النتائج والاستنتاجات. استبعاد الثنائيات باستخدام مخططات الكثافة FSC-H مقابل FSC-A، حيث تظهر الخلايا من نفس الحجم مساحة وارتفاعا مماثلين. ومن ثم ، يتم تجميع المفردات قطريا وفصلها عن الزوجي.
      ملاحظة: FSC يتناسب تقريبا مع حجم الخلية. يتم تعريف نبضات الجهد على أنها FSC-H ، وشدة الإشارة ، وعرض FSC الذي يعكس حجم الخلية ومدة الإشارة ، و FSC-A ، وهو H × W. Doublets لها عرض مزدوج وقيمة مساحة ؛ لذلك ، يعتمد بوابة المفردات على اكتشاف عدم التناسب بين H و W و A الناجم عن الثنائيات.
    3. قم بإعداد رسم بياني لعدد الأحداث ضد الفلوروفور ذي الاهتمام.
  8. قبل البدء في قياس التدفق الخلوي ، تأكد من أن لوحة معلومات الاستحواذ للتحكم في الحصول على العينة والمفتش ومقياس الخلايا لضبط معلمات الجهد ، بالإضافة إلى ورقة العمل مع جميع الرسوم البيانية مفتوحة.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 100 ميكرولتر من معلق خلية 10 × 104 في أنبوب قياس التدفق الخلوي لإجراء التحليل. خاصة في حالة انخفاض الجدوى ، يمكن إجراء تلطيخ يوديد البروبيديوم لتحديد عدد الخلايا القابلة للحياة21,22.
  9. لتشغيل العينة الأولى ، على الجانب الأيسر من الشاشة ، تأكد من أن السهم الذي يشير إلى الأنبوب أخضر. إذا لم يكن هذا السهم أخضر ، فانقر فوق السهم لجعله أخضر.
  10. باستخدام ماصة ، انقل كل عينة من اللوحة السوداء المكونة من 96 بئرا إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. قم بتشغيل عينة التحكم غير المعالجة وغير الملوثة على سرعة منخفضة.
  11. في لوحة معلومات الاستحواذ، اختر عددا مناسبا من الأحداث لتسجيلها (30000)، وقم بتغيير معدل التدفق إلى منخفض، وانقر فوق الحصول على البيانات.
  12. اضبط الجهد لمعلمات FSC و SCC. تأكد من أن عدد الخلايا مركزي داخل المخطط النقطي وأنه لا توجد خلايا تلمس أي من محوري الرسم البياني لتجنب فقدان الخلايا محل الاهتمام.
  13. زيادة سرعة الاكتساب إلى متوسطة أو عالية لتحليل العينات بشكل أسرع ولكن لا تتجاوز أكثر من 200 حدث / ثانية. ثم انقر فوق تسجيل البيانات.
  14. قم بإجراء بوابة P1 (الشكل 4 أ) وعدد الخلايا المفردة (الشكل 4 ب). قم ببناء الرسم البياني للأحداث مقابل الفلوروكروم المستخدم وحدد P1 بناء على البيانات (allophycocyanin (APC) في هذه الحالة) (الشكل 4C).
  15. بعد ضبط الجهد ، بوابة وتسجيل البيانات ، أخرج العينة وانقر فوق الأنبوب التالي.
  16. أدخل العينة التالية ، وكرر بيانات التسجيل لجميع عينات التحكم والاختبار (الشكل 3).
  17. بمجرد جمع جميع البيانات ، اغسل مقياس التدفق الخلوي عن طريق تشغيل ثلاثة أنابيب من المبيض بنسبة 50٪ ، وشطف FACS ، والماء عالي النقاء ، كل منها لمدة 5 دقائق بمعدل تدفق مرتفع.
  18. ثم ، من القائمة المنسدلة Cytometer ، انقر فوق إيقاف تشغيل Fluidics.
  19. قبل إغلاق البرنامج وإيقاف تشغيل الجهاز وجهاز الكمبيوتر، قم بتصدير النتائج كملفات .fcs إلى محرك أقراص USB لنقلها وتحليلها، على النحو التالي:
    1. في برنامج التحليل ، اضغط على الزر NEW لإنشاء مستند جديد ونافذة للتعامل مع التحليل. اسحب نماذج الملفات إلى النافذة الجديدة.
    2. انقر نقرا مزدوجا لفتح العينة غير المصبوغة. اختر مجتمع P1 ، وانقر نقرا مزدوجا فوق مجتمع P1 لإنشاء رسم بياني FSC-H مقابل FSC-A ، وقم ببوابة مجتمع الخلية الواحدة.
    3. انقر نقرا مزدوجا فوق الخلايا المفردة المسورة لإنشاء مدرج تكراري للأحداث مقابل الفلوروكروم المستخدم.
    4. في النافذة الأصلية، حدد P1 والخلايا المفردة واسحبها إلى كافة العينات بحيث تحتوي جميع العينات الآن على نفس البوابة.
    5. انقر فوق الزر محرر التخطيط لفتح نافذة التخطيطات . اسحب عينتين (تحكم واختبار) فوق بعضهما البعض لإنشاء مدرج تكراري تراكب.

النتائج

يتمثل أحد الجوانب المهمة لاكتشاف الأدوية الجديدة وتطويرها في ضمان انتقائية وخصوصية الدواء المرشح. هذا يعني أن الدواء المرشح يجب أن يكون قادرا على التمييز بين الخلايا المختلفة ويؤثر فقط على عدد الخلايا محل الاهتمام (الانتقائية). تتم دراسة الانتقائية باستخدام خطوط الخلايا التي تختلف من حي?...

Discussion

يتمثل التحدي الرئيسي في تطوير أبتامرز جديدة في عدم وجود مبادئ توجيهية قياسية تنطبق على خطوات مختلفة من هذه العملية. أظهر McKeague et al. مؤخرا بعض التحديات المرتبطة بها ، والتي تؤدي إلى عروض غير واضحة للبيانات في المنشورات والفشل في تكرار البحث. واقترحوا مبادئ توجيهية أساسية ضرورية للنظر فيها ف?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بتمويل SEED من معهد الصحة العقلية والبدنية والترجمة السريرية (IMPACT) ، وبرنامج "زمالة ألفريد ديكين لأبحاث ما بعد الدكتوراه" في جامعة ديكين ، و "منحة برنامج التدريب البحثي للحكومة الأسترالية".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lidSigma-AldrichT6649
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tubeGreiner Bio One188271
5 mL serological pipettesGreiner Bio One606180
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson CytometerBecton DickinsonN/A
BD FACSDiva V9.0BD BiosciencesN/A
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powderSigma-AldrichTMA7906-50G
Bright-line HemocytometerSigma-AldrichZ359629
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media PowderLife Technologies12100046
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)Life Technologies21300025
FlowJo, LLC 10.8.1BD BiosciencesN/A
Foetal Bovine Serum (FBS)BovogenSFBS-F
HEK293TAmerican Type Culture CollectionACS-4500
Heracell 150i CO2 IncubatorThermo Fisher ScientificN/A
Heraeus Megafuge 16R CentrifugeThermo Fisher ScientificN/A
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
MDA-MB-231American Type Culture CollectionCRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), BlackGreiner Bio One655076
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tabletsLife Technologies18912014
Pyrogen- and RNase-free ultrapure waterMilli-Q
T75 Cell Culture flaskCellstar658170
TENNIntegrated DNA TechnologiesN/A5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPPIntegrated DNA TechnologiesN/A5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)Sigma-AldrichR8508-5X1ML
Trypan Blue SolutionLife Technologies15250061
Trypsin-EDTAGibco15400054

References

  1. Cancer. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022)
  2. Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
  3. Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
  4. Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
  5. Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
  6. Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
  7. Huang, J., et al. Advances in aptamer-based biomarker discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).
  8. Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
  9. Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
  10. Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
  11. Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
  12. Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
  13. Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
  14. Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
  15. Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
  16. Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
  17. Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
  18. McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. . Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  19. McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
  20. Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
  21. McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
  22. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  23. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
  24. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  25. Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
  26. Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
  27. McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
  28. Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
  29. Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
  30. Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
  31. Yu, X. -. X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved