JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نبلغ عن بروتوكول للقياس الكمي والتمايز بين الخلايا اللمفاوية B لعضلة القلب بناء على موقعها في الفضاء داخل الأوعية الدموية أو البطانية باستخدام قياس التدفق الخلوي.

Abstract

تظهر مجموعة متزايدة من الأدلة أن الخلايا اللمفاوية البائية تلعب دورا مهما في سياق فسيولوجيا عضلة القلب وتكييف عضلة القلب مع الإصابة. ومع ذلك ، فإن الأدبيات تشير إلى بيانات متناقضة حول انتشار الخلايا البائية لعضلة القلب. تم الإبلاغ عن أن الخلايا البائية هي من بين الخلايا المناعية الأكثر انتشارا في قلب القوارض أو أنها موجودة ، ولكن بمعدل انتشار أقل بشكل ملحوظ من الخلايا النخاعية ، أو نادرة جدا. وبالمثل ، وصفت عدة مجموعات أن عدد الخلايا البائية لعضلة القلب يزداد بعد إصابة عضلة القلب الإقفارية الحادة ، لكن مجموعة واحدة لم تبلغ عن أي تغييرات في عدد الخلايا البائية لعضلة القلب المصابة. يعد تنفيذ طريقة مشتركة وقابلة للتكرار لتقييم انتشار الخلايا البائية لعضلة القلب أمرا بالغ الأهمية لتنسيق الملاحظات من مجموعات البحث المختلفة وبالتالي تعزيز تقدم دراسة تفاعلات عضلة القلب للخلايا البائية. بناء على تجربتنا ، من المحتمل أن تنبع الملاحظات المتناقضة على ما يبدو الواردة في الأدبيات من حقيقة أن الخلايا البائية لعضلة القلب في الفئران تكون في الغالب داخل الأوعية الدموية ومتصلة ببطانة الأوعية الدموية الدقيقة. لذلك ، فإن عدد الخلايا البائية المستعادة من قلب الفئران حساس بشكل رائع لظروف التروية المستخدمة لتنظيف العضو وطريقة الهضم المستخدمة. نبلغ هنا عن بروتوكول محسن يمثل هذين المتغيرين المهمين بطريقة محددة. يمكن هذا البروتوكول من إجراء تحليل قابل للتكرار وقائم على قياس التدفق الخلوي لعدد الخلايا البائية لعضلة القلب في الفئران ويسمح للباحثين بالتمييز بين الخلايا البائية خارج الأوعية الدموية مقابل الخلايا البائية لعضلة القلب داخل الأوعية الدموية.

Introduction

الخلايا الليمفاوية البائية خلايا مناعية عالية التخصص تلعب دورا مهما في كل من الاستجابات المناعية التكيفية والفطرية1. هناك مجموعتان رئيسيتان من الخلايا البائية: مجموعة أصغر من خلايا B1 التي يتم إنتاجها في الغالب خلال الحياة الجنينية ، ومجموعة كبيرة من خلايا B2 التي يتم إنتاجها في حياة البالغين في نخاع العظم1. بعد النضج في نخاع العظم ، تهاجر الخلايا البائية إلى الأعضاء اللمفاوية الأولية والثانوية. من هناك يتم إعادة تدويرها باستمرار بين الأعضاء اللمفاوية التي تنتقل عبر الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية2. تعبر الخلايا البائية عن أجسام مضادة محددة على سطحها ، والتي تعمل كمستقبلات. عندما تواجه الخلايا البائية مولد ضد يرتبط بمستقبلاتها ، يمكن تشغيل إشارة تنشيط. تهاجر الخلايا البائية المنشطة إلى الأنسجة حيث تم العثور على المستضد أو تعود إلى نخاع العظم حيث يمكن أن تنضج إلى خلايا بلازما منتجة للأجسام المضادة 3,4.

في الآونة الأخيرة ، كان من المقدر أن القلب يؤوي عددا كبيرا من الخلايا البائية. أظهرت الدراسات التي أجريت على القوارض أن الخلايا البائية تستعمر القلب مبكرا أثناء التطور الجنيني5 ، وأن الخلايا البائية المرتبطة بعضلة القلب هي في الغالب خلايا B2 داخل الأوعية الدموية والساذجة الملتصقة بالبطانة 6,7 ، مع نسبة صغيرة من خلايا B1 7. لا يزال هناك العديد من مجالات عدم اليقين ، لكن البيانات المتاحة تشير إلى أن الخلايا البائية تلعب دورا مهما في كل من القلب الساذج وفي سياق تكيف عضلة القلب مع الإصابة.

أظهرت الدراسات التي أجريت على قلب الفئران الساذج أنه عند خط الأساس ، توجد الخلايا البائية لعضلة القلب في الغالب في الفضاء داخل الأوعية الدموية ، ملتصقة بالبطانة (تم العثور على >95٪ من الخلايا البائية القلبية للفئران موجودة في الفضاء داخل الأوعية). وجد أن هذه الخلايا البائية لها أنماط تعبير جيني مختلفة عن تلك الموجودة في الخلايا البائية المنتشرة المعزولة من الدم المحيطي. وجد تحليل القلوب الساذجة من الحيوانات التي تعاني من نقص الخلايا البائية والضوابط المتزامنة أن الحيوانات التي تفتقر إلى الخلايا البائية لديها قلوب أصغر وجزء طرد أعلى6. تشير كل هذه الأدلة إلى أن الخلايا البائية قد تعدل نمو عضلة القلب و / أو وظيفة عضلة القلب ، وأنه ليس فقط الخلايا البينية ولكن أيضا الخلايا البائية داخل الأوعية الدموية يمكن أن تكون مسؤولة عن مثل هذه الملاحظات. كما تم العثور على الخلايا البائية لتعديل النمط الظاهري للبلاعم المقيمة في عضلة القلب8.

أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا البائية تلعب دورا مهما في سياق تكيف عضلة القلب مع الإصابة8،9،10،11،12،13. تتراكم الخلايا البائية بشكل عابر في القلب المصاب ، على الأرجح من خلال آلية تعتمد على CXCL13-CXCR511,13. من هناك ، تعزز الخلايا البائية إعادة تشكيل القلب المعاكس من خلال العديد من الآليات التي تشمل تجنيدالخلايا الوحيدة بوساطة السيتوكين 9,12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للخلايا البائية إنتاج أجسام مضادة ضد بروتينات القلب التي يمكن أن تعزز امتداد تلف القلب وإعادة تشكيل القلب الضار من خلال عدة آليات 14،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25 . يمكن للخلايا البائية أيضا أن تمارس تأثيرات وقائية على القلب المصاب من خلال إفراز IL-1010.

مع تزايد عدد المجموعات التي تبحث في دور الخلايا البائية في القلب الساذج والمصاب ، أصبح من المهم أكثر فأكثر تحديد البروتوكولات المشتركة لتحديد وتقييم الخلايا البائية لعضلة القلب بشكل صحيح وبالتالي تجنب التناقضات التي بدأت بالفعل في الظهور في الأدبيات. حتى الآن ، تم الإبلاغ عن أن الخلايا البائية هي واحدة من أكثر الخلايا المناعية انتشارا في قلب القوارض7 وأنها موجودة بمعدل انتشار أقل بشكل ملحوظ من الخلايا النخاعية 26,27 ، أو أن تكون نادرة جدا 28. وبالمثل ، وصفت عدة مجموعات أن عدد الخلايا البائية لعضلة القلب يزداد بعد إصابة عضلة القلب الإقفارية الحادة7،9،13 ، لكن مجموعة واحدة أبلغت عن عدم وجود تغييرات في عدد الخلايا البائية لعضلة القلبالمصابة 29. نادرا ما تقدم الدراسات التي أجريت على الخلايا المناعية القلبية تفاصيل عن حالات التروية ولا يوجد إجماع على ظروف الهضم. نظرا لأن نسبة كبيرة من الخلايا البائية في قلب القوارض تكون داخل الأوعية الدموية ويعتمد استخراج الخلايا المناعية من عضلة القلب بشكل كبير على طريقة الهضم المستخدمة ، فقد تكون الاختلافات المبلغ عنها في الأدبيات نتيجة للاختلافات في تروية الأعضاء وهضم الأنسجة.

تظهر هنا طريقة مفصلة للقياس الكمي القائم على قياس التدفق الخلوي للخلايا البائية لعضلة القلب في الفئران والتي تزيد من عائد استعادة الخلايا البائية من خلال تحسين ظروف التروية والهضم وتسمح بالتمييز بين الخلايا البائية داخل الأوعية الدموية مقابل الخلايا البائية لعضلة القلب خارج الأوعية الدموية6. هذا البروتوكول هو تكييف وتحسين البروتوكولات المماثلة الأخرى التي تميز بين الخلايا المناعية داخل الأوعية الدموية والخلالية28،30،31.

في هذا البروتوكول ، نقوم بتوحيد نضح عضلة القلب للقضاء على الخلايا البائية العائمة في الفضاء داخل الأوعية دون إزالة الخلايا البائية ذات الصلة بيولوجيا الملتصقة ببطانة الأوعية الدموية الدقيقة. علاوة على ذلك ، بناء على البروتوكولات السابقة التي وصفت استخدام الحقن الوريدي للأجسام المضادة لتمييز الخلايا المناعية داخل الأوعية الدموية عن الخلايا المناعية الخلالية32 ، والاستفادة من حقيقة أن الخلايا البائية تعبر عن العلامة السطحية B22033 ، نوضح كيفية التمييز بين الخلايا البائية داخل الأوعية الدموية مقابل خلايا عضلة القلب خارج الأوعية الدموية من خلال الحقن داخل الأوعية لجسم مضاد خاص ب B220 مباشرة قبل التضحية بالحيوانات والتروية القلبية. هذا البروتوكول ذو صلة بأبحاث أي عالم مهتم بما في ذلك تحليل الخلايا البائية لعضلة القلب في القلب الساذج والمصاب. سيؤدي التنفيذ الواسع النطاق لهذا البروتوكول إلى تقليل التناقضات بين المجموعات البحثية ، وسيسمح بتحليل التغييرات في تجمعات الخلايا البائية داخل الأوعية الدموية وخارج الأوعية الدموية ، وبالتالي سيعزز تقدم الاكتشافات في مجال مناعة القلب.

باختصار ، يمثل البروتوكول سير عمل محسنا لتحديد وتحليل الخلايا البائية لعضلة القلب عبر قياس التدفق الخلوي ، وفي نفس الوقت التمييز بين الخلايا الموجودة في الفضاء خارج الأوعية الدموية والفضاء داخل الأوعية الدموية.

Protocol

أجريت جميع التجارب الموصوفة في هذه المخطوطة بموافقة IACUC في كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز.

1. الاستعدادات

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية، كما هو موضح في الجدول 1.
  2. تأكد من وجود ما يكفي من CO2 للقتل الرحيم للحيوانات.
  3. قم بإعداد مساحة التشريح (ضع وسادة مقاعد البدلاء وضع الشريط وأدوات التشريح في مكان قريب).
  4. قم بتسمية الأنابيب سعة 15 مل ، وضع 3 مل من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم في كل أنبوب (انظر جدول المواد) وضعها على الثلج (أنبوب واحد لكل قلب وأنبوب إضافي للمجموعة المرجعية / عناصر التحكم في قياس التدفق الخلوي). أيضا ، املأ أطباق بتري الصغيرة (35 مم) ب HBSS.
  5. قم بتشغيل شاكر التحكم في درجة الحرارة ، واضبطه على 37 درجة مئوية ، وقم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  6. قم بإعداد مضخة المحقنة واضبط معدل التدفق على 3 مل / دقيقة. املأ حقنة سعة 20 مل ب HBSS ، وقم بتجهيز خط الأنبوب بمخزن مؤقت ، وقم بإزالة أي فقاعات.

2. تلطيخ الخلايا البائية داخل الأوعية الدموية (في الجسم الحي)

  1. تزن فأرا ذكرا يبلغ من العمر 12 أسبوعا من سلالة C57BL / 6J. قم بتحميل حقنة أنسولين 3/10 سم مكعب مع 100 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة B220 (1:10 ، في PBS). قم بتغطية المحقنة بورق الألمنيوم للحماية من الضوء.
  2. تخدير فأر واحد.
    1. يتم تطبيق حقنة داخل الصفاق بنسبة 2٪ 2،2،2-ثلاثي برومو إيثانول بجرعة 400 ملغ/كغ وانتظر 10-20 دقيقة.
      ملاحظة: راقب تنفس الماوس وحركته. بمجرد توقف الماوس عن الحركة ، قم بتحفيز الألم عن طريق قرص إصبع القدم ؛ يشير عدم وجود رد فعل انسحابي إلى تخدير كاف.
    2. إذا لم يتم تحقيق التخدير الكافي خلال 20 دقيقة ، يمكن إعطاء جرعة إضافية من المخدر عند 100 ملغ / كغ ، ويجب إجراء تقييم لحركية الفئران ، ومنعكس الانسحاب ، والتنفس كل 5 دقائق.
  3. ضع الماوس على مقعد المختبر على وسادة مقعد مائلة نحو جانب واحد ، واسحب جلد الظهر برفق لأسفل ، واضغط قليلا على الجسم على المقعد لجعل العين تبرز.
  4. حقن الجسم المضاد B220 المخفف من الخطوة 2.1 عن طريق الحقن خلف الحجاج.
    1. أدخل المحقنة في العين عند 45 درجة من المستوى السهمي لرأس الماوس. حقن الحل ببطء. إذا شعرت بالمقاومة ، فقم بإزالة المحقنة وأدخل مرة أخرى. انتظر لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: من شأن وقت الحضانة المطول أن يعرض للخطر القدرة على التمييز بين الخلايا البائية داخل الأوعية الدموية مقابل الخلايا البائية خارج الأوعية الدموية لأنه سيعطي الوقت للجسم المضاد المحقون للانتشار خارج الأوعية الدموية.
  5. القتل الرحيم للماوس وفقا للوائح IACUC.
    1. افتح تدفق CO2 إلى غرفة القتل الرحيم بمعدل 0.5 لتر / دقيقة ، أو معدل التدفق الموصى به بناء على حجم غرفتك.
    2. ضع الماوس في الحجرة للوقت الموصى به ، وتأكد من أنه لم يعد يتنفس. إزالته وإجراء خلع عنق الرحم كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم.
    3. بمجرد القتل الرحيم للفأر ، انتقل على الفور إلى حصاد الأعضاء والتروية.

3. جمع القلب

  1. فتح الصدر.
    1. امسك جلد الفأر بالملقط في منطقة شرسوفي. قم بعمل فتحة 2 مم في الجلد باستخدام المقص واستخدم الملقط لتقشير الجلد بعيدا للكشف عن طبقة اللفافة ، وهي طبقة شفافة لامعة ، من الصدر والبطن. قطع في الشرسوفي من خلال اللفافة والبريتوني لفتح جدار البطن والكشف عن عملية الخنجري. المشبك عملية الخنجري باستخدام ملقط مرقئ.
    2. باستخدام المقص ، قم بعمل قطع عمودي عبر جدار الصدر على مستوى خط منتصف الترقوة على كل جانب وارفع جدار الصدر الأمامي للكشف عن محتوى المنصف ، باستخدام ملقط مرقئ كوزن للحفاظ على الفتحة.
  2. تروية القلب واستخراجه.
    1. باستخدام الملقط ، قم بإزالة أي دهون أو أنسجة الغدة الصعترية المحيطة بالقلب.
    2. أمسك الشريان الأورطي بإحكام من الخلف باستخدام الملقط. أدخل إبرة المحقنة (25 جم) في قمة القلب. بيرفيوز مع 3 مل من HBSS بمعدل 3 مل / دقيقة.
      ملاحظة: مراقبة التروية. يجب أن يملأ الكبد ، ويجب إزالة الدم في الأوعية التاجية بالكامل. يوصى باستخدام مضخة حقنة معايرة إلى 1 مل / دقيقة للحفاظ على تدفق ثابت.
    3. قطع الشريان الأورطي باستخدام مقص وإخراج القلب. اغسل القلب في طبق بتري باستخدام HBSS لإزالة أي دم متبقي. باستخدام المقص والملقط ، قم بإزالة الدهون والنسيج الضام والغدة الصعترية وتجفيف القلب. وزن القلب المعزول ولاحظ الوزن بالملليغرام. فرم القلب في درجة حرارة الغرفة إلى قطع صغيرة (1-2 مم) بشفرة.
      ملاحظة: قد تزن قلوب الفئران البالغة بين 0.090-0.210 ملغ.
    4. قم بقياس كتلة أنسجة القلب وضع 60 مجم من القلب المفروم ليتم هضمه في أنبوب سعة 15 مل مع 3 مل من HBSS. الاحتفاظ بأنسجة القلب المتبقية ووضعها في أنبوب يسمى "أنسجة التحكم المرجعية" ؛ سيتم استخدام هذا للتحكم في التعويض عن إشارة الأحياء الميتين والتألق الذاتي.

4. هضم القلب وتلطيخ الخلايا

  1. أضف إنزيمات إلى كل أنبوب يحتوي على منديل مفروم (انظر الجدول 1). أضف 0.5 ميكرولتر / ملغ من DNase 1 (300 وحدة ل 60 ملغ من أنسجة القلب) ، 0.5 ميكرولتر / ملغ من كولاجيناز II (625 وحدة ل 60 ملغ من أنسجة القلب) ، و 0.2 ميكرولتر / ملغ من الهيالورونيداز (50 وحدة لكل 60 ملغ من أنسجة القلب) إلى الأنبوب.
  2. ضع تفاعل الهضم في الخلاط لمدة 30 دقيقة عند 300 دورة في الدقيقة. اضبط رف الخلط على حوالي 25 درجة من الانحدار.
  3. أضف 7 مل من HBSS إلى كل من أنابيب التفاعل سعة 15 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية مع ضبط التسارع والكسر على معتدل أو بطيء. صب المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 5 مل من محلول تحلل ACK لإزالة خلايا الدم الحمراء. احتضان في مخزن تحلل ACK لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. أضف 10 مل من PBS إلى كل أنبوب ، واخلطه ، ثم قم بالتصفية في أنبوب سعة 50 مل بمصفاة 40 ميكرومتر. تأكد من أن جميع الحطام داخل غرفة المرشح. حطم أي حطام على المرشح باستخدام مكبس حقنة حتى يتم تعليقه بالكامل داخل حجرة المرشح.
  5. أضف PBS من خلال المرشح حتى يصل الحجم إلى 25 مل لكل قلب ؛ سيسمح ذلك للخلايا المعلقة بالمرور عبر الفلتر. أضف 25 مل إضافية من PBS إلى أنبوب أنسجة التحكم المرجعي وقسم الحجم إلى أنابيب مختلفة (25 مل لكل منهما). قم بتسمية أحد الأنابيب "غير ملوث" والآخر على أنه "ميت حي". جهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، قم بإعداد التخفيف للبقعة الحية الميتة (التخفيف: 1: 500 في 1x PBS).
  6. صب الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات في الأنبوب غير الملوث في 100 ميكرولتر من PBS وكل من الكريات الأخرى في 100 ميكرولتر من تخفيف البقع الحية الميتة. احتضان الثلج لمدة 30 دقيقة في الظلام ، وقم بتغطية دلو الثلج بورق الألمنيوم.
  7. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام FACS إلى كل عينة وانقلها إلى أنبوب FACS المسمى من خلال مرشح 40 ميكرومتر. أجهزة الطرد المركزي لأنابيب FACS عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  8. أضف 50 ميكرولتر من محلول حجب Fc (انظر الجدول 1) إلى كل أنبوب ، باستثناء الأنابيب غير الملوثة والميتة الحية. تخلط وتحتضن لمدة 5 دقائق.
  9. أضف 50 ميكرولتر من محلول مزيج الأجسام المضادة (انظر الجدول 1) إلى كل أنبوب ، باستثناء الأنابيب غير الملوثة والميتة الحية ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في الظلام ، مع تغطية دلو الثلج بورق الألمنيوم.
  10. أضف 2 مل من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب وأجهزة طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 300-500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.

5. قياس التدفق الخلوي

  1. إعداد إعدادات التحكم في الأداة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول يتم تحليل العينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي Cytek Aurora 4 ليزر. يمكن استخدام مقياس تدفق خلوي مناسب آخر للكشف عن علامات الاهتمام.
    1. افتح برنامج التحكم في الجهاز (انظر جدول المواد). في الجزء العلوي من النافذة ، حدد علامة التبويب الاستحواذ وانقر فوق جديد +. سيتم عرض نافذة تسمى إنشاء تجربة جديدة .
    2. في قسم المكتبة، في الحقل اكتب للتصفية، اكتب PE وPerCP-Cy5.5 وBV421 وAlexa Fluor 700 وZombie Aqua، وانقر فوق إضافة بعد كتابة كل منها. يجب رؤية أسماء الفلوروفور إلى اليمين. ثم اضغط التالى للمتابعة إلى علامة التبويب مجموعة .
    3. في علامة التبويب مجموعة ، انقر فوق الرمز الذي يحتوي على أنبوب لإضافة القلب للتحليل.
    4. انقر فوق + مجموعة مرجعية وسيتم عرض نافذة. في عمود علامة الفلورسنت، حدد Zombie Aqua، وفي عمود نوع عنصر التحكم، حدد الخلايا، ثم انقر على حفظ.
    5. انقر التالى > علامات التبويب؛ سيتم عرض جدول بأسماء الفلوروفور. اكتب علامة الخلية المقابلة في الصف الأول من كل عمود فلوروفور واكتب Enter: CD45 ل PerCP-Cy5.5 ؛ CD19 ل BV421 ؛ CD11b لأليكسا فلور 700 ؛ B220 ل PE ؛ والموتى الأحياء لزومبي أكوا.
    6. انقر فوق التالي مرتين للانتقال إلى علامة التبويب اكتساب . في الأحداث المراد تسجيلها من نوع مجموعة التجربة 10,000,000، وفي نفس الحقل لسطر المجموعة المرجعية اكتب 200,000. انقر فوق حفظ وفتح. يجب أن تظل الإعدادات الأخرى كإعداد افتراضي ، ووقت التوقف إلى 10000 ، وإيقاف الصوت إلى 3000.
    7. في الجزء السفلي الأيسر انقر فوق التحكم في الأداة. اضبط الجهد على FSC-50 ، SSC-175 ، SSC-B-175. ثم حدد عنصر التحكم في الاستحواذ. بالنسبة لخيار معدل التدفق ، حدد مرتفع من القائمة المنسدلة.
  2. الحصول على عينات مرجعية باستخدام مقياس خلوي وفك المزج في البرنامج.
    1. دوامة أنبوب القلب غير الملوث ووضعه بإحكام على منفذ حقن العينة (SIP). تأكد من أن سهم المؤشر الأخضر يشير إلى العينة الصحيحة ، ثم انقر فوق ابدأ في لوحة التحكم في الاستحواذ الخاصة ببرنامج مقياس الخلايا وانتظر حتى يتم تسجيل الأحداث. افعل الشيء نفسه مع أنسجة القلب الملطخة بالموتى الحي.
    2. حدد قائمة Unmix وقم بتعيين عناصر التحكم التالية:
      1. حدد خانات الاختيار الخاصة ب PE و PerCP-Cy5.5 و BV421 و Alexa Fluor 700 في العمود من المكتبة. تأكد من إلغاء تحديد Zombie Aqua في نفس العمود. في الجزء السفلي ، حدد خيار التألق التلقائي كعلامة فلورسنت.
      2. انقر فوق التالي للمتابعة إلى علامة التبويب تحديد السكان الإيجابيين / السلبيين . في علامة التبويب هذه ، سيتم عرض مخطط FSC-A مقابل SSC-B-A. انقر واسحب نقاط المضلع لتحديد مساحة بين 1.0 م و 4.0 م على محور FSC-A، وبين 0.2 م و 3.0 م على محور SSC-B-A.
      3. في المخطط التالي إلى اليمين ، سيتم عرض V5-A على المحور X. حرك البوابات لتحديد نصف القمة في أقصى اليمين على أنها موجبة ومنطقة على الجانب الأيسر من المخطط على أنها سلبية. في المؤامرة بعنوان المجموعة المرجعية - غير ملوثة ، حدد مجموعة سكانية في نطاق مماثل. لهذا يجب تعيين غير ملوث لا إيجابي سلبي.
  3. الحصول على عينات تجريبية.
    1. لكل أنبوب يحتوي على عينة لفأر فردي ، دوامة الأنبوب ووضعه بشكل آمن على SIP. تأكد من أن سهم المؤشر الأخضر يشير إلى العينة الصحيحة ، ثم انقر فوق ابدأ في لوحة التحكم في الاستحواذ الخاصة ببرنامج مقياس الخلايا ، وانتظر حتى يتم تسجيل الأحداث.
  4. استراتيجية البوابة.
    1. حدد علامة التبويب ورقة العمل الافتراضية غير المختلطة . قم بإنشاء مخطط FSC-A مقابل SSC-A باستخدام أداة الرسم النقطي في الأعلى. حدد أحداث أعلى من 0.4 م على محور FSC-A وأعلى من 0.8 م على محور SSC-A باستخدام أداة تحديد المضلع. انقر نقرا مزدوجا في هذا التحديد وسيتم عرض مؤامرة جديدة.
    2. من المخطط الذي تم إنشاؤه حديثا ، انقر بزر الماوس الأيمن على ملصق المحور X وحدد AF-A ؛ انقر بزر الماوس الأيمن على ملصق المحور Y وحدد صبغة حية ميتة. انقر فوق أداة تحديد المستطيل في الأعلى وحدد جميع الأحداث أدناه 105 على محور الأحياء والموتى التي تتوافق مع الإشارة السفلية للأحياء والموتى. انقر نقرا مزدوجا في هذا التحديد وسيتم عرض مؤامرة جديدة.
    3. في المخطط الجديد ، انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد PerCP-Cy5.5-A للمحور X و SSC-A للمحور Y. باستخدام أداة تحديد المستطيل، حدد الأحداث الأعلى من 104 على محور PerCP-Cy5.5-A التي تتوافق مع الخلايا الموجبة CD45. انقر نقرا مزدوجا فوق التحديد وسيتم عرض قطعة أرض جديدة.
    4. في المؤامرة الجديدة ، انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد FSC-A للمحور X و FSC-H للمحور Y. باستخدام أداة تحديد المضلع ، حدد الأحداث التي تتبع اتجاها تتشابه فيه قيمة FSC-A وقيمة SSC-A ؛ مع هذا ستتم إزالة مضاعفة الخلية وسيشار إلى السكان في التحديد باسم مجتمع CD45 +. انقر نقرا مزدوجا فوق التحديد لعرض قطعة أرض جديدة مع سكان CD45 +.
    5. من مخطط السكان CD45 + ، انقر بزر الماوس الأيمن لتحديد BV421 على المحور X مقابل SSC-A على المحور Y. باستخدام أداة تحديد المضلع، حدد المحتوى الموجود على اليمين على محور BV421 . هذا هو عدد الخلايا البائية. انقر نقرا مزدوجا مرتين في هذه المجموعة لإنشاء مخططين جديدين مع مجتمع الخلايا البائية.
      1. انقر بزر الماوس الأيمن لإعداد مخطط الخلية B الأول مع PE-A على المحور X و BV421-A على المحور Y. المجتمع الإحصائي الموجود على اليمين يناظر الخلايا البائية داخل الأوعية الدموية، ويمثل المجتمع الإحصائي الموجود على اليسار الخلايا البائية البينية. استخدم أداة تحديد المضلع لتحديد كليهما.
      2. انقر بزر الماوس الأيمن لإعداد مخطط الخلية B الثاني باستخدام Alexa Fluor 700-A على المحور X و SSC-A على المحور Y. يتوافق المجتمع الموجود على اليسار مع خلايا CD11b ، وتتوافق الأحداث الموجودة على اليمين (إن وجدت) مع خلايا CD11b +.
      3. انقر بزر الماوس الأيمن فوق كل تحديد ثم انقر فوق خصائص البوابة. انقر فوق Count و ٪ Parent لعرض الأحجام والنسب المئوية. سجل عدد الأحداث والنسب المئوية لمزيد من تحليل البيانات.

النتائج

بمجرد اكتمال الاستحواذ وجمع جميع الأحداث ، يجب تحليل البيانات وفقا لممارسة قياس التدفق الخلوي القياسية. سيختلف تركيز التحليل اعتمادا على الهدف الفردي لكل تجربة. في هذه الحالة ، تم متابعة القياس الكمي للخلايا البائية داخل الأوعية الدموية وخارجها ، وتم التعبير عنها بعدد الخلايا لكل ملغ من ...

Discussion

تشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن الخلايا البائية تلعب دورا مهما في سياق فسيولوجيا عضلة القلب وإعادة تشكيل / التكيف مع الإصابة7،8،9،10،11،12،13،36....

Disclosures

لويجي أدامو هو المؤسس المشارك لشركة i-Cordis، LLC ، وهي شركة تركز على تطوير جزيئات مناعية لعلاج قصور القلب ، مع اهتمام خاص بمشتقات عقار بيرفينيدون المعدل للخلايا البائية. أما المؤلفون الباقون فليس لديهم أي تعارض يعلنونه.

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسة من خلال منح NHLBI 5K08HLO145108-03 و 1R01HL160716-01 الممنوحة لويجي أدامو.

تم تمويل مقياس التدفق الخلوي Aurora المستخدم لتطوير هذه الدراسة من قبل NIH Grant S10OD026859. نحن نعترف بدعم JHU Ross Flow Cytometry Core.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody101222BioLegend100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, BlueQBIAP303Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1605-0000SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP114-055-101Quality Biological0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1615-5500SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips11213810USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips11267810USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430052Corning
1-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT951ECT Manufacturing
2,2,2-TribromoethanolT48402Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips11208810USA Scientific
3-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT953ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style352054Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430290Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer118-156-101Quality BiologicalOsmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-635810759005Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-6222638289Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-6222638246Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007UPC 109153Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber - MouseRWD-AICMV-100Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL309626BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-PackCMD 2613Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody115537BioLegend50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterileT9009Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940 CD USPEAirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mLUX-34502-46Cole-Parmer
Collagenase 2LS004176Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barbY992611-AGAirGas USA
Cytek Aurora Flow CytometerCytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CPM-08-12AirGas USA
DNase I - 40,000 UD4527Sigma-Aldrich
Easypet 3 - Electronic Pipette Controller4430000018Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E30100606Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge5810REppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettesEppendorf
FlowJo 10.8.1BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)Z740287Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076gibco1x
HyaluronidaseH3506Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight13018-14Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL302831BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940M1-940-PGAirGas USA
McKesson Underpads, Moderate4033-CS150McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable BalanceNV2201Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]10010023gibco1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody103208BioLegend200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody103132BioLegend100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile PolystyreneFB0875711YZFisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02M08-1AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck IlluminatorLED-6WAmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)305122BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)553141BD Becton, Dickinson and Company Biosciences0.5 mg/mL
R 4.1.1The R Foundation
Razor Blades9501250000Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inletY12244A320-AGAirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular bucketsRotor A-4-62Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister86.1254.001Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tapeL8394Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EAMTLL230-6005Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' LongCG-730-003Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mLZ683566Millipore Sigma
Syringe pump55-1199 (95-240)Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM105009371W13Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119835Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119827Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.T8913 (Millipore Sigma)Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2SI-0236Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips89259-946Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"82027-578Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I12620-946Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit423102BioLegend

References

  1. Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
  2. Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
  3. Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
  4. Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
  5. Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
  6. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
  7. Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
  8. Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
  9. Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
  10. Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
  11. Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
  12. Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
  13. Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
  14. Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
  15. Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
  16. Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
  17. Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
  18. Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).
  19. Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
  20. Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
  21. Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
  22. Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
  23. Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
  24. Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
  25. Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
  26. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  27. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  28. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  29. Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
  30. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  31. Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
  32. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  33. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  34. Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
  35. Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
  36. Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
  37. Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved